为了确定阿维菌素类似物在脂质代谢上的功能是通过直接祀向FXR信号通路，使 用喂食高脂肪饲料的野生型小鼠和FXR基因敲除小鼠来研究运些阿维菌素类似物的生理效 应的F邸依赖性。如图7A-7H所示，溶媒对照的无 F邸小鼠的肝脏切片显示出比溶媒对照的野 生型小鼠的更大的脂滴及更大量的脂质积累。与野生型小鼠中的溶媒对照相比，用伊维菌 素、阿己克下或多拉克下的治疗显著地降低了脂质的量。在用运些化合物分别治疗的无 FXR 小鼠中，几乎没有观察到区别，证明了FXR是运些化合物降低小鼠肝脏汇总的脂质积累所必 需的。化学试剂盒检测的数据证明运些化合物显著地降低了野生型小鼠中的甘油=醋水 平，但是没有降低无 FXR小鼠中的甘油S醋水平，即使无 FXR小鼠中的甘油S醋水平远高于 野生型小鼠中的甘油S醋水平（图8A)。用全部S种化合物的治疗W依赖于FXR的方式降低 了小鼠的血清甘油S醋水平（图8B)。与伊维菌素类似，多拉克下或阿己克下的治疗W依赖 于F邸的方式降低了血清胆固醇和葡萄糖水平（图8C和17)。运些结果证明，阿维菌素类似物 调节包括脂质、胆固醇和葡萄糖代谢的代谢的治疗效果是依赖于核受体FXR的。
[0151] 来自阿维菌素类似物的F邸配体是能够诱导FXR聚集辅抑制子NCoR-2的部分激动 剂
[0152] 核受体配体的生理和药理作用通过核受体辅调控子的区别聚集（differential recruitment)来调控，其转而引起下游核受体祀基因的调控。除了辅激活子向FXR的聚集之 夕h来自抗寄生虫药阿维菌素类似物的FXR配体展示出一些与传统激动剂不同的特性。伊维 菌素诱导FXRW竞争性地聚集辅抑制子多肤NCoR-2与生物素标记的辅激活子多肤SRC1-2。 作为传统的全激动剂，GW4064未能诱导NCoR-2向FXR的任何聚集（图9A)。除了向FXR聚集辅 激活子之外（图10和11A-11C)，伊维菌素、多拉克下或阿己克下也在Al地aScreen检测中诱 导FXRW聚集辅抑制子多肤NCoR-2(图9A和9B)，其证明了除了它们的弱转录活性之外，它们 表征为部分激动剂。相对地，依立诺克下或莫昔克下未能诱导NCoR-2向F邸的任何聚集，与 它们和伊维菌素、多拉克下和阿己克下相比的其他区别一致。
[0153] 区分阿维菌素类似物与FXR相互作用的结构基础
[0154] 如图10所示，阿己克下和伊维菌素之间的分子结构的唯一区别是在C22-C23分别 为双键和单键。多拉克下在Rl基团为环己烷基团，从而区别于阿己克下。依立诺克下在R2基 团为乙酷胺基团，从而区别于阿己克下。伊维菌素主要通过与亲脂性的氨基酸残基的疏水 作用W及与Arg264主链上的幾基氧和Asn283侧链上的酷胺幾基氧相对应的两个氨键相互 作用错接于FXR的配体结合域化抓）（图12A)。从图1IA-11C和13A-13B中的结构对接模型，与 伊维菌素的结合比较，阿己克下(阿维菌素)在C22-C33的双键不影响其与FXR的结合。多拉 克下在Rl的环己烷基团位于配体结合口袋的宽敞的中屯、，并且它与伊维菌素中的一样也是 疏水基团，不影响其与FXR的结合。对于依立诺克下，尽管依立诺克下的主要部分在配体结 合口袋总匹配良好，但是替代的乙酷胺基团具有几个对其在疏水性配体结合口袋中结合不 利的影响。它增加了配体的极性，并且依立诺克下的乙酷胺基团与Asn293和Arg264的侧链 干设，或者甚至与整个螺旋3和在螺旋1和螺旋2之间的环干设。它也破坏与主链上的Arg264 的酷胺幾基氧的氨键相互作用。关于莫昔克下，大体积的杂环基团的丢失导致了疏水作用 的不足，使其难W在疏水口袋中配合良好。
[0155] 为了验证口袋残基在大环内醋结合与FXR激活中的作用，使几个与多拉克下和阿 己克下的不同基团接触的关键F邸残基产生了突变。检测了运些突变的F邸在使用全长度的 FXR和EcRE报告因子的基于细胞的报告因子检测中的响应于化合物的转录活性。如图15A和 15D所示，A291W突变体减小了对于阿维菌素的长链杂环基团的F邸口袋的尺寸，从而阻止了 运些大体积的阿维菌素配体的结合。如同预期，此突变体完全破坏了 FXR通过多拉克下、阿 己克下和伊维菌素的转录活性。R331M突变体通过将对应的极性精氨酸的残基置换为非极 性的蛋氨酸残基，应该加强疏水作用。因此，此突变体提高了被阿维菌素配体激活的能力 (图15B和15D)。对于H447F突变体，具有咪挫基团侧链的组氨酸的对应残基被具有苯环侧链 的非极性的苯丙氨酸替换。同样地，此突变体由于疏水作用的巩固，提高了响应于多拉克下 和阿己克下的FXR活性（图15C和15D)。
