2g，30%乙醇 水溶液洗脱部分3lg，50 %乙醇水溶液洗脱部分75g，70 %乙醇水溶液洗脱部分68g，和95 % 乙醇水溶液洗脱部分43g。
[0046] 实施例4:当归提取物对铜绿假单胞菌的生长抑制效果实验
[0047] 取实施1所制得的当归提取物及各溶剂萃取部分进行了对铜绿假单胞菌的菌生长 抑制实验。具体试验方法如下：
[0048]采用经典的二倍稀释法测定。取13支无菌试管，第1管加1.8mL营养肉汤，第2~13 管每管各加 lmL营养肉汤;在无菌操作条件下，吸取稀释好的药物0.2mL加入到第1管，混匀 后吸取lmL入第2管中，依次倍比稀释至第13管，最后保持其浓度依次是512yg/mL，256yg/ mL，128yg/mL，64yg/mL，32yg/mL，16yg/mL，8yg/mL，4yg/mL，2yg/mL，lyg/mL，0 · 5yg/mL。各管 均加入供试菌液0.05mL，混匀之后置于37°C培养24h，在生长对照管的细菌生长状况良好的 前提下，以肉眼观察药物最低浓度管无菌生长者，即为该受试药物的MIC。阳性对照物为:呋 喃酮 C31((Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)_ 呋喃酮)-文献(EMB0.J.2003,22,3803-3815)报 道的生物膜抑制活性最强的化合物。
[0049] 表1当归提取物各萃取层对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC，g/mL)
[0050]
[0051 ] "+"表示混浊(细菌生长良好），表示澄清(细菌生长受抑制）
[0052]实施例5:当归提取物的生物膜抑制效果实验
[0053]取实施1所制得的当归提取物及各溶剂萃取部分进行了对铜绿假单胞菌生物膜的 抑制活性。
[0054]具体试验方法如下：依照细菌粘附到微量聚氯乙烯96孔板的能力进行分析。将100 yL含有0.2%酪蛋氨酸和甘油加入稀释培养过夜的菌液(0D6Q()，0.05)，加入到96孔微量板的 各孔中。然后每孔加入系列浓度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC)的测试样品。同时，加入 同当量的呋喃酮C31((Z)-4-溴-5-(溴亚甲基）-2(5H)_呋喃酮）-文献(EMB0.J.2003,22， 3803-3815)报道的生物膜抑制活性最强的化合物-做为阳性对照物。30°C培养20h后，用蒸 馏水洗涤2次、除去浮游生物细胞，然后加入125yL 1%龙胆紫。室温放置15min后，用蒸馏水 小心洗涤3次，加入300yL 95%乙醇以溶解染色的生物膜，其溶液在630nm的吸光度进行分 析。平行测定三次。结果以生物膜抑制率（％ )表示。吸光度值与生物膜的形成程度正相关。 [0055] 生物膜抑制率（％ ) = (0D阴性组-0D样品)/0D阴性组X 100 [0056]表2各萃取层对铜绿假单朐菌生物膜的抑制活性
[0058]测定结果显示当归的乙醇提取物及各个萃取层均呈现不同强度的生物膜抑制活 性。其中，以氯仿层活性最好，正丁醇层次之。
[0059] 实施例6:利用电子扫描显微镜观察实施1所制得的当归提取物及各溶剂萃取部分 对铜绿假单胞菌生物膜的抑制活性。
[0060] 具体试验方法如下：将经培养有细菌生长的生物膜载体用2.5 %戊二醛固定，依次 用50%，70%，90%，无水乙醇梯度脱水，然后用醋酸异戊酯置换，C02临界点干燥，载体表面 在真空条件下镀金粉，电子扫描显微镜观察，确认生物膜形成，实验结果显示了本发明的当 归提取物各溶剂萃取部分均对铜绿假单胞菌生物膜具有显著的抑制活性，具体结果参见附 图2。
[0061 ]实施例7:抗耐药菌的当归提取物胶囊剂
[0062]当归提取物每粒胶囊的组成为:取实施1所制得的当归提取物1 OOmg，乳糖116mg， 玉米淀粉40mg，硬脂酸镁4mg。先将当归提取物、乳糖和玉米淀粉混合10~15分钟，再加入硬 脂酸镁混合1~3分钟。将混合物装入合适大小的胶囊中。
[0063]当归氯仿可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归氯仿可溶部分 30mg，乳糖116mg，玉米淀粉40mg，硬脂酸镁4mg。先将当归提取物、乳糖和玉米淀粉混合10~ 15分钟，再加入硬脂酸镁混合1~3分钟。将混合物装入合适大小的胶囊中。
[0064]当归乙酸乙酯可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归乙酸乙酯可 溶部分80mg，乳糖116mg，玉米淀粉40mg，硬脂酸镁4mg。先将当归提取物、乳糖和玉米淀粉混 合10~15分钟，再加入硬脂酸镁混合1~3分钟。将混合物装入合适大小的胶囊中。
[0065]当归正丁醇可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归正丁醇可溶部 分50mg，乳糖116mg，玉米淀粉40mg，硬脂酸镁4mg。先将当归提取物、乳糖和玉米淀粉混合10 ~15分钟，再加入硬脂酸镁混合1~3分钟。将混合物装入合适大小的胶囊中。
[0066]实施例8:抗耐药菌的当归提取物胶囊剂片剂
[0067]当归提取物每片的组成为:取实施1所制得的当归提取物100mg，乳糖122mg，玉米 淀粉10 %糊剂30mg，玉米淀粉45mg，硬脂酸镁3mg。先将当归提取物和乳糖混合10~15分钟， 用配置好的玉米淀粉10%糊剂将混合物制成颗粒。通过粗筛将湿颗粒碾碎，之后干燥。将干 燥的颗粒过筛并与玉米淀粉混合10~15分钟。再加入硬脂酸镁混合1~3分钟。在压片机上 将混合物压制成合适大小和重量的片剂。
