亚型，所述重 组汉逊酵母表达HBsAg的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示;所述重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨 基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0015] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述重组汉逊酵母表达HBcAg的DNA序列为SEQ ID NO :3所示;所述重组汉逊酵母表达的HBcAg的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0016] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为病毒样颗粒 结构，由HBsAg插入汉逊酵母类脂组成，所述HBsAg的14个半胱酸中有9~12个形成二硫键； 所述重组汉逊酵母表达的HBcAg为病毒样颗粒结构。
[0017]所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于的热失活重组汉逊酵母的热失活条件为：热失 活温度52°C-56°C，热失活时间1小时-3小时。
[0018] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg共含有如下19 个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、 LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、 VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。
[0019] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBcAg共含有如下19 个CTL表位：SFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIRDLL、SYVNV匪GL、SYVNV匪GLKI、 YVNV匪G、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、 AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTWRR、RGRSPRRRTP。
[0020]所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述乙肝治疗疫苗的剂型选自预充式注射液 剂、注射液剂或冻干粉针剂。
[0021] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于还含有HBsAg原液或铝佐剂HBsAg中的一种。
[0022] 本发明还提供了一种重组多形汉逊酵母菌，所述的重组多形汉逊酵母菌中含有 SEQ ID NO: 1所示DNA序列。优选所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中整合有SEQ ID N0: 1所示DNA序列。
[0023] 本发明还提供了一种重组多形汉逊酵母菌一种重组汉逊酵母菌，所述的重组多形 汉逊酵母菌中含有SEQ ID N0:3所示DNA序列。优选所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中 整合有SEQ ID从):3所示0嫩序列。
[0024]以上任一所述重组汉逊酵母的宿主多形汉逊酵母细胞株为HU-11，保藏编号为 CGMCC No. 1218，所述宿主多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被破坏的DNA序列 如SEQ ID N0:5所示。
[0025]本发明提供的乙肝治疗疫苗，在一种每108细胞中含有6-10yg HBsAg的重组汉逊 酵母菌基础上，可以在现有的作为佐剂的全重组汉逊酵母细胞的人体注射上限范围内，最 大限度提高HBsAg的注射量，提高其扭转乙肝患者免疫耐受状态的效果。失活全重组汉逊酵 母细胞为最主要专职抗原递呈细胞(DC)的Dectin-Ι受体的高效激动剂。HBsAg特异性CTL细 胞靶向感染HBV的肝细胞释放IFN- γ :第一步非肝细胞损伤地减少其90%以上cccDNA分子 池，第二步提高了过程中损毁受感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。同时我们提供的重组 汉逊酵母细胞表达的作为抗原的HBsAg中至少含有19个CTL表位，可以提高HBsAg的免疫原 性和反应性。在优选的技术方案中的通过优选表达HBsAg的DNA序列（SEQ ID N0:1)，优选了 21个CTL中的19个CTL表位，进一步提高了优选HBsAg的免疫原性和反应性。
