LN化P和PC3的细胞形态学影响实验之后，我们进一步用结晶紫染色 实验比较各组药物对前列腺癌细胞LNCaP(PSMA+)、前列腺癌细胞PC-3(PSMA-)、人正常前列 腺细胞WPMY-1和肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用。结果如图11，从图中我们可W看出LN化P 细胞的D孔和PC3细胞的D孔的颜色最浅，几乎接近于无色，说明第四组药物ADDP-AdS对其杀 伤作用最大;LN化P细胞的A、E、F孔，PC3细胞的A、G孔，HepG2细胞的A孔的底部有轻微的蓝色 出现，说明运些孔所对应的药物对孔里的杀伤作用也很大，仅次于D组药物;WPMY-I细胞的 全部8个孔的颜色都较深，说明药物对运个细胞毒性不大;PBS对照组的四个细胞的颜色最 深结果如附图10所示。
[0111] 附图10各组药物对细胞杀伤作用的结晶紫染色结果。图中数字A-H分别依次代表8 个给药组，即为A: AdS-PTEN组；B: Ad5-eGFP组；C:单独DOX组；D: Al0-3.2 (DOX)/DUP-I-PEG-Ad5(ADDP-AdS)组；E:A10-3.2/DUP-1-PEG-Ad5(ADP-AdS)组；F:A10-3.2-PEG-Ad5(AP-AdS) 组;G: DUP-I -PEG-AdS (DP-AdS)组;H: PBS 对照组。
[0112] (3)、各组药物对细胞生长的抑制作用：
[0113] 通过MTT法检测4她后各个给药组对人前列腺癌细胞LNCaP(PSMA+)、人前列腺癌细 胞PC3(PSMA-)、人正常前列腺上皮细胞WPMY-I和人肝癌细胞化pG2的体外生长抑制效率，得 到，结果如附图11所示，结果表明各组药物对人正常前列腺细胞WPMY-I的抑制效率都不明 显；对于用来做对照的非前列腺癌细胞化pG2来说，除了A、B、C和H组外，其余四组药物对 HepG2细胞的抑制作用比对两个前列腺癌细胞的抑制作用都要弱很多；两个前列腺癌细胞 LNCaP(PSMA+)和PC3(PSMA-)，除PBS对照组外，其余7组药物对其都有比较强的抑制效应，其 中第四组药物ADDP-AdS对其抑制最明显，另外第六组药物AP-AdS对LN化巧巧制作用强而对 PC3抑制作用弱，而第屯组药物DP-AdS对PC3抑制作用强而对1肥3巧巧制作用弱，说明适配体 A10-3.2对PSMA阳性的LN化P细胞有祀向作用，适配体DUP-I对PSMA阴性的PC3细胞有祀向作 用。
[0114] 附图11各组药物抑制细胞生长的MTT实验结果。图中的横坐标A-H分别依次代表8 个给药组，即为A: AdS-PTEN组；B: Ad5-eGFP组；C:单独DOX组；D: Al0-3.2 (DOX)/DUP-I-PEG-Ad5(ADDP-AdS)组；E:A10-3.2/DUP-1-PEG-Ad5(ADP-AdS)组；F:A10-3.2-PEG-Ad5(AP-AdS) 组;G: DUP-I -PEG-AdS (DP-AdS)组;H: PBS 对照组。
[0115] (4)、目标给药系统A孤P-AdS的细胞摄取量：
[0116] 从各给药组对各个不同细胞的生长抑制情况可W看出，给药系统ADDP-AdS对前列 腺癌细胞LNCaP和PC3的作用最强，所W我们进一步研究前列腺癌细胞LNCaP和PC3对目标给 药系统ADDP-AdS的摄取情况，结果附图12所示。从附图12可W看出，对于相同剂量的ADDP-Ad5，LNCaP细胞中阿霉素的巧光强度要明显强于PC3细胞中的巧光强度，说明LN化P细胞对 ADDP-AdS的摄取量要多于PC3细胞的摄取量。而RNA适配体A10-3.2对LN化P细胞具有祀向作 用，肤适配体DUP-I对PC3细胞具有祀向作用，通过两个细胞中DOX巧光强度的不同也能说明 适配体的祀向作用。
[0117] 试验例2:目标给药系统A孤P-AdS小鼠急性毒性实验
[0118] 实验期间，每组动物饮食、毛色和活动均正常，生长发育良好，并无异常行为和中 毒症状，无死亡情况出现。各组小鼠体重呈平稳增长趋势，S个不同剂量的目标复合物AlO-3.2(D0X)/DUP-1-PEG-Ad5(ADDP-Ad5)给药组和生理盐水对照组比较差异无统计学意义(P〉 0.05)。各组小鼠体重变化如附图13所示。
