>[0143] 步骤al. 2-沉淀：将有机溶剂加入到步骤al. 1的悬浮液中，并将运个混合物在 4°C保持15分钟。所述有机溶剂是丙酬或乙醇。W每65份（体积）水性溶剂35份（体 积）的量加入丙酬。W每55份（体积）水性溶剂45份（体积）的量加入乙醇。
[0144] 步骤a2-分离：离屯、混合物（10分钟，4°C，约ll，000g)W将上清液从小团分离，所 述小团包含膜腺酶。将小团重新悬浮在起始水性溶剂中（在重新悬浮、分离之后的小团中 的LA)。
[0145] 分析不同步骤的材料。在整个过程中检测膜脂肪酶的量，将其表示为脂肪酶活 性：
[0146] -在步骤al. 1的悬浮液中（悬浮液中的LA;LA-Sal. 1);
[0147] -在步骤曰2获得的上清液中（在分离SN中的LA，LA-SN);
[0148] -在步骤曰2获得的并随后重新悬浮在起始介质的小团中（在沉淀小团中的LA， LA-P)〇
[0149] 在表7、8和9中报告结果。
[0150] 表 7
[0151]
[0152] la=脂肪酶活性（IUUS巧；A=丙酬。E=乙醇；S=悬浮液；SN=上清液；P=小 团。
[0153] 沉淀后的回收高，使用两步法几乎达到完全回收。
[0154] 表 8
[0155]
[0156] la=脂肪酶活性（IUUS巧；A=丙酬。E=乙醇；S=悬浮液；SN=上清液；P=小 团；Theor.=理论。
[0157]总方法产量在从73. 1到84. 5的范围，高于使用多步法获得的。产量％是在步骤 曰2的小团和上清液中的总脂肪酶活性相对在步骤al. 1中使用的膜脂肪酶的理论脂肪酶 活性，所述理论脂肪酶活性是通过包括起始材料的比活性（即如根据药典USP方法确定的 94.4IUUSP/mg)及其初始重量的因素计算的。
[015引表9
[0159]
[0160]LSA=脂肪酶比活性（IUUSP/mg);A=丙酬。E=乙醇；SN=上清液；EF=富集 系数=在步骤曰2的小团中的LSA(IUUSP/mg)/在步骤al. 1中的理论脂肪酶活性（IUUSP/ mg)。
[016。 结果显示，在两步法中使用抑=7的水性缓冲剂和丙酬提供有益的产量（总方法 产量约76% )且富集系数在从2. 1到4. 2的范围。
[016引实施例4HA-膜酶的制备；0.Ig/血巧步：悬浮、沉淀；扩大规模（SP=38巧酬： 水性溶剂=35 :65)
[0163] 步骤al. 1-悬浮：在4°C将6. 5g起始膜脂肪酶化1，400U脂肪酶）分散在45血的 抑=7. 0的缓冲溶液中（lOmM憐酸盐缓冲剂），并每循环揽拌扣Itra化rrax，3个循环）1 分钟，将揽拌器用lOmL冷缓冲剂洗涂两次W回收剩余的膜脂肪酶。
[0164] 步骤al. 2-沉淀：将35mL丙酬加入到步骤al. 1的悬浮液中，并将运个混合物W静 止状态在4 °C保持30分钟。
[0165] 步骤a2-分离：离屯、混合物（15分钟，4°C，约2, 700g)W将上清液从小团分离，所 述小团包含膜腺酶。
[0166] 步骤a3-干燥：根据两种不同方案干燥小团，干燥后的小团的平均重量是1. 55邑， 脂肪酶活性（LA)是365,000IU脂肪酶，且比活性化SA)是235IUUSP/mg。
[0167] 表10报告了对使用两种方案获得的每种材料测量的脂肪酶化)、蛋白酶（巧及淀 粉酶（A)比活性。还在干燥处理前测量在小团中的脂肪酶活性（在将其悬浮在ImL缓冲剂 之后测量）。其等于233. 7IUUSP/mg。
[0168]表10
[0169]
[0170] LSA=脂肪酶比活性（lU USP/mg) ;PSA=蛋白酶比活性（lU USP/mg) ;ASA=淀粉 酶比活性（lU USP/mg)。
