一种双重适配体修饰的靶向给药系统及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，设及药物递送系统，具体设及一种双重适配体修饰的 祀向给药系统及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，临床上对于肿瘤治疗的传统方法包括手术治疗、放射治疗、化学治疗等常 规手段。其中，化疗作为一种经典且重要的治疗手段，虽然不断有新的化疗药物和化疗方案 推出，然而多药耐药问题不仅限制了化疗疗效，同时也是导致肿瘤复发转移的重要原因，是 目前临床丞待解决的问题。随着分子生物学手段的发展和完善，W及癌基因和抑癌基因的 相继发现，肿瘤的基因治疗发展非常迅猛，在肿瘤治疗中体现出不可估量的作用。
[0003] 人第10号染色体缺失的憐酸酶及张力蛋白同源的基因（Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene,PTEN)是一种新的抑癌基因。现已证实， PTEN基因的突变、失活与多种肿瘤的发生发展密切相关，成为继pl6、p21和p53后又一具有 重要意义的抑癌基因。目前很多研究表明，将基因治疗与化疗联合使用优于单一的治疗方 式。当前列腺的一种被称为CARNs的管腔细胞的PTEN基因失活后，可导致前列腺癌的发生。
[0004] 适配体是一小段经体外筛选得到的能与相应的配体进行高亲和力和强特异性结 合的序列，具有很好的祀向性。前列腺癌细胞根据其特异性膜抗原(PSMA)的表达，可分为 PSMA阳性细胞和PSMA阴性细胞。有文献报道，RNA适配体AlO是PSMA阳性细胞的特异性适配 体，其最新优化序列A10-3.化UlO具有更强的祀向效率;肤适配体DUP-I是PSMA阴性细胞的 特异性配体，而且DUP-I还具有肿瘤组织穿透性。基于PSMA阳性和PSMA阴性细胞是形成前列 腺癌的两大代表性细胞，本发明将采用A10-3.2适配体祀向于PSMA阳性细胞，DUP-I适配体 祀向于PSMA阴性细胞，把化疗药物和基因治疗药物带到特定的前列腺癌细胞发挥抗癌作 用。由于在W往的化疗和基因治疗中，由于缺乏祀向性，各种药物在杀死癌细胞的同时，对 正常组织和正常细胞也造成了致命的打击，出现了很多副作用，因此祀向治疗越来越受到 人们的重视，成为研究的热点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有抗肿瘤药物祀向系统存在不足，提供一种新的祀向给药 系统，该新型给药系统不仅具有祀向性，该给药系统能同时把化疗药物和基因治疗药物带 到特定部位产生协同抗癌作用。
[0006] 我们通过研究发现转染了 PTEN基因的耐药前列腺癌细胞对阿霉素的敏感性增强， 而且能一定程度逆转耐药细胞株的耐药性；同时阿霉素反过来也会增强PTEN的抑癌活性。 根据PTEN基因与阿霉素在抑瘤方面显示的运种协同效应。本发明用功能性PEG为连接臂，利 用酷胺反应原理，将适配体DUP-I和A10-3.2同时连接到携载抑癌基因PTEN的腺病毒表面， 再利用DOX能与RNA双链CG序列牢固结合的特点，构建一种新型的祀向给药系统。
[0007] 本发明的祀向给药系统由聚乙二醇、肤适配体DUP-I、RNA适配体A10-3.2、含PTEN 的重组腺病毒Ad5和抗肿瘤药物组成。
[0008] 本发明的祀向给药系统采用聚乙二醇为连接臂，将RNA适配体A10-3.2和肤适配体 DUP-I，通过化学步骤连接到含有抑癌基因PTEN的重组腺病毒Ad5表面，然后将阿霉素W嵌 入作用方式与RNA双链适配体Al 0-3.2结合得到。
[0009] 上述肤适配体DUP-I的氨基酸序列为:FRPNRAQDYNTN;RNA适配体A10-3.2的序列 为：5 '-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU-3 '。
[0010] 上述的聚乙二醇的重均分子量可W为400-8000，优选2000-5000。
[0011] 本发明所述抗肿瘤药物选自临床上一线和二线抗前列腺癌药物，首选盐酸阿霉素 (DOX) O
[0012] 本发明同时还设及上述祀向给药系统的制备方法，该祀向给药系统是W聚乙二醇 为连接臂，将RNA适配体A10-3.2和肤适配体DUP-I，通过化学步骤连接到含有抑癌基因PTEN 的重组腺病毒Ad5表面，再将阿霉素W嵌入作用方式与RNA双链适配体A10-3.2结合而得到。
