氯唑沙宗作为探针药物在测定人体对亚硝胺类化合物代谢活性方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于探针药物技术领域，具体涉及氯唑沙宗作为探针药物的应用，如氯唑沙宗作为探针药物在测定人体内CYP2E1对亚硝胺类化合物代谢活性方面的应用，以及其作为探针药物在筛查肝脏疾病(如肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等)以及其他与亚硝胺类相关疾病(如食管癌)高危人群的应用。
【背景技术】
[0002]肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，它具有恶性度高、进展快、侵袭性强、预后差和死亡率高等特点。新近数据显示:我国肝癌患者数量约占全世界患者总数的55%，每年约引起11万人死亡，死亡率位居恶性肿瘤前列。临床上发现肝癌时大多在中晚期，已错过最佳治疗时机，至今尚缺乏有效的治疗方法及药物，预后较差。因此，肝癌的预防和早治至关重要。
[0003]食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。我国在20世纪50年代末就开始了食管癌防治的研究，在高发区农村建立防治研究点，以求早期发现、早期治疗，提高治愈率。
[0004]亚硝胺类化合物是目前公认的前致癌物，食物中亚硝胺类化合物的含量与各种肿瘤的发生密切相关。2015年10月26日，世界卫生组织(WHO)下属国际癌症研究机构(IARC)发布的最新报告中，将火腿、香肠等加工肉制品列入“一类致癌物”，亚硝胺类化合物便是其主要致癌成分之一。在众多亚硝胺类化合物中，二甲基亚硝胺(DMN)和二乙基亚硝胺(DEN)最为重要，广泛存在于肉制品、鱼产品、腌制产品以及蔬菜等食物中。流行病学关于112例浙江省海岛居民肝癌的影响因素的病例对照研究发现:吃腌制品之I次/周为肝癌的危险因素，其OR值为5.70。广西扶绥肝癌高发村日常饮用水中DMN和DEN的含量与肝癌的发生呈正相关。对泰国和尼日利亚肝癌高发区的饮食调查研究也有类似发现。在食管癌高发区的膳食、饮水、酸菜、甚至病人的唾液中，检测的亚硝胺类化合物的含量均远远高于低发区。
[0005]亚硝胺类化合物作为前致癌物，在体内需经过肝脏CYP2E1代谢活化生成致癌物质。如腿N和DEN经CYP2E1代谢活化后，一方面生成的甲醛和乙醛，可与DNA形成稳定的加合物或与蛋白质交联，最终导致基因突变和DNA的断裂;另一方面生成的烷基化合物作为烷化剂，可使DNA和RNA分子中的鸟嘌呤发生烷基化，使DNA、RNA复制错误，从而引起肿瘤。但研究发现，同一地区包括肝癌高发区和食管癌高发区，在DMN和DEN日常暴露量相同的情况下，不同个体患肝癌或食管癌的风险不同，即不同个体在接触相同暴露量亚硝胺类的情况下，经CYP2E1代谢活化生成的致癌物的量不同，这提示亚硝胺类化合物致肝癌或食管癌的易感性可能与CYP2E1的代谢活性有关。因此，提前检测人体CYP2E1代谢亚硝胺类化合物的活性，这对肝癌或食管癌的早期预防至关重要。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种氯唑沙宗作为探针药物的新应用，如氯唑沙宗作为探针药物在测定人体内CYP2E1对亚硝胺类化合物代谢活性方面的应用，以及其作为探针药物在筛查肝脏疾病(如肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等)以及其他与亚硝胺类相关疾病(食管癌)高危人群的应用。
[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
氯唑沙宗作为探针药物的新应用，具体为:氯唑沙宗作为探针药物在测定人体内CYP2E1对亚硝胺类化合物代谢活性方面的应用，以及氯唑沙宗作为探针药物探测肝脏疾病患者或食管癌患者体内CYP2E1对亚硝胺类化合物代谢活性方面的应用。也就是说，本发明发现了氯唑沙宗的一种新用途，即氯唑沙宗作为探针药物在筛查肝脏疾病(如肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等)以及其他与亚硝胺类相关疾病(如食管癌)高危人群的应用。