[0156] 总而言之，诱变分析在不同的阿维菌素和莫昔克下对FXR的激活上显示了截然不 同的结果，突出显示了 FXR在识别不同的大环内醋中的结构基础。
[0157] 讨论
[0158] 阿维菌素在全球市场中是主要的抗寄生虫药。由于其优秀的效能和巨大的市场需 求，基于阿维菌素半合成了一系列类似物。与阿维菌素化学上相关的米尔贝霉素，是一组半 衰期比阿维菌素长的大环内醋。运些抗寄生虫药共同具有类似的作用机理，即通过增强谷 氨酸盐在无脊椎动物特异的谷氨酸口控氯离子通道的效果，W及与丫-氨基下酸(GABA)受 体结合，阻断寄生虫的神经系统，导致寄生虫死亡。与在线虫的肌肉神经接点和中央腹神经 索中的分布不同，GABA受体主要存在于哺乳动物的大脑中。阿维菌素和米尔贝霉素 W治疗 剂量，在哺乳动物中不能穿过血脑屏障，从而保证了它们在哺乳动物中的使用的安全性。
[0159] 通过与核受体FXR结合，伊维菌素的治疗降低了糖尿病小鼠中的血清葡萄糖和胆 固醇水平。由于阿维菌素类似物具有与伊维菌素接近的结构关系，并且在各种动物物种中 具有类似的毒性效应，此发现提出了是否所有的阿维菌素类似物都能够调节代谢的问题。 考虑到FXR脂质代谢的决定性作用，研究了伊维菌素在NAFLD上的治疗效果。为了探索伊维 菌素作用的机理W及药物干预的更多选择，研究了阿维菌素类似物阿己克下、多拉克下和 依立诺克下，W及源自米尔贝霉素的莫昔克下。
[0160] 首先，伊维菌素在肝脏脂质积累上具有显著的有利效果。其次，并非所有选择的大 环内醋具有与伊维菌素相比类似的效果。在选择的类似物中，依立诺克下和莫昔克下的治 疗在患有肥胖和糖尿病的高脂肪饲料KK-Ay小鼠中没有显示任何治疗效果。多拉克下和阿 己克下在NAFLD的典型症状上展示出与伊维菌素类似的优秀的效果。他们显著地降低了肥 胖和糖尿病小鼠的肝脏中的脂质积累，减小了肝脏体重比率W及降低了体重。它们也降低 了血清甘油=醋和胆固醇水平，W及血清葡萄糖水平，并且提高了膜岛素敏感性。更重要 地，S种阿维菌素的运些功能依赖于核受体FXR。在FXR缺陷的小鼠中，它们未能显示出对提 到的症状的任何改善。体外生物化学方法和基于细胞的体内方法对上述现象给出了明确解 释。W伊维菌素类似，多拉克下和阿己克下诱导FXRW聚集辅因子，并且激活FXR转录活性。 与FXR结合的伊维菌素的晶体结构、多拉克下和阿己克下在FXR的配体结合口袋中的对接模 型W及诱变检测都证明了运些阿维菌素类似物是FXR的配体。相对地，依立诺克下和莫昔克 下没有诱导包括辅激活子和辅抑制子的任何辅因子向FXR的聚集或者影响FXR的转录活性， 表明它们不是FXR的配体。因此，结合于FXR的阿维菌素类似物可W用于治疗NAFLD。
[0161] 多拉克下、阿己克下和伊维菌素也表现出作为部分FXR激动剂，并且可W为运些抗 寄生虫FXR配体的独特性质提供分子机理。首先，通过运些化合物的用于FX購专录活性的能 力弱于全激动剂GW4064。第二个原因是与F邸的明显偏低的结合亲和性。最重要的是，关于 部分激动剂还有第S个特性，即它们能够诱导辅抑制子NCoR-2的聚集。伊维菌素结合的FXR 的晶体结构W及多拉克下和阿己克下在FXR的配体结合口袋中的完美对接显示出松散的 AF-2螺旋的现象，解释了通过运些阿维菌素诱导的NCoR-2的聚集。还有其他证据，即部分激 动剂促进了辅抑制子的聚集。例如，VDR配体能够促进辅激活子SRCl和辅抑制子SMRT和NCoR 两者的聚集。观察到NCoR和SMRT两者与糖皮质激素受体的激动剂和括抗剂复合体有联系。 因此，本发明中的FXR配体阿维菌素被认为是部分激动剂，与传统的全激动剂或括抗剂不 同。
