剂为"A"，以及包括结合DC受体并递送髓鞘蛋白或组分或肽或其共有肽 (consensus peptide)的抗体的抗体免疫治疗剂为"B" ：
[0283] A/B/A B/A/B B/B/A MAfB A/B/B: B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B：/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0284] 将抗体组合物给予患者/受试者将遵照给予该化合物的一般方案，考虑组合物的 毒性，如果有的话。预期的是治疗周期将根据需要重复。还考虑各种标准治疗，如水合，可以 与描述的治疗组合应用。
[0285]通用药物组合物
[0286]在一些实施方案中，药物组合物给予受试者。不同的方面可以涉及给予受试者有 效量的组合物。在一些实施方案中，结合DC受体并递送髓鞘蛋白或组分或肽或其共有肽的 抗体可以给予患者以保护其免受多发性硬化症或治疗多发性硬化症。供选择地，编码一种 或多种这样的抗体或多肽或肽的表达载体可以作为预防性治疗给予患者。另外地，这样的 组合物可以与免疫抑制剂组合给予。这样的组合物将一般溶于或分散在药学上可接受的载 体或含水介质中。
[0287] 术语"药学上可接受的"或"药理学上可接受的"是指当给予动物或人时不产生不 利的、过敏性或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所使用的，"药学上可接受的载 体"包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。用于 药物活性物质的这样的介质和药剂的用途在本领域是熟知的。除了在任何常规介质或药剂 与活性成分不相容的范围内，考虑其用于免疫原性和治疗组合物中。补充的活性成分，如其 他抗感染剂、免疫抑制剂和免疫治疗剂，也可以加入组合物中。
[0288] 活性化合物可以配制成用于肠胃外给予，例如，配制成用于经静脉内、肌内、皮下 或甚至腹膜内途径注射。通常地，这样的组合物可以制备成液体溶液或悬浮液;还可以制备 适用于在注射前加入液体以制备溶液或悬浮液的固体形式;并且制剂还可以是乳化的。
[0289] 适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体;包括芝麻油、花生油或 含水丙二醇的制剂;和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下， 形式必须是无菌的，并且必须是流动的，到其可以容易地注射的程度。其在制造和储存条件 下还应当是稳定的，并且必须针对微生物如细菌和真菌的污染作用进行防腐。
[0290] 蛋白质组合物可以配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐，包括酸加成盐 (由蛋白的游离氨基形成的）和与以下形成的药学上可接受的盐:无机酸，例如盐酸或磷酸； 或有机酸，如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。由游离羧基形成的盐也可以源自：无机碱，例 如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁;和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组 氨酸、普鲁卡因等。
[0291] 药物组合物可以包括溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质包含例如，水、乙醇、 多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、其适合的混合物和植物油。适当的流动性 可以例如通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒径，和通过使用表面 活性剂来维持。对微生物的作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如，尼泊 金、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如，糖或氯化钠。 可注射的组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延长吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶 来实现。
