)40了4(终浓度0.1禮)。预孵育511^11，加入熟0?!1启动反应，37°(:孵育201^11，放入冰水中终止反应，加入11111二氯甲烧，祸旋混合3min，4500rpm离心1min，吸取下层有机相0.8mI，于40°C氮气吹干，100μ?流动相复溶，取Ι0μ?进样。
[0038]标准曲线:于孵育体系中加入系列浓度的甲醛溶液10μ1，终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.12、I.56和0.78μΜ，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，60 °C孵育20min，按“样品处理”项操作(不加NADPH)。以样品峰面积(A)为横坐标，样品浓度(C)为纵坐标求其回归方程。
[0039]专属性:观察在该色谱条件下微粒体中杂质是否干扰样品峰的测定。
[0040 ] 精密度:于90 μ I微粒体中加入10μ I的甲醛(不加NADPH )，配制成甲醛的系列浓度为1.56、12.5和100μΜ的溶液，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，60 °C孵育20min，按“样品处理”项下操作，测定日内、日间精密度。
[0041 ] 回收率:于90μ1微粒体中分别加入10μ1的甲醛(不加NADPH)，配制成甲醛的系列浓度为1.56、12.5和100μΜ的溶液，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，60 V孵育20min，按“样品处理”项操作，测定样品峰面积(Al)。另取10μ1的甲醛(不加NADPH)，配制成甲醛的系列浓度为1.56、12.5和ΙΟΟμΜ的溶液，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，不经提取，直接进样，测定样品峰面积(Α2)。两组峰面积之比(Al/ Α2)即为微粒体中2，4_二硝基苯肼乙醛腙的提取回收率。
[0042]稳定性:于空白微粒体中分别加入10μ1的甲醛(不加NADPH)，配制成甲醛的系列浓度为1.56、12.5和ΙΟΟμΜ的溶液，再加入过量的2，4-二硝苯腈溶液，60°C孵育20min，将样品分为3组，按“样品处理”项下操作第一组立刻进样，第二组室温下放置4h进样，第三组4 V下放置24h进样。考察在上述条件下放置的稳定性。
[0043]最适蛋白浓度的确定:反应体系中加入微粒体蛋白，其浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.lS0.5mg.1111^,37 °C水浴分别孵育20min。考察微粒体蛋白浓度对DEN代谢的影响。
[0044]最适反应时间的确定:反应体系(蛋白浓度0.3mg.ml—1)中加入NADPH启动反应，于37 0C水浴分别孵育5、10、20、30及40min，考察孵育时间对DEN代谢的影响。
[0045]人肝微粒体CYP酶动力学参数的测定:反应体系中底物DEN的浓度为0.78?100μΜ，以代谢产物的生物转化程度(TR)为反应速度，计算KjPVmax<3TR(pmol.min—1.mg—1MAC\1000)/化\1')，其中八(:为代谢产物2，4-二硝基苯肼乙醛腙的浓度化10，8为微粒体蛋白的浓度(mg.ml—1)，T为孵育时间(min);
采用上述检测条件，测定83例正常人肝CYP2E1代谢DEN的固有清除率。
[0046]3.正常人肝微粒体对CZX、DMN和DEN代谢活性的相关性
对上述83例正常人肝CYP2E1代谢CZX、DMN和DEN的固有清除率进行相关性统计分析，结果发现:正常人肝CYP2EI对CZX、DMN和DEN代谢的固有清除率相关性良好(见图1)。此研究结果表明:正常人肝对CZX代谢的固有清除率可很好的反映其对DMN和DEN代谢的固有清除率，即正常人肝对CZX的代谢活性可用于反映其对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物的能力。
[0047]4.肝癌病人肝硬化肝微粒体制备 4.1肝癌病人肝硬化肝标本收集
