03] 软琼脂：向去离子水（IL)添加膜蛋白腺（lOg)、酵母提取物(5g)、化Cl(5g)、氯化儀 (Ig)和琼脂糖(7g)。对产物进行高压灭菌，分成50mL等分部分并W固体于室溫下储存。在使 用之前，用微波炉烙化所述软琼脂。
[0104] 阳G/化Cl隧菌体沉淀溶液：W20% (重量/体积）的浓度向2.5M NaCl的去离子水溶 液添加聚乙二醇-8000。对所述溶液进行高压灭菌，于室溫下储存。
[0105] 根据PCT公布WO 2012/167081 (Wightman)中所描述的合成程序来制备N-(4-{ [4-氨基-2-下基-IH-咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基]氧基}下基)-6-(沪-异亚丙基阱基)烟酷胺。
[0106] 使用山羊抗-豚鼠 IgG-HRP(得克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology ,Dallas, TX))来进行ElLISA测定。
[0107] 人尸体皮肤是冷冻储存的。在使用之前，将冷冻部分放置在PBS中并升至室溫。向 皮肤样本的角质层侧施用所述隧菌体文库或所合成的肤序列。
[0108] 互空 巧…9] 隧菌体扩增:
[0110]向包含LB培养基（2mL)和四环素（W20iig/mL的浓度）的管接种大肠杆菌ER2738细 胞，并且随后于37°C下摇动(200巧m)解育过夜。向包含20iig/血四环素的20血新鲜LB培养基 添加等分部分(100微升）。于37°C下摇动烧瓶(200rpm)来解育培养物，并且使所述细胞生长 至早期对数期(00600 = 0.5)。接着，添加所述隧菌体样本，并且将所述培养物于37°C下保持 4小时并摇动烧瓶。
[0111] 隧菌体纯化:
[0112] 通过SOOOrpm下离屯、10分钟来从隧菌体扩增培养物样本中移除大肠杆菌邸2738细 胞。（W-体积上清液对五体积沉淀溶液的浓度)将所得上清液溶液添加至PEG/化Cl隧菌体 沉淀溶液，并且随后于4°C下保持2小时。通过离屯、样本(800化9111，3〇111111)，移除上清液并于 2血Tris-缓冲盐水(将50mM Tris-HCl溶于150mM NaCl缓冲盐水(pH 7.5)来制备Tris缓冲 盐水试剂）中重悬隧菌体沉淀物来回收所得的隧菌体沉淀。将扩增的隧菌体产物于4°C储 存。
[0113] 隧菌体滴度:
[0114] 向LB肉汤培养基（5-lOmL)接种大肠杆菌ER2738的单菌落并于37°C下摇动 (200rpm)解育直至细胞达到早期对数生长期(00600 = 0.5)。随后，将所述培养基分配到多 个微量离屯、管(200微升每微量离屯、管，其中每个隧菌体稀释度制备一管）中。制备于LB肉汤 培养基中十倍系列稀释度的扩增隧菌体产物，并且向包含培养基的单独微量离屯、管添加每 个稀释度10微升的等分部分。将每个管縱满振荡并于室溫下解育1-5分钟。
[0115] 将每个微量离屯、管的内容物转移到包含3mL保持在45°C下的软琼脂的对应培养管 中。随后，将每个培养管縱满振荡，并且将所述软琼脂倒到对应预热（37°C)的LB/IPTG/X-gal\四环素倍替平板上。将所得平板缓慢倾斜并旋转，W便将所述软琼脂均匀地铺展在平 板上。使所述平板冷却五分钟，倒置并随后于37°C下解育过夜。对具有大约100个隧菌斑的 平板进行计数，从而提供稀释因子的调整。在平板上选择单个隧菌斑的隧菌体并进一步进 行DNA测序。
