，Higgins等， 公开于2012年3月8日；美国专利申请号2012/0172836，Higgins等，公开于2012年7月5日。
[0080] 凝块提取物与固相提取材料的接触，可使用影响接触的合适的容器或其它装置来 执行。接触可W在连续过程中进行，其中源源不断的凝块提取物或绕过，或通过固相提取材 料，或凝块提取物和固相提取材料可W被放置于一个容器中。如上讨论，该容器可包含固相 提取材料，或者可W仅仅作为容器容纳珠或其它形式的材料。在本技术有用的容器包括那 些本领域中已知的，如PLASMAX?Plus Plasma Concentrator,购自Biomet Biologies,LLC (Warsaw，Indiana，USA)，W及可包括如美国专利No. 7，553，413，Dorian等人，公开于2009年 6月30日；美国专利号No. 7，694，828，Swif t等人，公开于2010年4月13日的所述那些设备和 使用方法。
[0081] 运样的装置如图2A和2B所示，为示范性用途，用聚丙締酷胺凝胶珠固相提取材料。 装置200具有上腔室205和下腔室210。上腔室205具有端壁215,凝胶珠揽拌器225的揽拌器 阀杆220延伸穿过端壁215。装置200还有入口 230,其延伸穿过端壁215并进入上腔室205。装 置200也包括出口 235,其与血浆浓缩液导管240连通。上腔室205的基底包括过滤器245,它 的上表面支持干燥的浓缩聚丙締酷胺珠250。
[0082] 在使用过程中，将含有凝块提取物的液体255经由入口230注射入上腔室205,与聚 丙締酷胺珠250混合。流体255和聚丙締酷胺珠250可通过旋转揽拌器阀杆220和凝胶珠揽拌 器225被混合，W帮助流体255和聚丙締酷胺珠250混合。然后，混合的流体255和聚丙締酷胺 珠250在所需的溫度溫育所需的时间。然后离屯、装置200W使液体被传到下腔室210,而聚丙 締酷胺珠250由过滤器245保留，由此可从所得的IL-Ira和其他蛋白质的溶液260分离聚丙 締酷胺珠250,所述溶液260在下腔室210中收集。溶液260可W经由出口 235从该设备移除。
[0083] 从组织培养物中获得组分
[0084] 用于制备无细胞蛋白质溶液的方法可包括W细胞培养物的形式培养细胞，所述细 胞天然产抗炎性细胞因子，如IL-Ira,或者细胞经工程化W产生运样的细胞因子。非限制性 的自然产生抗炎性细胞因子的细胞的实例包括脂肪组织的细胞、脂肪细胞、脂肪来源的干 细胞、基质细胞、骨髓细胞、间充质干细胞和血细胞。
[0085] 在各种实施方案中，细胞系可经工程化W过量产生抗炎性细胞因子。抗炎性细胞 因子的非限制性实例包括VEGF、TNF-a、Iklra、sTNF-RI、sTNF-RII、PGDF-AB、PDGF-BB、IGF-1、66。^6。-01、3化-1311和服。。通过用含有编码抗炎性细胞因子和选择标记基因的重组 DNA转染真核细胞，如哺乳动物细胞，生成稳定的真核细胞系，W过量表达抗炎性细胞因子。 可替代地，用含有编码抗炎性细胞因子和选择标记基因的重组DNA转化原核生物和酵母，W 过量表达抗炎性细胞因子。转化和转染用包含编码抗炎性细胞因子，如IL-Ira,和选择性标 记的DNA序列的重组DNA分子进行。真核和原核细胞可经工程化W组成型或诱导型过表达抗 炎性细胞因子。在真核和原核细胞中表达抗炎性细胞因子，如比-lra、sTNF-RI、sTNF-RlKP SlLl-RII的方法描述于，美国专利No. 6337072，Ford等人，公开于2002年1月8日；美国申请[0086] 当IL-Ira在人体内转录，mRNA被剪接成四种变体，导致翻译的化-Ira的四种同种 型。SEQ ID N0:l、3、5、7分别是比-Ira同种型1-4的cDNA，SEQ ID N0:2,4,6,8分别是比-Ira 同种型1-4的氨基酸序列。