本发明涉及一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，属于生物医学材料涉及神经组织工程修复领域。
背景技术：
：近年来，各种神经组织缺损给患者带来了极大的困扰与痛苦。神经组织的再生与修复一直是国际研究的热点，可采用自体神经移植、基因疗法、生长因子诱导及组织工程等技术来治疗神经缺损及修复。其中组织工程与再生医学的发展为重建或修复神经组织提供了有效的治疗手段，为临床神经缺损修复带来了曙光。神经支架材料的设计不仅要在结构上仿生人体细胞外基质(ECM)结构与功能解决支架材料与细胞的生物相容性问题，而且还应在功能上引导神经组织细胞迁移与促进作用。神经传导的根本在于神经纤维上膜电位的变化，神经传导即为电信号的传导，因此从结构和功能上构建神经再生支架材料具有广阔的开发前景。柞蚕丝素蛋白是一种天然活性蛋白，具有较低的免疫原性、良好的生物相容性，其本身及其降解产物对细胞和机体无毒，不会或较少引起炎症和免疫排斥反应。其除了具有普通丝蛋白的优点外，分子结构中还含有特殊的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列能够促进细胞对于支架的识别及粘附显示了其他丝蛋白无可比拟的优点。使其在生物医用材料与组织工程领域里的应用研究受到了越来越多的关注。然而，在应用与神经组织修复与再生的过程中，其力学性能需进一步提高。聚乳酸-聚己内酯是聚乳酸和聚己内酯的共聚物，由于其具有良好的生物可降解性和良好机械性能，被广泛用于组织工程领域。但其属于合成高分子材料，不能为神经组织生长提供所需的生物信号，同时亲水性较差，不利于细胞的粘附和生长。然而，静电纺技术可以结合二者优点，既能使支架材料具有较高且符合神经组织的力学性能，又能为组织生长提供生物信号，促进神经细胞的粘附、增值和分化，从而满足神经组织的需要。石墨烯是由sp2杂化碳原子组成的具有蜂窝状晶体点阵结构的二维层状纳米纤维，作为一种新型纳米材料，在生物医学领域具有极其广泛的潜在应用价值。其具有极其优异的导电性、力学和良好的生物相容性，独特的物理化学性质能够提供细胞生长的细胞外基质条件，这是它作为组织工程支架材料的一个很大的优势。目前，有学者已经利用石墨烯优良的性能制备出多种石墨烯及其衍生物增强三维复合支架用于骨组织修复与再生，但利用石墨烯优良的导电性能制备导电的复合纳米纤维神经组织工程支架还没有相关文献和专利进行报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法。为了达到上述目的，本发明提供了一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括：步骤1：将柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯溶于溶剂中，搅拌至完全溶解，得到纺丝液；步骤2：将步骤1得到的纺丝液进行静电纺丝得到纳米纤维膜，采用乙醇或其溶液进行熏蒸处理，干燥得到柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维；步骤3：将步骤2得到的丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料浸渍在氧化石墨烯分散液中，取出，清洗，浸泡在抗坏血酸溶液中，在50-70℃浸泡1-3h，取出，干燥，得到基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架。优选地，所述的柞蚕丝素蛋白的制备方法包括：将天然柞蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到柞蚕丝素蛋白溶液，进行冷冻干燥，得到纯净柞蚕丝素蛋白。优选地，所述的氧化石墨烯分散液的制备方法包括：将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释，得到氧化石墨烯分散液。优选地，所述的步骤2中的干燥为真空干燥，时间为24-48h。优选地，所述的步骤1中的柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的质量比为25∶75-75∶25。优选地，所述的纺丝液的浓度为8％-10％(质量体积比)。优选地，所述的静电纺丝条件为：电压为8-15KV，喷丝头和接收装置之间的距离(接收距离)为6-12cm，纺丝速率为0.8-1.5ml/h。优选地，所述的氧化石墨烯分散液的浓度为0.02-10mg/ml。优选地，所述的步骤2得到的丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料浸渍在氧化石墨烯分散液中的浸渍时间为0.3-12h。优选地，所述的抗坏血酸溶液的浓度为10-100mM。优选地，通过调节氧化石墨烯分散液的浓度、浸渍时间、浸渍次数中的至少一种来调节基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的亲疏水性，力学性能以及细胞粘附性，通过调节抗坏血酸溶液的浓度来调节基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的导电性。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明制备的一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经支架制备方法巧妙的利用静电纺丝技术制备出物理化学性能优异，生物相容性好的柞蚕丝蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维支架，将导电性能优异的石墨烯采用简单的浸渍再还原方法与柞蚕丝蛋白复合支架材料接触，在其支架材料表面形成有效的网状互联结构，与富含RGD序列的柞蚕丝蛋白产生协同作用，提高了复合材料的生物活性。2、与未含石墨烯纳米纤维支架材料相比，基于石墨烯的复合纳米纤维支架材料具有较高且符合神经组织的力学性能，外加电刺激更能促进神经细胞的分化与增殖。3、通过调节氧化石墨烯浓度、浸渍时间、浸渍次数来控制神经支架材料的物理化学性能、亲疏水性，力学性能以及细胞粘附性，通过调节还原剂抗坏血酸浓度控制石墨烯还原程度从而调节其支架材料的导电性能。4、柞蚕丝蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维支架材料与石墨烯通过物理静电相互作用及氢键作用发生自组装，没有破坏掉原有的纳米纤维结构，使其仍具有纳米纤维支架材料高比表面积，孔隙率高等的优点。5、本发明方法简单易行，原料安全可靠未使用到任何其他有害有毒的化学试剂，使其在神经组织工程方面具有很好地应用前景，易实现工业化生产。