[0116] 隧菌体的DNA测序:
[0117] 向96深孔板(每个孔具有2mL体积)的每个孔添加大肠杆菌邸2738细胞培养物(800 微升如上文所述制备的早期对数期）。从如隧菌体滴度程序所述制备的倍替平板上随机选 择单个隧菌斑的隧菌体。使用无菌牙签来从所述倍替平板上移除隧菌斑并将其转移到96孔 板的孔中。将被感染的大肠杆菌邸2738细胞于37°C下摇动（300rpm)解育4小时。随后，将液 体培养物离屯、(4°C下4000rpm，60min)，并且使用滚环扩增方法将从每个孔所得隧菌体上清 液的等分部分（10微升）用于DNA测序。DNA测序在MCLAB(加利福尼亚州南旧金山（South San Francisco, CA))进行。
[011引自菌体展示文库的肤选择:
[0119] 使用实例1和2中所描述的程序来实现增强代表性活性剂化合物的皮肤渗透的肤 的选择。
[0120] 实例 1
[01引]^?i胶带剥离程序针对皮肤渗透增强的隧菌体展示文库选择)
[0122] 使用PIPETMAN经典移液管（威斯康星州米德尔顿的吉尔森公司（Gilson Inc.， Middleton，WI))向Icm2人尸体皮肤部分施用每个隧菌体展示文库(200微升于PBS中）。使用 粘合带来形成限定施用部位的方形框架。1小时之后，用PBS洗涂所述施用部位W移除残留 在皮肤表面上的隧菌体。使用Scotch''盒胶带（明尼苏达州梅普尔伍德的3M公司（3M Company ,Maplewood ,MN))来实现皮肤样本的胶带剥离。将所述胶带放置在皮肤上，使得其 覆盖整个施用部位，但未延伸超过所述框架边界(胶带条的宽度为大约1.5cm)。对于胶带的 每次施用，W300g手持漉的S个循环(3次向前行和3次向后行)将所述胶带固定到皮肤。接 着，用手抓住胶带的一端并使用单向运动从所述皮肤表面迅速剥掉。在隧菌体文库施用部 位处重复进行完全相同程序的胶带剥离23次W上。将胶带条21-24浸入PBS(SmL)中W从粘 合剂中回收隧菌体。另外，将第24次胶带剥离程序之后余下的皮肤样本浸入PBS(SmL)中W 从该样本中回收隧菌体。将回收的隧菌体混合并随后使其扩增。将扩增池的隧菌体加载到 新的尸体皮肤样本上W进行另一个轮的选择和扩增。完成了总共四轮的选择和扩增。在最 后(第4个)选择步骤之后，根据隧菌体滴度程序(上文所述)在琼脂平板上将隧菌体与大肠 杆菌2738分离。从琼脂平板上随机挑出单个隧菌斑的隧菌体并使用上文所述的程序进行隧 菌体DNA测序。成功地从96个分离隧菌体的隧菌斑的57个中获得DNA序列。 巧12引 实例2
[0124] (使用体内无毛豚鼠程序针对皮肤渗透增强的隧菌体展示文库选择)
[0125] 使用氧气或空气中3-5 %的异氣烧来在小室中麻醉无毛豚鼠（200克雌性，来自马 萨诸塞州威明顿的查尔斯河实验室（化arles River LaboratoiT,Wilmington,MA))，并且 用同轴呼吸装置(C0AX-3，从新泽西州梅德福湖的维健医疗公司(V化ing Medi Ca 1，Me壯ord Lakes，NJ)获得)保持在1.5-3%的异氣烧下。将每个动物W侧邸放置在恒溫控制的表面上， 同时在实验持续期间，其口鼻处于麻醉面罩内侧。在程序进行期间，监测所述动物的呼吸速 率并按需要调整麻醉水平。用70%异丙醇的水溶液擦拭用于加载隧菌体文库的背部部分。