[0162] 除作为基底通用方法的饮食和体育运动之外，没有实际可用于治疗NA化D的特异 性药物。由此，与肥胖的全球流行W及其与代谢综合征和癌症的强烈关联一起，需要治疗 NAFLD的特异性肝脏药物。与诸如PPARg或R邸的核受体的配体相比，已经表征的FXR的配体 非常有限。鉴于肝脏中FXR的重要性，有希望找到治疗NA化D的潜在配体。在本发明中，检测 了一系列用于治疗NA化D的药物。因为阿维菌素类似物在治疗动物和人的寄生虫感染中数 十年的使用，已经验证了阿维菌素类似物的安全性。鉴于在代谢上的优秀治疗效果，FXR配 体阿维菌素能够提供一类新型的治疗包括NAFLD、NASH、高血脂和糖尿病的代谢综合征的有 前途的药物。此外，F邸配体阿维菌素类似物与非F邸配体阿维菌素类似物之间的结构差异， 提供了设计祀向核受体FXR的药物的新的见解和策略。
【主权项】
1. 一种治疗患者需要治疗的代谢疾病的方法，该方法包括向所述患者提供治疗上有效 剂量的激活法尼醇X受体(FXR)的化合物或其药学上可接受的盐。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物包括FXR的激动剂或部分激动剂。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物包括阿维菌素类似物。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述阿维菌素类似物选自由伊维菌素、多拉克丁和 阿巴克丁所组成的组。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢疾病选自由高血糖、胰岛素抗性、高甘油 三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症、代谢综合征、代谢失调、法尼醇X受体介导的疾病 和肝脏疾病所组成的组。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述肝脏疾病是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非酒 精性脂肪性肝炎(NASH)。7. -种药物组合物，该药物组合物包含有效剂量的根据权利要求1所述的化合物和药 学上可接受的载体。8. -种调控核受体的方法，该方法包括给药包含治疗上有效剂量的阿维菌素类似物的 组合物，其中所述阿维菌素类似物与所述核受体的配体结合域结合。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述核受体包括法尼醇X受体(FXR)。10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述阿维菌素类似物选自由伊维菌素、多拉克丁 和阿巴克丁所组成的组。11. 根据权利要求8所述的方法，其中调控FXR来治疗个体的代谢疾病。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述代谢疾病选自由高血糖、胰岛素抗性、高甘 油三酯血症、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖症、代谢综合征、代谢失调、法尼醇X受体介导的疾 病和肝脏疾病所组成的组。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述肝脏疾病是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或非 酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
【专利摘要】本发明涉及调节法尼醇X受体(FXR)的、用于治疗代谢疾病诸如例如非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝炎的化合物的新用途，所述化合物具体为伊维菌素、阿巴克丁和多拉克丁。
【IPC分类】A61P29/00, A61P9/10, A61P3/06, A61P3/04, A61P1/16, A61P3/10, A61P5/50, A61K31/7048, A61P35/00, A61P3/00, A61K45/00
【公开号】CN105477636
【申请号】CN201510672540
【发明人】李勇, 冯需辉, 金利华
【申请人】厦门大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年10月16日