总的来说，IL-Ira的同种型统称"比-Ira" dSEQ ID N0:9是STNF-尺1的。0臟序列，569 10^:10是31^-31的氨基酸序列。沈9 10^:11是31^-1?11的。0魁序 列，SEQ ID NO: 12是sTNF-RII的氨基酸序列。沈Q ID NO: 13是S比-IRI的cDNA序列，SEQ ID 顯：14是3化-131的氨基酸序列。569 10肋：15和17分别是3化-11?11￥1和3化-11?11￥3的 cDNA，SEQ ID ^:16和18分别是1311￥巧日3比-11?11￥3的氨基酸序列。比-11?11￥2的。0魁是非 编码序列；因此，未包括在内。
[0087] 为在原核培养物中，例如在特定细菌中，表达比-lra、sTNF-RI或sTNF-RiK统称为 目的蛋白），将CDNA序列（SEQ ID ^:1、3、5、7、9、11、13、15、17)克隆到适于细菌的表达载体 里。该表达载体应包含强启动子和可选择标记，如抗生素抗性。能够杀死细菌细胞的抗生素 的非限制性实例包括氨节西林、四环素、卡那霉素和氯霉素。表达载体应进一步包含导致组 成型或诱导型表达目的蛋白的元件。任选地，考虑到鉴定和纯化该蛋白质，载体上与目的蛋 白质的基因相邻的位置可存在对应于与目的蛋白质功能性偶联的标签的DNA序列。例如，N 端或C端化S标签可用于用抗化S抗体检测蛋白质，并且它们可在儀柱上纯化。当制备了包含 表达目的蛋白基因的表达载体，细菌细胞，例如大肠杆菌化.COli),可用表达载体转化。可 选择的标记确保只有用该载体转化的细胞在补充有与选择标记相应的抗生素的LB培养基 中存活。然后细菌可在补充有用于表达和纯化的抗生素的LB培养基中成长。表达载体，用于 克隆目的蛋白到表达载体的方法，用于转化原核细胞的方法，用于从转化的原核细胞中表 达蛋白的方法，W及蛋白纯化的方法是本领域的普通技术人员的常识。
[0088] 为在真核培养物中，例如在哺乳动物细胞中，表达目的蛋白，将CDNA序列（SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15,或17)克隆到适合特定哺乳动物细胞的表达载体上。表达载体包 含强启动子和可选择标记，例如抗生素抗性。能够杀死哺乳细胞的抗生素的非限制性实例 包括遗传霉素和庆大霉素。表达载体应进一步包含导致组成型或诱导型表达目的蛋白的元 件。任选地，，考虑到鉴定和纯化该蛋白质，载体上与目的蛋白质的基因相邻的位置可存在 对应于与目的蛋白功能性偶联的标签的DNA序列。当制备了包含表达目的蛋白基因的表达 载体，哺乳动物细胞，例如人体细胞，可用表达载体转染。转染的细胞可在补充有与选择标 记相应的抗生素的细胞培养基中成长。抗生素的存在允许稳定细胞系的分离。然后稳定细 胞系可在补充有用于表达和纯化的抗生素的细胞培养基中成长。表达载体，用于克隆目的 蛋白到表达载体的方法，用于转染真核细胞和发展稳定细胞系的方法，用于从转染的真核 细胞中表达蛋白的方法，W及蛋白纯化的方法是本领域的普通技术人员的常识。
[0089] 可替代地，没有被DNA转染而遗传改变的真核细胞可被培养。真核细胞可是原代培 养物，即所培养的细胞直接来自真核供体，如人，或者真核细胞也可W是已建立的细胞系。 许多已建立的细胞系可购自American Type Culture Collection,Inc. (Manassas,VA, USA)。可W用或外源信号，如重组蛋白，培养细胞。真核细胞常培养于含细胞培养基的培养 瓶中。细胞培养基可从瓶中回收，并离屯、W除去任何非贴壁细胞。
[0090] 细胞培养可是单层培养、非贴壁培养或生物反应器。单层培养包含贴壁细胞，在合 适的基底上培养，如细胞培养瓶和细胞培养皿，使得细胞粘附和扩散。非贴壁培养包含悬浮 细胞。适合的细胞要么是不贴壁细胞，要么是适于在悬浮液中培养的贴壁细胞。许多细胞 系，如许多昆虫细胞，可单层培养或悬浮液中生长。生物反应器是能支持生物学活性环境的 装置，其中进行化学过程和/或获得生化活性物质。生物反应器可包括悬浮或固定化的细 胞。单层培养、非贴壁培养或生物反应器可通过本领域中常用方法来保持。
