的目的片段DNA称为Inset DNA6〇
[0082] 将酶切鉴定正确的质粒pHMPT-02用EcoR I/BamH I双酶切，切胶回收后所得到的 载体DNA称为Vector DNA6。
[0083] 使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6022)中的Solution，将Inset DNA6与 Vector DNA6连接后，热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code N〇.D9052)中，涂布平 板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoR I/BamH I双酶切，酶切 结果表明：MC407A+B+C+D-77c〇80均为阳性克隆。
[0084] 将 MC407A+B+C+D-77 号质粒分别用引物 RV-M，M13-47，MC407P1，MC407P2，MC407P3， MC407P4，MC407P5，MC407P6，MC407P7，MC407P8，MC407P9，MC407BF11，MC407BR11 测序，证明 质粒pMPT-HBS-adw结果正确。
[0085] 以同样的方法，基于所述SEQ ID从):3构建的?1031'-耶(：质粒。
[0086] 实施例2
[0087] 重组汉逊酵母HBsAg工程菌株的构建。
[0088]重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的转化与筛选图示说明：重组汉逊酵母的转化与筛选 过程如图5所示：
[0089] 具体包括
[0090] 1)应用细胞电穿孔法，将pMPT-HBS-adw质粒，转化作为宿主细胞的URA3-营养缺陷 型汉逊酵母细胞株HU-11 (CGMCC No. 1218)。采用选择培养基(MD液体培养基)平皿培养。在 MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子，转接MD液体培养基后连续传代培养，使 adw2亚型HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、外源整合入宿主汉逊酵母细胞染色体中。
[0091] 2)菌株筛选包括以下步骤
[0092] (1)选择尿嘧啶原养型转化子单菌落
[0093]挑选菌体生长速度快的菌落，应用PCR技术检测HBsAg基因条带亮度后，挑选拷贝 数多的菌落，采用选择培养基对单菌落进行摇瓶培养，连续传代培养20~400个世代；
[0094] (2)筛选多拷贝异源整合转化克隆株，
[0095] 经过步骤（1)传代培养后，经甲醇诱导培养72小时后，采用/放射免疫分析(Radio immunoassay or radioimmunoassay，RIA)测定转化子细胞破碎后释放出HBsAg的表达水 平；
[0096] (3)筛选去除游离质粒的高拷贝、高表达克隆株
[0097]将经过步骤(2)筛选的克隆株，采用YPD完全培养基培养48小时后，转接选择培养 基平皿克隆化培养，并采用定量PCR检测HBsAg基因拷贝数，以RIA检测HBsAg表达水平。 [0098] (4)在步骤(3)的检测结果基础上，选择遗传稳定的重组汉逊酵母HBsAg工程菌的 原代菌株。
[0099]按照同样的方法，构建并筛选重组汉逊酵母HBcAg工程菌株。
[0100] 实施例3、30升中试发酵(重组汉逊酵母HBcAg工程菌株和重组汉逊酵母HBsAg工程 菌株采用相同的发酵工艺方法）
[0101 ]主要工艺过程和操作要点：
[0102] 1)以200ml种子培养基解冻贮存菌种，接种至培养基中，均分两个0.5L摇瓶，31°C 培养22小时作为一级种子；
[0103] 2)以1600ml种子培养基将一级种子转接入二级种子培养基中，均分6个1L摇瓶，31 °(：培20小时作为二级种子；
[0104] 3)将12L发酵培养基调pH至5.5加入30L发酵罐中，将二级种子接入后，30-31°C经 甘油、甲醇两碳源，生长、去阻遏和诱导三时相，共培养85-96小时，在停止诱导2-3小时后收 获细胞。将冷冻的细胞匀浆。
[0105] 操作要点：
[0106] (1)生长时相的补料操作要待溶氧有明显下降，基础培养基消耗时开始进行，并且 随着基础培养基消耗量的增加逐步提高流加速度，待溶氧回升前2-3小时流加完毕。
[0107] (2)生长时相的后期要注意溶氧回升，记录溶氧最低值，溶氧回升至70-80%时开 始流加，进入去阻遏时相。
[0108] (3)去阻遏时相后期，流加结束后，溶氧开始回升。溶氧回升至70-80% %时开始流 加甲醇诱导溶液，将甲醇浓度控制在3-5%。，由甲醇检测流加控制器控制流加速度。
[0109] 发酵结束前2-3小时停止甲醇流加，以减少细胞收获时甲醇残留。
[0110] 培养基
[0111] 1.氯化钙溶液的配制
[0112]准确称量CaCl2 11.33g，放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至 200ml〇