[0292] 无菌注射液制备如下:根据需要在具有以上列举的各种其他成分的适合的溶剂中 以所需量加入活性化合物，接着是过滤灭菌或等同的程序。一般地，分散体制备如下:将各 种灭菌的活性成分加入无菌溶媒中，所述无菌溶媒含有基础分散介质和来自以上列举的那 些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真 空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末，加上来自其之前的无菌过滤溶液的任何 另外希望的成分。
[0293] 组合物的给予将通常通过任何常规途径。这包括但不限于口服、经鼻或经颊给予。 供选择地，给予可以通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内或静脉内注射。在某些实施方 案中，免疫治疗组合物可以吸入(例如，美国专利6,651，655,其具体通过引用并入）。这样的 组合物将通常作为药学上可接受的组合物给予，其包括生理上可接受的载体、缓冲液或其 他赋形剂。
[0294] 基于预期目标确定治疗或预防组合物的有效量。术语"单位剂量"或"剂量"是指适 合在受试者中使用的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的组合物，所述预定量的组 合物经计算以产生与其给予，即适合的途径和方案相关的以上讨论的期望的应答。根据治 疗次数和单位剂量的给予的量取决于期望的保护。
[0295] 组合物的精确的量还取决于从业人员的判断，并且对于每个个体是独特的。影响 剂量的因素包括受试者的身体和临床状态、给予途径、预期的治疗目标(症状减轻vs治愈） 以及具体组合物的效价、稳定性和毒性。
[0296] 在配制时，溶液将以与剂型相容的方式且以治疗或预防有效的这样的量给予。制 剂容易地以各种剂型给予，如上述的注射液的类型。
[0297] IV.实施例
[0298] 包括以下实施例以展示优选的实施方案。本领域技术人员将理解遵照本发明人发 现的代表性技术的在实施例中公开的技术在实施方案的实施中很好地发挥作用，因此可以 视为构成用于其实施的优选模式。然而。本领域技术人员根据本发明应理解，在不背离本发 明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中可以作出许多变化，并且仍然获得相 同或相似的结果。
[0299] 实施例1-对抗-DC-ASGPR抗体的表征和应答
[0300]所有动物(总共12只动物:每组6只动物)使用活流感病毒(HlNl，PR8)预免疫。来自 所有动物的血清显示HAl-特异性IgG(数据未显示）。敏化四个月后，使用抗-L0X-1-HA1(右 臂）和抗-L0X-1-PSA(左臂）或抗-DC-ASGPR-HA1 (右臂）和抗-DC-ASGPR-PSA (左臂）皮内免疫 动物。在使用相同的重组融合蛋白以40天间隔免疫三次后，按照指示收集血液。当与使用 抗-L0X-1-HA1免疫的那些相比，来自使用抗-DC-ASGPR-HA1免疫的动物的PBMC分泌更高水 平的IL-10以应答HAl肽库（图2B，上图）。相反地，来自使用抗-L0X-1-HA1免疫的动物的PBMC 比使用抗-DC-ASGPR-HA1免疫的动物分泌显著更高水平的IFNy (图2B，下图）。在使用PSA融 合蛋白敏化和加强两次的动物中得到相同的发现。PSA-特异性产生IL-10的细胞应答优先 在使用抗-DC-ASGPR-PSA免疫的动物中上升（图1B，上图）。使用抗-L0X-1-PSA免疫的动物比 使用抗-DC-ASGPR-PSA免疫的动物发生更高的PSA-特异性产生IFNγ的细胞应答（图1B，下 图）。对于HAl和PSA，产生IL-10的细胞应答的峰值在第一周获得，但产生IFNy的细胞应答 的峰值在第三周获得。总之，数据显示通过DC-ASGPR使抗原靶向体内DC可以在体内建立抗 原特异性产生IL-10的T细胞。
[0301]源自单核细胞的IFNDC在包被指定的单克隆抗体的板中培养过夜。收获细胞，并使 用市售PCR引物，通过实时PCR评估IL-10、IL-6和TNFa的RNA表达水平。与抗-DC-ASGPR抗体 的其他克隆相比，5H8和49C11导致IL-10的表达升高。其还诱导IL-6和TNFa的水平升高（图 3A)〇
[0302]在培养物上清液中的IL-10的量通过Luminex分析来评估。与左图中的数据一致， 5H8和49C11诱导IFNDC分泌的IL-10的量升高（图3B)。
[0303] 来自健康供体(n = 6)和MS患者(n = 25)的〇)11〇+血0(：使用5!18、462和49(：11染色。 来自健康供体和患者的⑶llc+DC均显示两种不同类型的抗-DC-ASGPR抗体结合:所有抗-DC-ASGPR抗体良好地结合于来自约50 %的供体的CD 11 c+DC，而来自另外50 %的供体的 ⑶I lc+DC被抗-DC-ASGPR抗体的三种克隆微弱染色。然而，49C11能够比另外两种克隆更好 地结合于CDllc+DC。除了其(49C11)诱导IL-IO的能力以外，49C11可以良好地结合于DC。因 此，49C11被选择为待融合到MS抗原的克隆（图4)。