[0091 ]在一些实施方案中，对细胞培养物施加电磁场，W便刺激一种或多种蛋白质产生。 用电磁场刺激培养物可设及多种形式的电磁刺激，如脉冲电场或电容禪合电磁场。在一些 实施方案中，用与电源偶联的刺激线圈刺激所述培养物。电流通过线圈产生脉冲磁场，能在 液体中诱导脉冲电场。当它放在容器内，线圈可部分缠绕细胞培养物。线圈可整合入包含细 胞培养物的容器，或是可拆卸的。例如，塑料管可与集成的线圈一起形成，或线圈可暂时与 容器偶联，或放在容器内；例如，该管可被构造成使得线圈可卡装在容器上。电源可W根据 需要偶联到线圈进行刺激。
[0092] 用电磁场刺激培养物也包括跨越液体放置至少两个电极。然后可将电能施加到电 极，W便电容禪合电极W及在此间产生电磁场。因此电磁场能通过所述培养物，W增加细胞 因子的生成速率和/或量。在其他实施方案中，电极可用来产生直流电或者一个或多个线圈 可用来产生脉冲电磁场。
[0093] 电磁场的强度在刺激过程中可W为至少约0.5微伏/厘米，无论是由直流电、电容 禪合的电流、或脉冲电磁场产生。在直流电电极的情况下，电流振幅可W是约1-200微安，并 且在一些实施方案中，振幅可为约20-100微安。在更进一步的实施方案中，电流可W是约 20、约60或约100微安。然而，应该理解的是，电流振幅也可W是其它合适的幅度。
[0094] 刺激所施加的电磁场可W恒定或随时间变化。例如，正弦时变电磁场可使用跨越 液体放置的电极而施加。运种正弦时变电磁场的跨电极的峰值电压可W为约1-10伏，在一 些实施方案中，峰值电压大约为5伏。所产生的相应的电场振幅可W是约0.1-100毫伏/厘米 (mV/cm)，在一些实施方案中，为约20mV/cm。正弦时变电磁场的频率范围约1，000-200,000 赫兹，在一些实施方案中，频率可为约60，000赫兹。
[0095] 施加到培养物的电磁场也可是脉冲电磁场。脉冲电磁场可W使用外部线圈和脉冲 发生器来引起。在运方面，脉冲电磁场的脉冲持续时间可W为10-2000微秒/脉冲。在一个实 施方案中，脉冲持续时间大约为225微秒。脉冲可包括电磁脉冲，其中一个脉冲串可含约1-200个脉冲。可替代地，电磁场可产生含约10-30个脉冲的脉冲串。在运方面，一个实施方案 中每个脉冲串可包含约20个脉冲。
[0096] 施加的脉冲电磁场中的脉冲串频率可变。在运方面，一些实施方案中，脉冲串可W 1-100赫兹的频率重复，在其他实施方案中，可W10-20赫兹的频率重复。此外，脉冲串W约 1.5赫兹、约15赫兹或约76赫兹的频率重复。脉冲串的持续时间可为10-40，000微秒。在运方 面，脉冲串持续时间约4.5毫秒。
[0097] 用于产生电容禪合电磁场的合适装置包括SpinalPak?脊髓刺激仪化Bl，L.P.， Parsi邮any ,New Jersey)或DC刺激装置如SpF"化IIb脊髓融合刺激仪化BI, L.P.， Parsippany,化W Jersey)。脉冲电磁场可用各种已知方法和设备产生，如采用单线圈或一 对Helmholtz线圈。例如，合适的设备包括EBI Bone 胎alingSystexa⑥Model 200UEBI, L.P. ,Parsippany,化W Jersey)和BTBS刺激线圈。关于直流电，电场可用任何已知用于产生 直流电场的装置来生成，如Osteogen?可植入的骨生长刺激仪化BI ,L.P.,化rsippany ,New Jersey)。也可使用其他合适的装置产生电磁场。
[0098] 细胞培养物可W自然释放抗炎性细胞因子至培养基中，或培养物可被诱导释放抗 炎性细胞因子至培养基中。培养基可W通过抽吸、离屯、或过滤分离，用于形成