93例肝癌病人肝硬化肝标本为临床确诊的HBV和/或HCV表面抗原阳性合并肝硬化的原发性肝癌患者手术切除的距瘤旁>2cm的肝硬化组织，为确保获得肝癌患者肝硬化组织，肝脏来源应经病理学检查纤维化分级达S4级即肝硬化级别。手术切除后迅速置于液氮中保存。
[0048]4.2肝微粒体制备
肝癌病人肝硬化肝微粒体制备方法与上述正常人肝微粒体制备方法一致。
[0049]5.肝癌病人肝硬化肝微粒体CYP2E1代谢活性
选用CZX、DMN和DEN三种底物，检测93例肝癌病人肝硬化肝微粒体CYP2E1的代谢活性。检测分析方法与上述正常人肝微粒体CYP2E1代谢活性一致。
[0050]6.肝癌病人肝硬化肝微粒体对CZX、DMN和DEN代谢活性的相关性
对上述93例肝癌病人肝硬化肝CYP2E1代谢CZX、DMN和DEN的固有清除率进行相关性统计分析，结果发现:肝癌病人肝硬化肝CYP2E1对CZX、DMN和DEN代谢的固有清除率相关性良好(见图2)。此研究结果表明:肝癌病人肝硬化肝对CZX代谢的固有清除率可很好的反映其对DMN和DEN代谢的固有清除率，即肝癌病人肝硬化肝对CZX的代谢活性可用于反映其对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物的能力。
[0051 ] 7.肝癌病人肝硬化肝CYP2E1代谢活性变化
以上几部分研究证实:正常人肝和肝癌病人肝硬化肝对CZX的代谢活性可用于反映其对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物的能力。但要证明CZX可以用于筛查肝癌高危人群，还需要进一步证明正常人肝和肝癌病人肝硬化肝对CZX、DMN和DEN的代谢活性有差异，这种差异可用以从人群中筛查出肝癌的高危人群。基于此，对上述正常人肝和肝癌病人肝硬化肝对CZX、DMN和DEN的代谢活性进行统计分析，结果发现肝癌病人肝硬化肝对CZX、DMN和DEN的代谢活性显著高于正常人肝(见图3)。
[0052] 8.总结本研究第一步证实了正常人肝对CZX的代谢活性可用于反映其对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物的能力，第二步证实了肝癌病人肝硬化肝对CZX的代谢活性可用于反映其对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物的能力，第三步证实了正常人肝和肝癌病人肝硬化肝对CZX、DMN和DEN的代谢活性有差异。通过以上研究证明，CZX可以作为用于筛查肝癌高危人群的探针药物，也可作为一种筛查其他肝脏疾病(如肝炎、肝纤维化、肝硬化等)以及其他与亚硝胺类相关疾病(食管癌)高危人群的探针药物使用。
【主权项】
1.氯唑沙宗作为探针药物的应用，其特征在于，氯唑沙宗作为探针药物在测定人体内CYP2E1对亚硝胺类化合物代谢活性方面的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，氯唑沙宗作为探针药物在测定肝脏疾病患者或食管癌患者体内CYP2E1对亚硝胺类化合物代谢活性方面的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝脏疾病为肝炎、肝纤维化、肝硬化或肝癌。
【专利摘要】本发明涉及氯唑沙宗作为探针药物在测定人体内细胞色素？P4502E1（CYP2E1）对亚硝胺类化合物代谢活性方面的新应用。经研究发现，人体对氯唑沙宗的清除能力可反映人体对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物的能力，如：①正常人肝微粒体对氯唑沙宗的清除能力与其对亚硝胺类代谢产生致癌物量的高低相关性良好；②肝癌病人肝硬化肝微粒体对氯唑沙宗的清除能力与其对亚硝胺类化合物代谢产生致癌物量的高低相关性良好；③肝癌病人肝硬化肝微粒体对氯唑沙宗和亚硝胺类化合物的代谢活性均显著高于正常人肝微粒体对氯唑沙宗和亚硝胺类化合物的代谢活性。因此氯唑沙宗可作为一种筛查肝癌、其他肝脏疾病（如肝炎、肝纤维化、肝硬化等）及食管癌高危人群的探针药物使用。
【IPC分类】A61K49/00
【公开号】CN105664181
【申请号】CN201610211884
【发明人】乔海灵, 郜娜, 孙宝, 高洁
【申请人】乔海灵
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月7日