[0119] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种靶向给药系统，其特征在于，由聚乙二醇、肽适配体DUP-1、RNA适配体A10-3.2、 含PTEN的重组腺病毒Ad5和抗肿瘤药物组成。2. 根据权利要求1所述的靶向给药系统，其特征在于，采用聚乙二醇为连接臂，将RNA适 配体A10-3.2和肽适配体DUP-1，通过化学步骤连接到含有抑癌基因 PTEN的重组腺病毒Ad5 表面，然后将阿霉素以嵌入作用方式与RNA双链适配体A10-3.2结合得到。3. 根据权利要求1-2所述的靶向给药系统，其特征在于所述RNA适配体A10-3.2与抗肿 瘤药物的浓度比为2:1。4. 根据权利要求1-2所述的靶向给药系统，其特征在于，所述肽适配体DUP-1的氨基酸 序列为：FRPNRAQDYNTN，所述RNA适配体A10-3 · 2的序列为：5 ' -GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU-3，。5. 根据权利要求1-2所述所述的靶向给药系统，其特征在于，所述抗肿瘤药物为盐酸阿 霉素。6. 根据权利要求1-2所述的靶向给药系统，其特征是所述的聚乙二醇的重均分子量为 400-8000〇7. 根据权利要求5所述的靶向给药系统，其特征是所述的聚乙二醇的重均分子量为 2000-5000〇8. 权利要求1-2所述的靶向给药系统在制备靶向治疗前列腺癌药物中的用途。9. 权利要求1所述的靶向给药系统的制备方法，其具体步骤如下： 第一步：首先取一定量的聚乙二醇溶液，然后再加入N-羟基丁二酰亚胺和碳二亚胺盐 酸盐，用MES缓冲液调节pH至6.0,在室温下搅拌lh，以随机活化聚乙二醇中的羧基，然后加 入腺病毒原液，于37°C搅拌反应2h(300r/min)，制备得到PEG-Ad5; 第二步：取精制得到的PEG-Ad5，加入N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺盐酸盐溶液， 用MES缓冲液调节pH至6.0,在室温下轻柔搅拌，孵育lh，以活化精制PEG-Ad5中另一个未反 应的羧基，然后向反应液中加入DUP-1适配体溶液，于37 °C搅拌避光反应2h(300r/min)，制 备得到DUP-1-PEG-Ad5; 第三步:取精制得到的DUP-1-PEG-Ad5，加入N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺盐酸盐 溶液，用MES缓冲液调节pH至6.0，在室温下轻柔搅拌，孵育lh，以活化精制DUP-1-PEG-Ad5中 其余未反应的羧基，然后用MES缓冲液调节反应液pH至7.0，加入浓度A10-3.2适配体溶液， 于37°C搅拌避光反应2h(300r/min)，制备得到A10-3.2/DUP-1-PEG-Ad5,最后用分子截留量 为100KD的超滤离心管进行超滤离心，洗涤后得到精制的A10-3.2/DUP-1-PEG-Ad5; 第四步:将精制的A10-3.2/DUP-1-PEG-Ad5反应液稀释，根据DOX能嵌入到双链RNA适配 体A10-3.2中的最大量，于反应液中加入一定量的DOX，再加入一定量的无水DMSO，于室温下 搅拌避光反应48h，然后经过超滤离心、洗涤后，得到目标给药系统。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及药物递送系统，具体涉及一种双重适配体修饰的靶向给药系统及其制备方法。本发明针对现有抗肿瘤药物靶向给药系统存在的不足，提供一种新的靶向给药系统，该新型给药系统不仅具有靶向性，该给药系统能同时把化疗药物和基因治疗药物带到特定部位产生协同抗癌作用。本发明的靶向给药系统由聚乙二醇、肽适配体DUP-1、RNA适配体A10-3.2、含PTEN的重组腺病毒Ad5和抗肿瘤药物组成，该靶向给药系统的成功构建，可为恶性肿瘤的有效治疗提供一个高效、有力的药物转运平台，这对发展肿瘤分子靶向治疗具有重要的作用和实际价值。
【IPC分类】A61K31/704, A61K48/00, A61K47/48, A61P35/00
【公开号】CN105664177
【申请号】CN201610217334
【发明人】钟志容, 刘中兵, 景沛, 张孝琴
【申请人】钟志容
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月8日