[0304] 来自健康供体的CDl lc+DC使用不同浓度的（0、3、10和30ug/ml)的抗-DC-ASGPR-MBP或单独的MBP染色。数据表明抗-DC-ASGPR-MBP良好地结合于DC(图6B，上图）。
[0305] 来自健康和MS患者供体的PBMC负载5ug/ml抗-DC-ASGPR-MBP融合蛋白或仅负载 MBP。孵育细胞7天，然后在源自MBP的肽簇（cluster)的存在下再刺激T细胞48h。通过 Luminex评估由T细胞分泌的IFNg和IL-10。与MBP相比，抗-DC-ASGPR-MBP导致在健康和患者 供体中均升高的MBP-特异性产生IL-10的T细胞应答(图6B，下图）。
[0306] 来自健康供体的CDl lc+DC使用不同浓度(0、3、10和30ug/ml)的抗-DC-ASGPR-M0G 或单独的MOG染色。数据表明抗-DC-ASGPR-M0G良好地结合于DC(图7A)。
[0307](下图）来自MS患者供体的PBMC负载5ug/ml抗-DC-ASGPR-M0G融合蛋白或仅负载 MBP。孵育细胞7天，然后在源自MBP的肽簇的存在下再刺激T细胞48h。通过Luminex评估由T 细胞分泌的IFNg和IL-10。与MOG相比，抗-DC-ASGPR-M0G导致在健康和患者供体中均升高的 MBP-特异性产生IL-10的T细胞应答(图7B)。
[0308] 实施例2-抗-DC-ASGPR-M0G对NHP中的EAE诱导/进展的影响
[0309]以下实验结果由与本发明人一起工作的Dr.Roger Le Grand友情提供。
[0310] 为了测试抗-DC-ASGPR-M0G对非人灵长类(NHP)中的EAE形成/进展的影响，使用在 食蟹猴中的EAE模型。
[0311 ]实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，有时称为实验性变应性脑脊髓炎，是脑炎的动 物模型。其为中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘疾病。其最初使用啮齿类，广泛地作为人CNS 脱髓鞘疾病，包括多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎(ADEM)的动物模型进行研究。EAE通 常也是T细胞介导的自身免疫疾病的原型。根据以下临床症状和症状的持续时间对动物评 分：
[0312]
[0313] 实验设计。实验设计总结在图8中。组1(实验组：由3只食蟹猴组成)和组2(对照组： 由3只食蟹猴组成)在第0、28和56天注射不完全弗氏佐剂中的hMOG。实验组1的动物在第7、 14、21、35和63天接受抗436?1?-11]\106注射。对照组2动物在第7、14、21、35和63天接受抗-ASGPR-hPSA 注射。
[0314] 抗-DC-ASGPR-M0G抑制EAE在NHP中的形成/进展。在实验的整个期间，每日监测动 物以测量EAE得分。使用抗-DC-ASGPR-M0G处理的动物（ID号AP607、CB385和CB457)均未显示 任何疾病的临床症状。这些动物不显示上升的E A E疾病得分。然而对照组中的三只动物 (AM637、CB207和21983)中的两只（AM637和CB207)在第20天和第37天之间显示上升的EAE得 分（当两只动物均死亡时，图9和10)。总之，本发明人的结论是抗-DC-ASGPR-M0G能够抑制 EAE在NHP中的形成/进展。
[0315] 为了进一步证实在对照组（图8中的组2)中的动物中观察到的临床症状（图9和10) 是否是由于脑内感染，在第22天对动物AM637的脑进行磁共振成像(MRI)。图11显示静脉内 给予的钆被分散，表明从血管渗漏到脑中。T2图像还显示水在几个点积聚，表明该动物中的 髓鞘质受损，因此不能排除水。考虑到液体衰减反转恢复(Flair)数据以及T2和钆数据，得 出该动物脑中具有严重炎症以及脱髓鞘质的结论，这是EAE的典型症状。
[0316] 总之，本发明人证明：1)食蟹猴通过使用MOG肽和佐剂免疫形成EAE，和2)抗-DC-ASGPR-M0G而不是抗-DC-ASGPR-hPSA抑制食蟹猴中的EAE的形成/进展。
[0317] 本文公开并讨论的方法可以依照本发明而不要过度的实验来制备和实施。尽管本 发明的组合物和方法已经就优选的实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的 是，可以在不背离本发明的构思、精神和范围的情况下，对本文描述的方法和所述方法的步 骤或者步骤的顺序进行变化。更具体地，将显而易见的是，某些化学和生理上均相关的药剂 可以代替本文所述的药剂，同时实现相同或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员而 言显而易见的类似替代和修改被视为在由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围及构 思之内。
