。
[0034] 本发明使用紫外可见吸收光谱（UV-Vis)、热重分析（TGA)、核磁共振氢谱（1H 匪R)、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射(DLS)和透射 电子显微镜(TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过CT成像仪测定纳米金星的X射线 衰减系数，并评价了该纳米材料作为光热治疗试剂在近红外激光照射下的升温效果，采用 凝胶阻滞实验确定最佳氮磷比，利用CCK 8法来评价纳米材料的细胞毒性，再利用荧光显微 镜、流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该纳米材料的细胞吞噬量和胞内定位，最后采用 Western Blot来评价VEGF siRNA介导的基因沉默效果。
[0035] 有益效果
[0036] (1)本发明采用种子生长法合成不规则分支状的金纳米星，然后通过巯基化的第 三代聚酰胺-胺树状大分子(G3.NH 2-SH)稳定，继而修饰聚乙二醇化的RGD，实现靶向，最后 与VEGF siRNA共同孵育，形成复合物;此法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作纯化，所 用均为环境友好的材料；
[0037] (2)本发明制备的RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星具有良好的水溶性、 胶体稳定性、生物相容性和特定细胞的靶向性。体外实验结果显示该多功能化的金纳米星 不仅具有很好的CT成像效果，同时可以把光热治疗和基因治疗两种治疗模式集中在一个纳 米平台上，协同增强了对癌细胞和肿瘤的治疗效果;可以预见，本发明制备的多功能化的金 纳米星在分子影像、肿瘤的光热治疗和基因治疗领域有着潜在的应用价值。
【附图说明】
[0038] 图1为实施例1中G3.NH2(a)和G3.NH2-SH(b)的核磁共振分析(1H NMR)图；
[0039]图2为实施例1中Au种子(a)和Au纳米星(b)的紫外吸收图谱；
[0040]图3为实施例1中Au种子(a-b)和Au纳米星(c-d)高分辨透射电镜图片；
[0041 ] 图4为实施例2中AuNSs(a)和G3-AuNSs(b)的热重分析图；
[0042] 图5为实施例3中⑶OH-PEG-RGD(a)和实施例4中Au-G3-PEG-RGD(b)的核磁共振分 析(1H NMR)图；
[0043]图6为实施例5中Au DSNSs纳米材料在不同Au浓度下的CT成像图和CT值随金浓度 变化的线性关系图；
[0044]图7为实施例6中Au DSNSs在不同Au浓度下经过近红外激光照射后的升温曲线图； [0045] 图8为实施例7中CCK8法测试的U87MG细胞经过PBS缓冲液(对照）的AU-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs(Au的实验浓度范围在O-ImM)处理24小时后的细胞存活率；
[0046] 图9为实施例8中CCK8法测试的U87MG细胞在与本发明制备的Au DSNSs(Au浓度 0.2-0.8mM)共培养6小时后经过激光照射细胞的存活率；
[0047]图10为实施例9中Au DSNSs的凝胶阻滞实验电泳图谱；
[0048] 图11为实施例10中Au DSNSs/siRNA复合物的电势和水动力粒径图；
[0049] 图12为实施例11中Au DSNSs与Cy3-siRNA复合物在不同N/P比例下吞噬量和处理 后细胞的平均荧光强度；
[0050] 图13为实施例12中U87MG细胞分别经过PBS缓冲液(a)、VEGF Cy3-siRNA和制备的 Au DSNSs/Cy3-siRNA复合物(N/P= 10，15，20，25)处理4小时后细胞的共聚焦显微成像图 片；图14为实施例13中Au DSNSs在N/P = 20时，以PBS为对照，U87MG细胞的低ανβ3整合素表达 和高ανβ 3整合素表达对载体/Cy3_siRNA复合物的细胞吞噬量比较图；