6、本发明将柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯共混采用静电纺丝技术制备的复合纳米纤维支架能最大限度的从结构和功能上仿生人体细胞外基质，另外，采用浸渍还原法涂层石墨烯还具有以下优点：(1)涂层的石墨烯具有优异的导电性能，可通过外加带刺激促进神经细胞的分化；(2)石墨烯具有较大的比表面积，可以与柞蚕丝蛋白复合纳米纤维材料充分接触，产生协同作用，提高了复合纳米纤维神经组织支架材料的生物活性；(3)低添加量的情况下，可显著提高支架材料的机械性能；(4)石墨烯具有一定的抗菌性，有利于减少植入物术后的感染率。结合静电防技术及石墨烯优良性能，使其基于石墨烯导电纳米纤维支架材料有望成为理想中的神经组织工程支架。本发明作出之前，还没有文献和专利报道过有关氧化石墨烯涂覆丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维组织工程支架制备。这项研究对于生物医用材料及组织工程领域具有重要的意义。7、本发明制备出的导电性纳米纤维支架仍保持纳米纤维支架的特点，不仅同含有RGD序列的柞蚕丝素蛋白产生协同作用提高的支架材料的生物活性，同时从外加电刺激导电高分子石墨烯促进了神经的修复速度，使其在神经组织工程方面具有很好的应用前景。附图说明图1为对比例1及实施例1-3所述基于不同浓度石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织支架的光学图片：(a)未含石墨烯复合纳米纤维支架(b)石墨烯0.5mg/ml复合纳米纤维支架，(c)石墨烯1.0mg/ml复合纳米纤维支架，(d)石墨烯1.5mg/ml复合纳米纤维支架；图2为对比例1及实施例1-4所述基于不同浓度石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织支架的扫描电镜图片：(a)未含石墨烯复合纳米纤维支架(b)石墨烯0.5mg/ml复合纳米纤维支架，(c)石墨烯1.0mg/ml复合纳米纤维支架，(d)石墨烯1.5mg/ml复合纳米纤维支架(e)石墨烯2.0mg/ml复合纳米纤维支架。图3为实施例3所述基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织支架循环伏安拟合曲线示意图；图4为对比例1及实施例1-4所述基于不同浓度石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织支架的拉曼光谱。(a)未含石墨烯复合纳米纤维支架(b)石墨烯0.5mg/ml复合纳米纤维支架，(c)石墨烯1.0mg/ml复合纳米纤维支架，(d)石墨烯1.5mg/ml复合纳米纤维支架(e)石墨烯2.0mg/ml复合纳米纤维支架。图5为对比例1及实施例1-4所述雪旺细胞(SCs)在基于不同浓度石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织支架生长粘附的扫描电镜图片。(a)未含石墨烯复合纳米纤维支架(b)石墨烯0.5mg/ml复合纳米纤维支架，(c)石墨烯1.0mg/ml复合纳米纤维支架，(d)石墨烯1.5mg/ml复合纳米纤维支架(e)石墨烯2.0mg/ml复合纳米纤维支架。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明各实施例中所用的高分子聚合物为聚乳酸-聚己内酯，其为市售产品，其分子量Mn为30万，其中，乳酸单元和己内酯单元的摩尔比为50：50。本发明各实施例中的氧化石墨烯水溶液为市售产品，浓度为2mg/ml。对比例1一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/LNa2CO3的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。2、称取柞蚕丝素蛋白0.25g，聚乳酸-聚己内酯0.75g，溶于10ml溶剂六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液，将纺丝液进行静电纺丝，用铝箔平整包缠6x6cm2接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏；接收距离10cm，纺丝速率1.0ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维。3、将得到的丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料浸渍在纯水中30min，循环浸渍5次，取出，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，浸泡在浓度为20mM的抗坏血酸溶液中，在70℃浸泡3h，取出，干燥，得到复合纳米纤维神经组织工程支架。实施例1一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/LNa2CO3的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。2、称取柞蚕丝素蛋白0.25g，聚乳酸-聚己内酯0.75g，溶于10ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液。将纺丝液进行静电纺丝，用铝箔平整包缠6x6cm2接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏，接收距离10cm，纺丝速率1.0ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维。3、将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释为0.5mg/ml，得到氧化石墨烯分散液。将得到的丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料浸渍在氧化石墨烯分散液中30min，循环浸渍5次，取出，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，浸泡在浓度为35mM的抗坏血酸溶液中，在70℃浸泡3h，取出，干燥，得到基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架。实施例2一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/LNa2CO3的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。2、称取柞蚕丝素蛋白0.25g，聚乳酸-聚己内酯0.75g，溶于10ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液。将纺丝液进行静电纺丝，用铝箔平整包缠6x6cm2接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏，接收距离10cm，纺丝速率1.0ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维。