[0008]氯唑沙宗(CZX)现为中枢性肌肉松弛剂，它主要作用于中枢神经系统，在脊椎和大脑下皮层区抑制多突反射弧，从而对痉挛性骨骼肌产生肌肉松弛作用，达到止痛的效果。目前仅用于各种急、慢性软组织(肌肉、韧带、筋膜)扭伤、挫伤、运动后肌肉劳损所引起的疼痛，以及由中枢神经病变引起的肌肉痉挛，慢性筋膜炎等。CZX作为一种中枢性肌松剂，其人体内药动学国内外已有大量报道，但其作为CYP2E1的探针药物，尚无用于探测人体内CYP2E1代谢亚硝胺类化合物活性的研究。尽管CZX是CYP2E1的体内探针，但已有研究报道，同一 CYP亚型对其不同探针的代谢活性可能无明显相关，如CYP3A4对其探针咪达唑仑和睾酮代谢的固有清除率不存在相关性。因此，要用CZX作为探针反映CYP2E1代谢亚硝胺类的活性，需要研究CZX与亚硝胺类代谢活性的相关性。
[0009]本发明经研究发现:人体对氯唑沙宗的清除能力可反映人体对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物的量的高低；如:①正常人肝微粒体对氯唑沙宗的清除能力与其对亚硝胺类代谢产生致癌物量的高低相关性良好;②肝癌病人肝硬化肝微粒体对氯唑沙宗的清除能力与其对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物量的高低相关性良好;③肝癌病人肝硬化肝微粒体对氯唑沙宗和亚硝胺类化合物的代谢活性均显著高于正常人肝微粒体对氯唑沙宗和亚硝胺类化合物的代谢活性。因此，氯唑沙宗可作为一种筛查肝癌高危人群的探针药物使用，也可作为一种筛查其他肝脏疾病(如肝炎、肝纤维化、肝硬化等)以及其他与亚硝胺类相关疾病(如食管癌)高危人群的探针药物使用。
[0010]本发明创新性的采用CZX代替亚硝胺类化合物作为CYP2E1的体内探针，研究人体内CYP2E1代谢亚硝胺类化合物的活性，以期有助于肝脏疾病(如肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等)以及其他与亚硝胺类相关疾病(如食管癌)的早期预防。
【附图说明】
[0011 ] 图1为正常人肝对CZX、D丽和DEN代谢活性的相关性(n=83)；图中，CZX:氯唑沙宗；DMN: 二甲基亚硝胺;DEN: 二乙基亚硝胺;CLmt:固有清除率；
图2为肝癌病人肝硬化肝对CZX、DMN和DEN代谢活性的相关性(n=93);图中，CZX:氯唑沙宗;DMN: 二甲基亚硝胺;DEN: 二乙基亚硝胺;CLmt:固有清除率；
图3为肝癌病人肝硬化肝和正常人肝对CZX、DMN和DEN代谢活性的比较；图中，Normal:正常组，n=83;HCC:肝癌肝硬化组，n=93;CZX:氯唑沙宗；DMN: 二甲基亚硝胺;DEN: 二乙基亚硝胺;CLint:固有清除率。
【具体实施方式】
[0012]以下对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0013]1.正常人肝微粒体制备 1.1正常人肝标本收集
83例正常人肝标本为临床确诊的肝血管瘤、胆结石、肝囊腺瘤、胆囊癌患者手术切除的瘤旁正常肝组织，正常的肝组织是指通过肝功能检查、肝影像学检查和肝组织病理学检查均正常的健康肝。手术切除后迅速置于液氮中保存。
[0014]1.2肝微粒体制备
采用差速离心法，肝标本取出解冻，称重。按1:4(W/V)比例加入50mM Tris-HCl(pH7.0)(含150mM KCl，2mM EDTA)缓冲液，用玻璃匀浆器研磨制成肝匀浆。于4°C 9000 Xg离心20min，取上清液于4°C 100000 X g离心60min;所得沉淀重悬于4ml 0.15M Tris-HCl(pH7.6)中，于4°C 100000 X g再离心60min ；取沉淀按1:2(W/V)比例加入0.25M蔗糖重悬液，最终每克肝组织制备2ml微粒体混悬液，分装后先保存于液氮中过夜，次日转移至-80°C长期保存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。用Bradford方法测定微粒体蛋白含量(mg/ml) ο
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