[0051 ] 图15为实施例14中U87MG细胞分别经过PBS，VEGF siRNA和Au DSNSs/siRNA复合物 处理后的Western Blot结果图；
[0052]图16为实施例15中CCK8法测试的U87MG细胞经过PBS缓冲液，单独的载体Au DSNSs，单独的VEGF siRNA以及Au DSNSs/siRNA复合物处理48小时后，又经近红外激光照射 后的细胞存活率。
【具体实施方式】
[0053]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0054] 实施例1
[0055] (1)称取IOmg G3.NH2溶解于20mL超纯水中，并向其中加入3.25yL巯基乙酸甲酯 (Methylthioglycolate，95%，Mw = 106 · 14,P = 1 · 187)在60°C水浴反应2天，用截留分子量 为1000的透析袋在水中透析三天即得到部分琉基化的G3.NH2(G3.NH2-SH),冻干后储存于-20 °C下备用。分别取3mg冻干的G3.順2和63. NH2-SH溶于氘代水中进行核磁测试，从图1中可 以看出，63.順2-3!1(13)相较于63.順 2(&)，在3.25处出现了一个额外增强的吸收峰，为树状大 分子上的氨基和巯基乙酸甲酯发生反应生成的酰胺键的特征峰，并通过峰面积积分可知， 每一个G3. NH2上连接15.51个巯基。
[0056] (2)称取IOOmg柠檬酸三钠，溶解于9.9mL超纯水中，待其充分溶解后取1.5mL加入 到沸腾的HAuCl4溶液（ImM，IOmL)中，在持续沸腾的情况下充分搅拌20分钟，溶液颜色由无 色变为酒红色，得到柠檬酸钠稳定的金种子冷却并储存于4°C下备用。
[0057] (3)配制0.25mM HAuC 14溶液I OmL，充分搅拌状态下加入10OyL步骤（2)中的金种 子，然后快速加入I OOyL AgNO3 (2mM)和50yL AA(O . ImM);待溶液变为蓝色后持续搅拌2小 时，反应结束后，离心纯化，得到金纳米星溶液。后按照金纳米星与G3. NH2-SH的质量比为1: 5的比例，向金纳米星溶液加入G3. NH2-SH的水溶液，搅拌反应24小时，离心，水洗三次，冷冻 干燥，得到的G3-AuNSs，纯化冻干后储存于-20 °C下备用。
[0058] 实施例2
[0059]分别取实施例1制备的Au种子和Au纳米星的水溶液2mL离心管中，再向其中加700μ L超纯水，超声均匀，测量紫外吸收（见图2，金种子和AuNSs在400到1000 nm的紫外吸收图 谱）。紫外结果表明，金种子(a)的吸收峰在520nm左右，而采用种子生长法合成的金纳米星 (b)的紫外吸收峰在SOOnm左右，说明成功合成了在近红外区域具有独特吸收峰的金纳米 星。
[0060]分别取实施例1中制备的Au种子和Au纳米星的水溶液5yL，然后用超纯水配制成 IOOyL的纳米颗粒悬浮液。并将纳米颗粒悬浮液5yL滴在铜网表面，在空气中晾干后用于TEM 测试(见图3,金种子和金纳米星的形貌和尺寸大小）。高分辨率TEM测试结果表明金种子(图 3a-b)的形貌为球形，且分散均匀。分别随机测量300个金种子的直径，计算得到其直径为 13.1±4.Onm;高分辨率TEM观察本发明制备的金纳米星（图3c-d)形貌为分支状的星形，平 均直径大小为52.2±14.2nm〇
[0061 ] 为了检测G3. NH2-SH在AuNSs (a)表面的上载量，对修饰前后的纳米颗粒进行了 TGA 测试。由图4可以看出，G3-AuNSs (b)在温度升至900°C时，重量为原来的91.84%，即为金纳 米星表面稳定剂G3.NH2的重量，由此表明G3.NH2-SH已经成功连接到金纳米星的表面。
[0062] 实施例3
[0063] 将3.70mg 6-M与20mg NH2-PEG-⑶OH混合于5mL DMSO溶液中，搅拌反应10个小时， 得到C00H-PEG-6-M;然后将充分溶解于2mL DMSO中的6.91mg RGD逐滴加入到C00H-PEG-6-M 的DMSO溶液中，搅拌反应1天，用截留分子量1000的透析袋透析三天，然后冷冻干燥，即得 C00H-PEG-RGD。取3mg合成的COOH-PEG-R⑶溶