【主权项】
1. 一种诱导患者对至少一种髓鞘蛋白免疫耐受的方法，其包括给予患者有效量的包含 树突细胞靶向复合物的组合物，所述树突细胞靶向复合物包含连接到至少一种髓鞘蛋白或 其抗原片段的树突细胞抗体或其靶向片段。2. 权利要求1所述的方法，其中至少一种髓鞘蛋白为髓鞘碱性蛋白（MBP)、髓鞘少突胶 质细胞糖蛋白（MOG)、蛋白脂质蛋白（PLP)或髓鞘相关糖蛋白（MAG)。3. 权利要求2所述的方法，其中至少一种髓鞘蛋白为MBP。4. 权利要求2所述的方法，其中至少一种髓鞘蛋白为MOG。5. 权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述树突细胞抗体特异性结合脱唾液酸糖蛋 白受体(ASGPR)。6. 权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述组合物包含多种树突细胞靶向复合物。7. 权利要求6所述的方法，其中所述多种树突细胞靶向复合物包括不同的髓鞘蛋白或 一种或多种髓鞘蛋白的不同的抗原片段。8. 权利要求6或7所述的方法，其中每种髓鞘蛋白或抗原片段分开连接到树突细胞抗体 或其靶向片段。9. 权利要求1 _8任一项所述的方法，其中使用连接肽将所述树突细胞抗体连接到髓鞘 蛋白。10. 权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述组合物还包含至少一种致耐受性佐剂。11. 权利要求10所述的方法，其中所述致耐受性佐剂连接到所述树突细胞靶向复合物。12. 权利要求11所述的方法，其中所述致耐受性佐剂缀合到所述树突细胞靶向复合物。13. 权利要求11所述的方法，其中所述致耐受性佐剂融合到所述树突细胞抗体或其靶 向片段，和/或融合到所述至少一种髓鞘蛋白。14. 权利要求10-13任一项所述的方法，其中所述致耐受性佐剂选自IL-10、地塞米松、 FK506(他克莫司）、霍乱毒素 B亚单位、大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位、IFN-β、糖皮质激素、 维生素 D3和维生素 D3类似物。15. 权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述树突细胞抗体通过结合多肽连接到至 少一种髓鞘蛋白。16. 权利要求15所述的方法，其中所述结合多肽为锚定蛋白和粘连蛋白。17. 权利要求1-16任一项所述的方法，其包括多于一次给予所述组合物。18. 权利要求1-16任一项所述的方法，其中所述组合物经口、静脉内、皮下、皮内、肌内、 经鼻、通过注射、通过吸入、经粘膜和/或使用雾化器给予。19. 权利要求1-18任一项所述的方法，其中所述受试者显示脱髓鞘疾病的一种或多种 症状。20. 权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有脱髓鞘疾病。21. 权利要求1-20任一项所述的方法，其中所述受试者具有患脱髓鞘疾病的风险。22. 权利要求19-21任一项所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病影响中枢神经系统。23. 权利要求22所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为特发性炎性脱髓鞘疾病。24. 权利要求22所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症、神经病、脑桥中央 髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎或脑白质营 养不良。25. 权利要求24所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症。26. 权利要求19-21任一项所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病影响外周神经系统。27. 权利要求26所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓 鞘性多发性神经根神经病、抗-MAG外周神经病、腓骨肌萎缩症、缺铜症或进行性炎性神经 病。28. 权利要求1-24任一项所述的方法，其还包括制备所述组合物。29. 