[0171] 分析显示，干燥过程自身不影响LSA且不同方案得到具有相同的酶活性的材料。 如在先实施例那样计算的富集系数也总是大于2,且在不同的方案之间恒定，其为：2.5(样 品18)、2. 7 (样品19)、2. 3 (样品10)，平均值为2. 5。在干燥处理前测量的小团中的脂肪酶 活性，等于 233. 7IUUSP/mg(样品 18)。
[017引表11
[0173]
[0174] L =脂肪酶；P =蛋白酶；A =淀粉酶；A =活性；Y =产量（％) ;W=干燥后测量的 重量（g)。
[0175] 使用不同方案获得的样品的HPLC曲线是可叠加的。没有观察到起始材料的HPLC 曲线的相关定性差异。
[017引实施例5HA-膜酶的制备；0.Ig/mL;两步：悬浮、沉淀；扩大规模（SP= 38 :乙醇： 水性溶剂（pH= 7) = 45 :55,样品21) ;(SP= 34 :丙酬：水性溶剂（pH= 7) = 50 :50样品 22) ;(SP= 35:丙酬：水性溶剂（pH= 7) = 45 :55,样品23)。运里对不同的起始膜脂肪酶 量、不同的缓冲溶液体积和不同的丙酬体积（HS= 34或35)或乙醇体积（HS= 38)实行实 施例4的制备过程。干燥方案为24小时，6-8°C，0.2mbar，所有其它参数和条件与实施例4 相同。
[0177]表 12[017引
阳179]在表13和14中报告结果。
[0180]表 13
[0181]
[0182]LSA=脂肪酶比活性（IUUSP/mg);PSA=蛋白酶比活性（IUUSP/mg);ASA=淀粉 酶比活性（IUUSP/mg)。
[0183] 数据显示，干燥过程自身不影响LA且不同方案得到具有相同的酶活性的材料。如 在先实施例中的那样计算的富集系数是：1. 6 (样品21)、1. 3 (样品22)、1. 7 (样品23)。
[0184] 表14显示使用在此施加的扩大规模的方法获得的最终的纯化的材料的酶活性W 及酶产量。
[0185]
[0186] L=脂肪酶；P=蛋白酶；A=淀粉酶；A=活性；Y=产量（％ );W=干燥后测量的 重量（g)。
[0187] 使用不同冻干方案获得的样品的HPLC曲线是可叠加的。没有观察到起始材料的 HPLC曲线的相关定性差异。
[0188] 使用不同方案获得的样品25和26表现出比使用方案化S= 38)生产的样品24 更低的比LA和更高的PA和AA。
[0189]连施俩I6HA-膜酶的制备；0. 065和0.Ig/mL;单步；实验室规模（SP= 38-丙酬： 水性溶剂=35 :65)
[0190] 步骤al-悬浮-沉淀：在4°C在揽拌下将650mg(样品24)或lOOOmg(样品25)的 天然膜脂肪酶分散在lOmL的65 :35的缓冲剂（pH= 710mM憐酸盐）和丙酬的混合物化5 体积的缓冲剂和35体积的丙酬）中30分钟。
[01川步骤a2-分离：离屯、步骤al的混合物（10分钟，4°C，10,OOOg)W将上清液从小团 分离，所述小团包含膜腺酶。
[0192] 步骤曰3)-干燥：使用高效累在0.2mbar干燥小团。
[0193] 分析材料。在整个过程中测量膜脂肪酶的量，表示为脂肪酶活性：
[0194] -在步骤曰2获得的上清液中（在分离SN中的LA，LA-SN);
[0195] -在步骤a2获得的并随后重新悬浮在起始介质的小团中（在沉淀小团中的LA， LA-P)；
[0196]-悬浮-沉淀步骤al的LA(悬浮液中的LA ;LA-SN)表示为理论值。
[0197] 在表15和16中报告结果。
[0198] 表 15
[0199]
[0200] la=脂肪酶活性（IUUS巧；A=丙酬；E=乙醇；S=悬浮液；SN=上清液；P=小 团；Theor.=理论。