[0113] 2.微量元素溶液的配制
[0114] 准确称量以下试剂：
[0116] 将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至200ml。
[0117] 3.维生素溶液的配制
[0118] 准确称量以下试剂：
[0119] d-Biotin 6mg
[0120] Thiamin HC1 2000mg
[0121] 将生物素首先溶解在10ml的50%异丙醇中，待溶解后再加入Thiamin HC1，然后加 适量去离子溶解后水定容至l〇〇ml。
[0122] 4.痕量元素溶液的配制
[0123] 准确称量以下试剂：
[0125]将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子溶解后水定容至50ml。
[0126] 以上四种溶液分别除菌过滤备用。
[0127] 5.种子盐溶液的配制
[0128] 准确称量以下试剂：
[0130]将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至1600ml。
[0131] 6.用2000ml三角瓶称取甘油27g，混合盐溶液360mL，加去离子水定容至1800ml，等 量分装于两个2000ml三角瓶中，110°C、30分钟高压蒸汽灭菌。
[0132] 110°C、30分钟高压蒸汽灭菌空消500ml三角瓶2个，1000ml三角瓶6个，100ml和 500ml量筒各一个。
[0133] 7.-级种子培养基在超净台中，无菌操作量取灭菌后的甘油水溶液各100ml，分别 置于灭菌后的2个500ml三角瓶中，并分别加入： 氯化钙溶液 1ml Γ ? 微量元素溶液 1ml
[0134] 维生素溶液 0.5ml 痕量元素溶液 0.25ml
[0135] 将加入的溶液摇匀。
[0136] 8.二级种子培养基
[0137] 在超净台中以无菌操作技术取灭菌后的甘油水溶液1600ml置于灭菌后的2000ml 三角瓶中，并分别加入： 氯化钙溶液 16ml 微量元素溶液 〗6ml
[0138] 维生素溶液 8ml 痕量元素溶液 4ml
[0139] 9.发酵培养基
[0140] 准确称量以下试剂并溶解于2000ml去离子水中。
[0142] 取一个500ml小烧杯称取520g甘油，加泡敌10ml在线灭菌，然后加： 氯化钙溶液 175ml 微量元素溶液 〗75ml
[0143] 维生素溶液 88ml 痕量元素溶液 44ml
[0144] 10.补料培养基
[0145] 取一个1000ml三角瓶，量取87g NH4H2P〇4、260g甘油，加去离子水500ml，加入包裹 好的补料管线，ll〇°C、30分钟灭菌。
[0146] 11.去阻遏溶液
[0147] 用5000ml三角瓶，量取甘油1800g，加去离子水660ml，加入包裹好的补料管线，110 °C、30分钟灭菌，冷却后无菌操作加入过滤除菌的盐溶液540ml。
[0148] 12.诱导溶液
[0149] 用1000ml三角瓶，量取甘油400ml，加入包裹好的补料管线，110°C、30分钟灭菌，冷 却后无菌操作加入甲醇1600ml。
[0150] 实施例4
[0151] 纯化，HBsAg和HBcAg采用同样的纯化工艺，以HBsAg为例，工艺如下：
[0152] 将实施例3得到的重组汉逊酵母HBsAg工程菌株发酵液经收获细胞并洗涤细胞，纯 化的详细步骤可参见参考文献:李津，孔艳.重组乙型肝炎疫苗生产工艺.见李津，俞詠霆， 董德祥主编：生物制药设备和分离纯化技术.第1版.北京：化学工业出版社，2003 : 348-349.。其中可将上述收获的细胞经过匀浆器破碎，释放出HBsAg;以0.22μπι微孔滤器过滤去 除细胞碎片;再以300Κ超微滤器超滤去除小分子杂质；以硅胶吸附处理法提取HBsAg;最后 以丁基琼脂糖疏水层析方法精制纯化。
[0153] 实施例5
[0154] 热失活重组汉逊酵母细胞最佳条件试验
[0155] 为了确定热失活重组汉逊酵母的最佳条件应满足以下要求：
[0156] (1)热失活重组汉逊酵母的成活率尽可降低;使之小于5%。
[0157] (2)保持完整的细胞结构;发挥多价位热失活重组汉逊酵母佐剂活性作用；
[0158] (3)保持重组汉逊酵母细胞内表达的病毒样颗粒(VLP)完整，使其抗原性不下降。
[0159] 以上三点是热失活重组汉逊酵表达HBsAg和HBcAg生产工艺主要条件;将为制定疫 苗制造及检定规程提供依据。其中热失活重组汉逊酵母细胞内病毒样颗粒(VLP)的热稳定 性成为首次要解决的问题。
[0160] (1)、优化条件的热失活重组汉逊酵母细胞制备。
[0161] 重组汉逊酵母HBsAg工程菌(HS604-5株)细胞培养经发酵或摇瓶诱导培养结束后。 细胞用离心法在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤三次，将沉淀的汉逊酵母悬浮在计算体积的PBS 中。细胞使用〇D6QQnm计数，PBS稀释为100D6QQnm/i%升，每支试管2毫升;每试验组设破碎与不 破碎2支试管；16个试验组共需制备32支细胞样品试管