权利要求1-28任一项所述的方法，其还包括在给予所述组合物后测定受试者中抗 至少一种髓鞘蛋白的抗体。30. 用于治疗受试者的脱髓鞘疾病的方法，其包括给予受试者药学上可接受的疫苗组 合物，所述疫苗组合物包含至少第一ASGPR抗体或其结合片段，其连接到髓鞘碱性蛋白 (MBP)和/或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG)或其抗原片段。31. 权利要求30所述的方法，其中所述ASGPR抗体或其结合片段融合到MBP或MOG或其抗 原片段。32. 权利要求30或31所述的方法，其中多次给予所述受试者疫苗组合物。33. 权利要求32所述的方法，其中所述组合物经口、静脉内、皮下、皮内、肌内、经鼻、通 过注射、通过吸入、经粘膜和/或使用雾化器给予。34. 权利要求30-33任一项所述的方法，其中所述受试者显示脱髓鞘疾病的一种或多种 症状。35. 权利要求30-33任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有脱髓鞘疾病。36. 权利要求30-33任一项所述的方法，其中所述受试者具有患脱髓鞘疾病的风险。37. 权利要求34-36任一项所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病影响中枢神经系统。38. 权利要求37所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为特发性炎性脱髓鞘疾病。39. 权利要求38所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症、神经病、脑桥中央 髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎或脑白质营 养不良。40. 权利要求39所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症。41. 权利要求34-36任一项所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病影响外周神经系统。42. 权利要求41所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓 鞘性多发性神经根神经病、抗-MAG外周神经病变、腓骨肌萎缩症、缺铜症或进行性炎性神经 病。43. 权利要求30-42任一项所述的方法，其还包括制备所述组合物。44. 权利要求30-43任一项所述的方法，其还包括在给予所述组合物后测定受试者中抗 至少一种髓鞘蛋白的抗体。45. -种组合物，其包含至少第一ASGPR抗体或其结合片段，其连接到髓鞘碱性蛋白 (MBP)和/或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG)或其抗原片段。46. 权利要求45所述的组合物，其中所述树突细胞抗体使用连接肽连接到所述髓鞘蛋 白或其抗原片段。47. 权利要求45-46任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种致耐受性佐 剂。48. 权利要求47所述的组合物，其中所述致耐受性佐剂连接到所述树突细胞靶向复合 物。49. 权利要求48所述的组合物，其中所述致耐受性佐剂缀合到所述树突细胞靶向复合 物。50. 权利要求48所述的组合物，其中所述致耐受性佐剂融合到所述树突细胞抗体或其 靶向片段，和/或融合到至少一种髓鞘蛋白。51. 权利要求47-50任一项所述的组合物，其中所述致耐受性佐剂选自IL-10、地塞米 松、FK506(他克莫司）、霍乱毒素 B亚单位、大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位、IFN-β、糖皮质激 素、维生素 D3和维生素 D3类似物。52. 权利要求45-51任一项所述的组合物，其中所述树突细胞抗体通过结合多肽连接到 至少一种髓鞘蛋白或其抗原片段。53. 权利要求52所述的组合物，其中所述结合多肽为锚定蛋白和粘连蛋白。
【专利摘要】本发明提供了使用融合到髓鞘碱性蛋白或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的树突细胞抗-ASGPR抗体治疗多发性硬化症的方法和组合物。
【IPC分类】A61K39/00
【公开号】CN105555303
【申请号】CN201480047070
【发明人】吴相坤, G·祖拉夫斯基
【申请人】贝勒研究院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年6月27日
【公告号】CA2916694A1, EP3013362A1, WO2014210540A1