[0201] 表 16
[0202]
[020引 la=脂肪酶活性；A=丙酬。E=乙醇；SN=上清液邸二富集系数=在步骤曰2 的小团中的LSA(IUUSP/mg)/在步骤al中的理论脂肪酶活性（IUUSP/mg)。
[0204] 单步法提供良好的产量和比两步法更高的增强系数。运对于工业化是有意义的， 因其实行的简单和直接。
[020引连施俩I7HA膜酶的制备；0.Ig/血；单步；小型规模（SP= 38-丙酬冰性溶剂= 35 :65)。
[0206] 步骤al-悬浮-沉淀：在4°C在揽拌下将lOg天然膜脂肪酶分散在100血的缓冲 剂（pH= 7,lOmM憐酸盐）和丙酬的溶剂混合物（65体积的缓冲剂和35体积的丙酬）中60 分钟。
[0207]步骤a2-分离：离屯、步骤al的混合物（10分钟，4°C，2, 700g)W将上清液从小团 分离，所述小团包含膜腺酶。
[020引步骤a3-干燥，将样品26中的小团倒入培养皿中，而将样品28和29的小团保留 在离屯、管中并使用高效累在0. 2mbar直接干燥。
[0209] 分析材料。在整个方法中测量W下中的膜脂肪酶的量，表示为脂肪酶活性：
[0210] -在步骤曰2获得的上清液中（在分离SN中的LA，LA-SN);
[0211] -在步骤曰2获得的并随后重新悬浮在起始介质的小团中（在分离小团中的LA， LA-P)；
[0212] -悬浮-沉淀步骤al的LA(悬浮液中的LA;LA-SN)表示为理论值。
[0213] 在表17和18中报告结果。
[0214]表 17 [021 引
惦1引在脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性方面获得了良好的再现性。
[0217]表 18 [021 引
[0219] L=脂肪酶；P=蛋白酶；A=淀粉酶；A=活性；Y=产量（％ );W=干燥后测量的 重量（g)。
[0220] 获得了非常高的脂肪酶产量，富集系数也是高的（高于2):其是：2.2(样品26)、 2. 4 (样品 27)、2.3 (样品 28)。
[0221] 单步法提供良好产量。获得了4.2gr HA-膜酶（起始膜脂肪酶的42%)，脂肪酶 的总单位是940, 000IU USP(初始LA的99-100%)。获得的HA-膜酶具有221IU USP/mg 的比活性。
[022引连施例8HA-膜酶的制备；0.Ig/mL;多步：悬浮、沉淀、分离；比较性实施例（SP= 38-丙酬：水=35 :65)。
[022引步骤al. 1-悬浮：在4°C在揽拌下将膜脂肪酶W0. 045mg/血的浓度（样品29)分 散在水性溶剂（蒸馈水）中约30分钟。
[0224] 步骤al. 2-沉淀：将80血的溶剂混合物（丙酬：水=35 :侣）加入到20血步骤 al. 1的悬浮液中（W获得SP= 38(Mpa)°'5的最终溶剂混合物）；将混合物在静止状态下在 25°C保持60分钟。
[0225] 步骤a2-分离：离屯、混合物（10分钟，3,000g，25°C)W从上清液分离小团，所述小 团包含膜腺酶。
[0226] 分析不同步骤的材料。在整个过程中检测膜脂肪酶的量，表示为脂肪酶活性：
[0227]-在步骤al. 1的悬浮液中（悬浮液中的LA;LA-Sal. 1);
[022引-在步骤曰2获得的上清液中（在沉淀SN中的LA，LA-SN);
[0229]-在步骤a2获得的并随后重新悬浮在起始蒸馈水的小团中（在沉淀小团中的LA， LA-P)〇
[0230] 在表19-20中报告结果。为了直接比较的目的，在此处报告在之前的实施例中使 用两步和单步方法获得的结果。
[0231]表19
[0232]
[0233]