[0013] 本发明按下述的具体方法制备该祀向给药系统：
[0014] 第一步：首先取一定量的聚乙二醇溶液，然后再加入N-径基下二酷亚胺和碳二亚 胺盐酸盐，用MES缓冲液调节抑至6.0,在室溫下揽拌化，W随机活化聚乙二醇中的簇基，然 后加入腺病毒原液，于37°C揽拌反应化(300r/min)，制备得到PEG-AdS;
[001引第二步:取精制得到的阳G-AdS，加入N-径基T二酷亚胺溶液和碳二亚胺盐酸盐溶 液，用MES缓冲液调节抑至6.0，在室溫下轻柔揽拌，解育Ih，W活化精制阳G-AdS中另一个未 反应的簇基，然后向反应液中加入DUP-I适配体溶液，于37°C揽拌避光反应化(300r/min)， 制备得到DUP-I-PEG-AdS;
[0016] 第S步:取精制得到的DUP-I-PEG-AdS，加入N-径基下二酷亚胺溶液和碳二亚胺盐 酸盐溶液，用MES缓冲液调节抑至6.0，在室溫下轻柔揽拌，解育化，W活化精制DUP-I-WG-Ad5中其余未反应的簇基，然后用MES缓冲液调节反应液pH至7.0,加入浓度A10-3.2适配体 溶液，于37°C揽拌避光反应化(300r/min)，制备得到A10-3.2/DUP-1-阳G-AdS，最后用分子 截留量为100邸的超滤离屯、管进行超滤离屯、，洗涂后得到精制的A10-3.2/DUP-1-PEG-Ad5;
[0017] 第四步:将精制的A10-3.2/DUP-1-阳G-AdS反应液稀释，根据DOX能嵌入到双链RNA 适配体A10-3.2中的最大量，于反应液中加入一定量的D0X，再加入一定量的无水DMS0,于室 溫下揽拌避光反应4她，然后经过超滤离屯、、洗涂后，得到目标给药系统。
[0018] 本发明设及的祀向给药系统的成功构建，可为恶性肿瘤的有效治疗提供一个高 效、有力的药物转运平台，运对发展肿瘤分子祀向治疗具有重要的指导作用和实际价值，本 发明设及的祀向给药系统可用于在制备祀向治疗前列腺癌药物中的应用。
【附图说明】
[0019] 图1是该祀向给药系统的示意图。
[0020] 图2是PEG化的Ad5的SDS-PAGE电泳检测结果。
[0021] 图3是DUP-I适配体的质谱检测报告。
[0022] 图4是单链适配体A10-3.2的质谱检测报告。
[0023] 图5是D0X、DUP-1适配体和A10-3.2适配体的巧光标准曲线。
[0024] 图6是加入不同比例A10-3.2适配体后的DOX巧光光谱。
[0025]图7是加入不同比例AlO-3.2适配体后的DOX巧光强度。
[00%] 图8是LNCaP细胞加入8组药物4她后的细胞形态。
[0027] 图9是PC3细胞加入8组药物4她后的细胞形态。
[0028] 图10是各组药物对细胞杀伤作用的结晶紫染色结果。
[0029] 图11是各组药物抑制细胞生长的MTT实验结果。
[0030] 图12是LNCaP和PC3细胞对目标给药系统ADDP-AdS摄取量的激光共聚焦结果。
[0031] 图13是各给药组小鼠体重变化曲线。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1: PEG-AdS的合成
[0033] 首先取浓度为6. OSiiM的C00H-PEG2000-C00田容液100化，然后再加入浓度为6. OSiiM 的NHS(N-^基下二酷亚胺)溶液100化和浓度为12. IiiM的抓C(碳二亚胺盐酸盐)溶液IO^L, 用MES缓冲液调节抑至6.0，在室溫下轻柔揽拌，解育化，W随机活化C00H-PEG2000-C00H中 的簇基。然后加入20化腺病毒原液，用水定容至40化L，于37°C，揽拌、反应化(300r/min)，制 备得到PEG-Ad5。最后，用分子截留量为100邸的超滤离屯、管进行超滤离屯、，洗涂后得到精制 的阳G-Ad5。将精制的阳G-AdS用SDS-PAGE电泳进行修饰情况的检测。W考马斯亮兰进行蛋 白质染色，Wo. Imol/L舰溶液进行PEG染色。
[0034] 将经过预处理的样品W相同的顺序和数量上样于两块聚丙締酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的凝胶上。两块凝胶同时