u DSNSs/Cy 3-s i RNA (N/P = 20)复合物与细胞共培养4h，随后通过流式细胞仪检测复合物的荧 光强度，结果如图14。实验结果表明，在N/P = 20的时候，未经处理的U87MG细胞相较于阻断 的细胞来说表现出较高的荧光强度，且二者相比具有显著性差异，这也表明了 R⑶修饰的纳 米材料对U87MG细胞具有较好的靶向作用。
[0084] 实施例14
[0085] 采用Western Blot来评价U87MG细胞内VEGF蛋白表达情况，评估本发明合成的Au DSNSs作为基因治疗载体的转染效果。将U87MG细胞以5 X IO5个/孔种植于6孔细胞培养板 中，在37°C和5%CO2下培养过夜，使细胞贴壁，弃去培养基，加入PBS、siRNA和本发明制备的 Au DSNSs/siRNA(N/P = 20的DMEM培养基，继续培养24小时，裂解提取U87MG细胞总蛋白，后 将蛋白质变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转膜，免疫反应，ECL化学发光，显影，定 影，最终得到胶片图（图15) JBS作为空白对照，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)作为内参蛋 白。实验结果表明，内参蛋白GADPH的表达量在这三个实验组内保持恒定，而目标蛋白VEGF， 相较于空白对照组PBS处理的细胞表达量而言，单独VEGF siRNA处理的细胞，VEGF蛋白表达 量没有明显变化，而经Au DSNSs/siRNA处理的实验组，U87MG细胞内VEGF蛋白表达量明显减 少。这也证明了本发明合成的载体可以有效地携带siRNA入胞，并且实现基因治疗的目的。
[0086] 实施例15
[0087]为了验证本发明合成的Au DSNSs/siRNA纳米材料具有光热治疗和基因治疗的协 同联合治疗效果，将VEGF siRNA、Au DSNSs和Au DSNSs/siRNA三组材料与细胞共孵育后经 近红外激光照射，最后由CCK8比色法检测细胞存活率来评价纳米材料的治疗效果，PBS作为 空白对照。将U87MG细胞以I X IO4个/孔种植于96孔细胞培养板中，在37°C和5%C02条件下培 养过夜，使细胞贴壁，弃去培养基，分别加入含有PBS、siRNA、Au DSNSs和Au DSNSs/siRNA (N/P = 20)的新DMEM培养基，培养48小时后，将孔板置于808nm的激光下分别照射5分钟，未 经照射的细胞作为对照组，由图16可以看出，当细胞经由Au DSNSs/siRNA复合物处理后，细 胞的存活率在三个实验组中最低，加之激光照射后，细胞存活率又显著降低，达到22%左 右，从而说明Au DSNSs/siRNA可以将光热治疗和基因治疗整合在一个纳米平台上，实现联 合治疗。
[0088] 上述实施例中siRNA和Cy3-siRNA两种核酸形式，其中Cy3-siRNA为细胞色素 3标记 的siRNA，类似于一种荧光色素，信息如表1所示：
[0089]表1siRNA 和 Cy3-siRNA 的信息
【主权项】
1. 一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/s iRNA复合物的制备方法，包括： (1) 将柠檬酸三钠溶于超纯水中，快速加入到煮沸的氯金酸溶液里，持续反应，冷却，得 到柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒;其中，柠檬酸三钠与氯金酸溶液的体积比为1.5:10; (2) 将步骤（1)中的柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒加入到氯金酸溶液中，避光搅拌，加入 AgN03和抗坏血酸AA，搅拌反应2~4h，纯化，冷冻干燥，得到金纳米星AuNSs ;其中，HAuCl4、 AA、AgN03 的摩尔比为 500:1:40 ~60; (3) 将过量的巯基乙酸甲酯MTG逐滴加入到第三代聚酰胺-胺树状大分子G3.NH2的超纯 水溶液中，60°C~80°C恒温反应12~48h，透析，冷冻干燥，得到部分巯基封端的聚酰胺-胺 三代树状大分子G3. NH2-SH; (4) 将步骤(3)中的G3 . NH2-SH溶于超纯水中，逐滴加入到步骤(2)中的AuNSs的水溶液 中，搅拌12~24h，离心，洗涤，冷冻干燥，得到树状大分子稳定的金纳米星G3-AuNSs;其中， G3 · NH2-SH与AuNSs的质量比为5~10:1; (5) 将6-(马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NHdg合于DMSO溶液中，搅 拌反应8-10小时，得到⑶0H-PEG-MAL;然后再将充分溶解于DMS0中的巯基封端的RGD即SH-RGD逐滴加入到⑶0H-PEG-MAL的DMS0溶液中，搅拌反应1~2天，透析，冷冻干燥，即得到 C00H-PEG-RGD;其中，SH-RGD: 6-M: C00H-PEG-NH2 的摩尔比为 1:1 ~1.2:1 ~1.2; (6) 将步骤（5)中的C00H-PEG-R⑶经过EDC和NHS活化，然后加入到步骤(4)中G3-AuNSs 的DMS0分散液中，搅拌反应2~4天，离心，洗涤，冷冻干燥，得到Au-G3-PEG-RGD NSs，简称Au DSNSs;其中，C00H-PEG-RGD与Au DSNSs中树状大分子的摩尔比为4~6:1; (7) 将步骤(6)中的Au DSNSs与VEGF siRNA共同孵育15-20分钟，得到复合物Au DSNSs/ siRNA〇2. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中煮沸的时间为15~20分钟。3. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒与氯金酸溶液的体 积比为1:100~125。4. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤⑶MTG与G3. NH2的摩尔比为18~20:1。5. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(5)中透析为用截留分子量1000的透析袋 透析3天。6. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中C00H-PEG-NH 2的分子量为2000。7. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中C00H-PEG-RGD、EDC和NHS的摩尔比为1:8~10:8 ~10〇8. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤（6 )中活化时间为2~4 h ;离心的转速为7 0 0 0 -8000rpm，时间为20min。9. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中VEGF s iRNA规格为100D。10. 根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合 物的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中Au DSNSs与VEGF siRNA的N/P为10:1~25:1。
【专利摘要】本发明涉及一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，包括：柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，种子生长法AuNSs；将过量的MTG滴加入到G3.NH2的溶液中，恒温反应得G3.NH2-SH，然后滴加入到AuNSs水溶液中，搅拌得G3-AuNSs；将6-M与COOH-PEG-NH2反应得COOH-PEG-MAL；然后SH-RGD与COOH-PEG-MAL反应得COOH-PEG-RGD，活化后加入到G3-AuNSs的DMSO分散液中，反应得Au？DSNSs，与VEGF？siRNA共同孵育，即得。本发明反应条件温和，工艺简单，易于操作，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
【IPC分类】B22F9/24, C12N15/87, B82Y40/00, A61K48/00, A61K49/00, A61K41/00, A61P35/00
【公开号】CN105665736
【申请号】CN201610018168
【发明人】沈明武, 韦平, 胡勇, 史向阳
【申请人】东华大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月12日