[0126] 使用PI阳TMAN经典移液管将在200微升PBS中包含约1〇11个隧菌体颗粒的隧菌体展 示文库加载到Icm 2动物背部皮肤部分上。为了控制湿度并降低施用部位处的污染，将化11 TopCliamberk (佛罗里达州圣彼德斯堡的希尔托普研究公司（Hill Top Research, St .Petersburg，化））放置在施用部位上并用粘合剂粘附。I小时之后，从屯、脏流出IOmL血 液。将该血液立即转移到包含肝素（1OOOUSP单位每mL)的小瓶。将该血液样本(IOmL)与50mL LB肉汤培养基中的大肠杆菌邸2738细胞(早期对数期，00600 = 0.5)混合，并且随后添加到 300mL软琼脂。将包含血液和ER2738(约7mL每平板）的软琼脂的等分部分添加到五十个LB/ IPTG/X-gal/四环素倍替平板。将运些平板于37°C下解育过夜。从琼脂平板上随机挑出所得 的单个隧菌斑的隧菌体并使用上文所述的程序进行隧菌体DNA测序。成功地从96个分离隧 菌体的隧菌斑的48个中获得DNA序列。 巧127] 实例3
[0128] 表2中展示了由实例1和2的分离的核巧酸序列编码的肤序列（SEQ ID N0:l-8)。报 导了所回收的隧菌斑中每个肤序列的频率。
[0129] 表2:
[0130]
[0131] 实例4
[0132] 合成肤SEQ ID NO: 1-8(表2)的修饰形式，其中每个肤序列在N-末端上侧接細S肤 序列并在〇末端上侧接6665(沈0 10側:9-14和16，表3中）、胖口4(560 10側:15，表3中）或0 (沈Q ID NO: 17)肤序列。
[013引 实例5
[0134] 毛豚鼠皮肤来进行测试皮肤渗透增强的体外测定。使用了来自动物背部区 域的完整皮肤样本。制备表3中每个肤的单个测试样本，使其包含肤（Wlmg/mL的浓度）、 FITC钢盐m lOmg/mL的浓度)和PBS(200微升）。制备仅包含FITC钢盐（W lOmg/mL的浓度)和 PBS(200微升）的对照样本。使用PIPETMAN经典移液管向豚鼠皮肤的角质层侧的单独的Icm2 部分施用每个肤测试样本。W相同的方式施用对照样本。将经处理的皮肤样本盖上，于室溫 下保持1小时并随后用去离子水洗涂5分钟W移除任何残留在皮肤表面上的FITC。使用 Scoteh?盒胶带来实现每个皮肤施用部位的胶带剥离。将所述胶带放置在皮肤上，使得其 覆盖单个施用部位的整个表面(胶带条的宽度为大约1.5cm)。对于每个胶带剥离程序，W 300g手持漉的S个循环(3次向前行和3次向后行)将所述胶带固定到皮肤。接着，用手抓住 所述胶带的一端并使用单向运动从皮肤表面迅速剥掉。在每个施用部位处重复进行完全相 同程序的胶带剥离总共20个胶带剥离操作。使用340nm下的紫外光针对FITC成像每个样本 的第20个胶带条。存在胶带上的巧光点指示FITC渗透到第20个胶带条中。此结果呈现于表3 中。
[0135] 整；
[0137] NT =未测试 [013引 实例6
[0139] 尸体皮肤来进行测试皮肤渗透增强的体外测定。制备了两个测试样本(A和 B)和对照样本。测试样本A包含GFP( W2.55mg/血的浓度）、0.1 mg肤A化DNTFRAC(沈Q ID NO: 6，表2)和PBS(50微升）。测试样本B包含GFP( W2 . 55mg/mL的浓度）、0 . Img肤 SHSACLDNTFRACGGGS(SEQ ID NO: 14，表3)和PBS(50微升）。对照样本包含GFP(W2.55mg/mL 的浓度)和PBSQOO微升）。使用PIPETMAN经典移液管向人尸体皮肤的单独的Icm2部分施用 每个样