[0068]当归氯仿可溶部分的每片的组成为:取实施1所制得的当归氯仿可溶部分30mg，乳 糖122mg，玉米淀粉10 %糊剂30mg，玉米淀粉45mg，硬脂酸镁3mg。先将当归氯仿可溶部分和 乳糖混合10~15分钟，用配置好的玉米淀粉10%糊剂将混合物制成颗粒。通过粗筛将湿颗 粒碾碎，之后干燥。将干燥的颗粒过筛并与玉米淀粉混合10~15分钟。再加入硬脂酸镁混合 1~3分钟。在压片机上将混合物压制成合适大小和重量的片剂。
[0069]当归乙酸乙酯可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归乙酸乙酯可 溶部分80mg，乳糖122mg，玉米淀粉10 %糊剂30mg，玉米淀粉45mg，硬脂酸镁3mg。先将当归乙 酸乙酯可溶部分和乳糖混合10~15分钟，用配置好的玉米淀粉10%糊剂将混合物制成颗 粒。通过粗筛将湿颗粒碾碎，之后干燥。将干燥的颗粒过筛并与玉米淀粉混合10~15分钟。 再加入硬脂酸镁混合1~3分钟。在压片机上将混合物压制成合适大小和重量的片剂。
[0070] 当归正丁醇可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归正丁醇可溶部 分50mg，，乳糖122mg，玉米淀粉10%糊剂30mg，玉米淀粉45mg，硬脂酸镁3mg。先将当归正丁 醇可溶部分和乳糖混合10~15分钟，用配置好的玉米淀粉10%糊剂将混合物制成颗粒。通 过粗筛将湿颗粒碾碎，之后干燥。将干燥的颗粒过筛并与玉米淀粉混合10~15分钟。再加入 硬脂酸镁混合1~3分钟。在压片机上将混合物压制成合适大小和重量的片剂。
[0071] 以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原料的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 当归提取物制备抗耐药菌药物的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述耐药菌为耐药铜绿假单胞菌。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述当归提取物通过抑制细菌生物膜 发挥其抗耐药菌的作用。4. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述当归提取物使用氯仿、乙酸乙酯、 正丁醇进行萃取，获得当归提取物浸膏的氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层流份。5. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述当归提取物经大孔吸附树脂的乙 醇水溶液梯度洗脱获得的洗脱部分。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：大孔吸附树脂乙醇水溶液洗脱液依次为 20%、50%、70%和95%的乙醇水溶液。7. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述当归提取物采用50%-95%的乙醇 溶液回流提取或甲醇冷浸提取。8. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：当归提取物添加药学上可接受的辅料 后制备成口服制剂。9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述口服制剂为胶囊剂、片剂或颗粒剂。10. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述当归提取物按照如下方法之一进 行制备： (1) 当归干燥根，粉碎，50 % -95 %乙醇回流提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液； (2) 减压浓缩提取液，得到乙醇浸膏； (3) 乙醇浸膏依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇分别萃取三次，分别减压 回收各萃取部分溶剂，得到氯仿可溶部分(ASC)，乙酸乙酯可溶部分(ASE)，正丁醇可溶部分 (ASB)和水层(ASW)，即得； 或 (1) 当归干燥根，粉碎，用甲醇冷浸，冷浸两次，每次两个星期，合并冷浸液； (2) 减压浓缩冷浸液，得到甲醇提取物； (3) 将甲醇提取物的水混悬液，进行大孔树脂开放柱层析，依次用体积百分比为20%的 乙醇水溶液、50%的乙醇水溶液、70%的乙醇水溶液、95%的乙醇水溶液洗脱大孔树脂开放 柱，得到各部分洗脱液； (4) 分别减压回收各洗脱部分溶剂，得到20%乙醇水溶液洗脱部分，50%乙醇水溶液洗 脱部分，70%乙醇水溶液洗脱部分和95%乙醇水溶液洗脱部分，即得。
【专利摘要】本发明涉及当归提取物的一种新的用途，实验结果显示本发明的当归提取物及其有机溶剂萃取流份和大孔吸附树脂梯度洗脱部分可以抑制铜绿假单胞菌和耐药铜绿假单胞菌的生物膜，更突出的是本发明的当归提取物及其有机溶剂萃取流份和大孔吸附树脂梯度洗脱部分对于耐药铜绿假单胞菌同样显示了明显的抑制作用，从而提供了一种非抗生素类的抗耐药菌药物，并有助于避免抗生素耐药问题。
【IPC分类】A61K36/232, A61P31/04
【公开号】CN105726593
【申请号】CN201610264435
【发明人】孙平华, 郭练霞, 马喧越, 黎盛荣, 李诗瑶, 郭嘉亮, 范吉林, 郭家晶, 林静
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2016年4月26日