[0026]同时采用了能够产生HBcAg重组汉逊酵母热失活细胞与产生HBsAg的重组汉逊酵 母的热失活细胞进行配伍，采用的HBcAg(高免疫反应活性)优选码基因与C2基因型、亚型双 代表序列AF100309.1比较;缺失59-69位：ILCWGELMNLA共11个氨基酸。根据冷冻电镜图像重 建技术确定HBcAg颗粒结构；显示HBcAg二聚体各包含4条α螺旋，即每个HBcAg亚基通过两个 长α螺旋形成二聚体界面;其中位于第51~78位氨基酸的长α螺旋，头尾被第50和79位保守 的Pro所限制。深埋在二聚体内部，不存在CTL表位。α螺旋即所谓的3.6螺旋，其中每个氨基 酸旋转100°，3.6个氨基酸旋转360°原来的51~78位共18个氨基酸形成旋转5周的α螺旋;缺 失59-69位：ILCWGELMNLA共11个氨基酸后，剩余的7个氨基酸形成旋转2周的α螺旋。而另一 个形成HBcAg二聚体界面的长α螺旋，即位于第82-110位的纽结状α螺旋，终止于第111位Gly 没有任何改变。因此本专利基本未改变两个长α螺旋形成二聚体界面，上述缺失11个氨基酸 的HBcAg在重组汉逊酵母细胞中仍能组装成病毒样颗粒(VLP);仍保持其热稳定性。免疫反 应检测结果表明：上述缺失氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg工程菌株(HC-40-25，172个氨基 酸)与全长氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg工程菌株（183个氨基酸)HC-43相比：前者免疫反应 原性为后者的三倍以上。在优选了 CTL表位、表达序列及重组汉逊酵母工程菌株的基础上， 本发明还优选了重组汉逊酵母细胞的热失活工艺，保证了疫苗的疗效与安全性。
[0027]预期本发明提供的基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝 治疗疫苗将具有更高的免疫原性，能够更好的用于乙肝的治疗。
【附图说明】
[0028] 图1为质粒pMPT-HBS-adw的构建过程示意图；
[0029] 图2为pMPT-HBC质粒的物理图谱；
[0030]图3为筛选得到工程菌株HS604-5的PCR扩增产物电泳照片；
[0031]图4为重组汉逊酵母得到的重组HBsAg的纯品（原液)的电镜照片；
[0032]图5为实施例2中重组汉逊酵母HBsAg工程菌株的构建中重组汉逊酵母的转化与筛 选步骤流程图。
【具体实施方式】
[0033]汉逊酵母胞内质粒pMPT-02的开发：
[0034] 汉逊酵母表达系统包括两个主要元件：
[0035] (1)启动外源基因尚效表达的载体系统（质粒）；（2)具有特定筛选标记的宿主细 胞。
[0036] 应用基因合成技术，将汉逊酵母Μ0Χ(甲醇氧化酶）启动子1.5kb、汉逊酵母Μ0Χ(甲 醇氧化酶）终止子350bp、汉逊酵母自主复制序列HARS，1.0kb、和酿酒酵母脲嘧啶基因 ScURA31. lkb;将以上5部分基因元件紧密相连后，再插入pBluescripII质粒中，构建成穿梭 质粒pMPT-02。为本申请人的非独占专有技术。
[0037] 脲嘧啶营养缺陷型URA3^宿主细胞株HU-11的开发：
[0038]利用同源序列介导的同源整合构建了乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因（HURA3)被破 坏的重组多形汉逊酵母菌株HU-11 (CGMCC No. 1218)。该菌株与目前国内外所用由诱变产生 的营养缺陷型宿主菌株相比，具有遗传稳定性高，回复突变率低的特点;便于进行遗传转化 和重组菌株的筛选，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株培养和外源蛋 白的高效表达，具有较高的工业应用价值。汉逊酵母基因被破坏宿主菌HU11株URA3基因的 DNA测序结果表明：基因被破坏结果导致第31位碱基后，插入GAAGT五个碱基。GAAGT五个碱 基的插入产生移码突变。移码突变导致第11位后的254个密码子全部被置换。GAAGT五个碱 基同时产生回复突变的概率极小，实验检测也证明宿主菌HU11株的回复突变率为零;这种 "〇"回复突变率的宿主菌对转化筛选特别有利。应用上述基因敲除技术建立的URA3-营养缺 陷型宿主细胞株HU-11(CGMCC如.1218)本专利权人已申请的发明专利为0附65157(^。宿主 汉逊酵母菌HU-11乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因（HURA3)被破坏的DNA序列为SEQ ID N0:5。
[0039] 重组汉逊酵母HBsAg-adw2优选码基因设计：
[0040] 本发明提供的重组汉逊酵母表达乙肝表面抗原（HBsAg)的DNA序列基于HBsAg adw2亚型设计，如SEQ ID N0:1所示，所述HBsAg的氨基酸序列为SEQ ID N0:2。
[00411本发明提供的重组汉逊酵母表达乙肝核心抗原（HBcAg)的DNA序列如如SEQ ID NO :3所示，所述HBcAg的氨基酸序列为SEQ ID NO :4
[0042] 汉逊酵母胞内型质粒pMPT-HBS-adw和pMPT-HBC的构建：
[0043] 按照SEQ ID NO: 1所示序列的合成核苷酸序列（以下简称HBsAg adw2基因）；并构 建成含HBsAg adw2基因质粒的甘油菌;测序正确后的质粒用EcoR I/BamH I双酶切，酶切产 物切胶回收701bp的目的片段DNA。
[0044] 将酶切鉴定正确的质粒pHMPT-02用EcoR I/BamH I双酶切，切胶回收后所得到的 载体DNA连接后得到汉逊酵母胞内型质粒pMPT-HBS-adw，将质粒pMPT-HBS-adw热转化至 E.coli Competent Cell JM109(Code NO.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。从转化平板 上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoR I/BamH I双酶切，酶切结果表明均为阳性克隆。测序 证明质粒pMPT-HBS-adw结果正确。
[0045] HBsAg adw2基因插入汉逊酵母表达系统胞内型质粒pMPT-02的多克隆位点：EcoR I和BamH I之间。质粒pMPT-HBS-adw全长为7665bp。质粒pMPT-HBS-adw的构建过程示意图如 图1所示。
[0046] 按照与构建质粒pMPT-HBS-adw同样的的方法，构建基于SEQ