3、将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释为1.0mg/ml，得到氧化石墨烯分散液。将得到的丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料浸渍在氧化石墨烯分散液中30min，循环浸渍5次，取出，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，浸泡在浓度为50mM的抗坏血酸溶液中，在70℃浸泡3h，取出，干燥，得到基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架。实施例3一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/LNa2CO3的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。2、称取柞蚕丝素蛋白0.25g，聚乳酸-聚己内酯0.75g，溶于10ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液。将纺丝液进行静电纺丝，用铝箔平整包缠6x6cm2接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏；接收距离10cm，纺丝速率1.0ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维。3、将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释为1.5mg/ml，得到氧化石墨烯分散液。将得到的丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料浸渍在氧化石墨烯分散液中30min，循环浸渍5次，取出，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，浸泡在浓度为70mM的抗坏血酸溶液中，在70℃浸泡3h，取出，干燥，得到基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架。所述基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织支架循环伏安拟合曲线如图4所示。实施例4一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：1、将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/LNa2CO3的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。2、称取柞蚕丝素蛋白0.25g，聚乳酸-聚己内酯0.75g，溶于10ml六氟异丙醇中，以一定的速率磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液。将纺丝液进行静电纺丝，用铝箔平整包缠6x6cm2接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压12千伏，接收距离10cm，纺丝速率1.0ml/h，大约4h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维。3、将氧化石墨烯水溶液进行超声分散，真空过滤去除杂质，稀释为2mg/ml，得到氧化石墨烯分散液。将得到的丝素蛋白/高分子聚合物复合纳米纤维支架材料浸渍在氧化石墨烯分散液中30min，循环浸渍5次，取出，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗数次，浸泡在浓度为100mM的抗坏血酸溶液中，在70℃浸泡3h，取出，干燥，得到基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架。对比例1及实施例1-3中所述的石墨烯导电型复合纳米纤维支架光学图片如图1所示，其结果显示未含石墨烯的支架材料为白色，含有石墨烯支架材料为黑色，其表明石墨烯已存在与纳米纤维支架材料上。对比例1及实施例1-4中所述的石墨烯导电型复合纳米纤维支架扫描电镜图片如图2所示。其结果显示未含石墨烯的支架纤维平整光滑，含有石墨烯支架纤维表面粗糙有片层覆盖，其表明石墨烯已存在与纳米纤维支架材料上且不会破坏纳米纤维的结构。图3为实施例3所述基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织支架循环伏安拟合曲线示意图；利用电化学工作站(CHI660D)中循环伏安法测定纳米纤维的导电性。将样品剪成长×宽＝30mm×10mm的试样，通过循环伏安法测试其结果如图3所示，表明含有石墨烯的纳米纤维支架具有良好的导电性。对比例1及实施例1-4所述的石墨烯导电型复合纳米纤维支架的电导率如下表所示：石墨烯浓度(mg/ml)电导率(S/m)000.51.96x10-3±5.30x10-41.01.35x10-2±2.73x10-31.53.32x10-2±1.31x10-32.03.50x10-2±1.03x10-3利用电化学工作站(CHI660D)中循环伏安法测定纳米纤维的导电性。将样品剪成长×宽＝3mm×10mm的试样，同时采用螺旋测微器测定纳米纤维薄膜的平均厚度，每种样品制取3个平行样。根据公式σ＝L/RS(σ，电导率S/cm；R，电阻Ω；S，样品的截面积cm2)计算电导率并求出电导率的平均值。其结果表明：未含有石墨烯的纳米纤维支架材料不具有导电性，随着石墨烯浓度的增加，纳米纤维支架材料导电性增加。对比例1及实施例1-4所述的石墨烯导电型复合纳米纤维支架拉曼光谱图如图4所示，将不同样品采用拉曼光谱分析仪测试，其结果显示涂层的氧化石墨烯支架D峰与G峰氧化石墨烯的比值大于1，表明石墨烯已存在到纳米纤维支架材料上。对比例1及实施例1-4所述的雪旺细胞(SCs)在石墨烯导电型复合纳米纤维支架生长粘附的扫描电镜图片如图5所示，利用24孔打孔器进行各样品的准备，将各样品置于24孔培养板中，以盖玻片作为对照样，将各板置于体积分数为75％的酒精蒸汽缸中进行灭菌处理2h后置于超净工作台备用，利用PBS依次清洗支架以及空白培养板3次，以此除去未挥发的酒精蒸汽。雪旺细胞的种植密度为每孔1×104个，再将配好的DMEM培养基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％双抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO2的培养箱内孵育，以上操作步骤均在超净台内完成，进行酒精脱水处理，用于电镜的拍摄，其结果表明含有石墨烯的支架材料与未涂层的纳米纤维支架材料更有利于细胞生长粘附。当前第1页1 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