于氘代DMSO中进行核磁共振分析(1H NMR)(见 图5a)。从图中可以看出，在7.3和7.4ppm处出现的谱峰证明R⑶成功连接到PEG上，并通过峰 面积积分可知，每一个PEG上连接0.35个RGD。
[0064] 实施例4
[0065] 将实施例3中制备的25mg C00H-PEG-RGD、15.99mg EDC和9.60mg NHS混合溶解于 5mL DMSO后，搅拌活化4h;将实施例1中制备的G3-AuNSs用DMSO洗涤后，重新分散于IOmL DMSO中，然后将活化的C00H-PEG-RGD(5mL)溶液逐滴加入到G3-AuNSs(10mL)的DMSO溶液中， 搅拌反应4天，再磁分离洗涤，即得Au-G3-PEG-RGD NSs，并分散于IOmL水中，同样的方法合 成对照组材料Au-G3-mPEG NSs。为了检测C00H-PEG-RGD在G3. NH2上的上载率，取3mg合成的 Au-G3-PEG-RGD NSs溶于氘代DMSO中进行核磁共振分析(1H NMR)(见图5b)并通过峰面积积 分可知，每个G3. NH2上连接了 0.72个RGD。
[0066] 实施例5
[0067]在CT成像中，造影剂对X射线的衰减起重要作用。将实施例4制备的AU-G3-PEG-RGD NSs通过ICP-OES测试法测定溶液中Au元素的浓度，然后在EP管中用超纯水配制Au浓度依次 为0.01、0.02、0.04、0.06和0.08mM的水溶液2mL用于评价其CT成像效应。如图6所示。结果表 明随着金浓度的增加，纳米颗粒的CT信号强度也随之增加。并且从CT值随金浓度变化的线 性拟合图可以看出复合纳米颗粒的CT值随着金浓度的变化具有很好的线性关系。说明了本 发明的AU-G3-PEG-RGD NSs有望用作CT成像的造影剂。
[0068] 实施例6
[0069] 为了评价本发明制备的纳米材料的在近红外激光照射下的升温效果，依据实施例 5测得的Au元素的浓度，在EP管中用超纯水配制Au浓度依次为1、5、10、15和20mM的水溶液各 0.2mL，以等体积的水和金种子水溶液为对照，用808nm激光照射，观察温度变化情况(见图 7)。结果表明水和金种子在照射后5分钟，温度仅稍微的升高。而对于Au-G3-PEG-RGD NSs， 随着照射时间的延长，纳米星水溶液的温度明显增加。而且随着Au浓度的增加，温度的增加 更加明显。
[0070] 实施例7
[0071] 通过CCK8比色法来评价Au-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs对细胞增殖的影 响。以U87MG细胞为靶向细胞评价实施例4制备的靶向组材料Au-G3-PEG-RGD NSs和对照组 材料Au-G3-mPEG NSs对细胞增殖的影响。用无菌PBS配置不同浓度的Au-G3-PEG-RGD NSs的 PBS溶液。U87MG细胞种植于96孔板分别与Au-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs(Au浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mM)在37 °C下共培养24小时。然后换为新的培养液I OOyL，后加入10μ L CCK8，继续在37°C下培养4小时后，在450nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力 (见图8)，不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS为对照进行比较。与PBS对照组相 比，Au-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs在Au的实验浓度为0.2-0.8mM范围内对U87MG细 胞的存活率的影响没有显著性差异，细胞存活率均在80%以上。即使Au的实验浓度达到 I .OmM，才显示出较低的细胞毒性，这充分说明合成的Au-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs均具有良好的生物相容性。
[0072] 实施例8
[0073]以U87MG细胞为模型细胞，在808nm激光照射下评价Au DSNSs对细胞的杀伤作用。 用无菌PBS配置不同浓度的Au DSNSs的PBS溶液。U87MG细胞与本发明制备的Au DSNSs(Au浓 度为0.2、0.4、0.6和0.8mM)共培养6小时后用808nm激光器照射5分钟，未照射的细胞用作对 照组。然后，向培养板孔中加入IOyL CCK8，继续在37°C下培养4小时后，在450nm处测量吸光 值，并根据此值计算细胞的活力（见图9)。结果表明随着浓度的增加，未照射的细胞仍然保 持很高的细胞存活率;而经过激光照射5分钟，细胞表现出凋亡趋势，并且随着金浓度的增 加，细胞的存活率越低。在材料浓度为〇. 8mM时，激光照射5分钟，细胞存活率仅为40 %左右， 该实验结果说明实施例4制备的Au DSNSs在近红外激光照射下能引起细胞的凋亡。
[0074] 实施例9
[0075] 凝胶阻滞实验用于表征载体对SiRNA的包裹能力，首先采用定氮试剂盒法测出本 发明制备的Au DSNSs的氨基数量，然后按照Au DSNSs与VEGF siRNA N/P分别为0.25,0.5， 1.0,2.0,3.0和4.0的比例进行孵育15-20分钟，进行琼脂糖凝胶电泳(见图10)。实验结果表 明实施例4所制备的Au-G3-PEG-RGD NSs可以在较低N/P(N/P = 2)下与VEGF siRNA很好复 合，将VEGF s iRNA完全阻滞，说明这种载体具有很好的s iRNA包裹能力。
[0076] 实施例10
[0077] 粒径和表面电势测试用于表征载体Au DSNSs携带VEGF siRNA的入胞能力。将实施 例4制备的Au DSNSs与5yL VEGF 8丨1?祖(103=1〇，15,2〇,25)复合后，终体积固定在1〇(^1^， 室温下孵育20min，然后加入ImL的roS。采用马尔文激光粒度仪(Malvern，MK，633nm激光)对 其粒径和表面电势进行了表征，结果如图11所示。测量结果表明，Au DSNSs/siRNA复合物的 大小在合适转染的尺寸范围内，且复合物电势在N/P= 10,15,20时相差不大，都在适合转染 的电势范围内。
[0078] 实施例11
[0079] 通过流式细胞仪检测制备的411〇3奶8/^73-8丨1?财的1]871?；细胞吞噬效率。将2\ IO5个/孔U87MG细胞种植于12孔细胞培养板中，在37 °C和5 % CO2下培养过夜，使细胞贴壁，然 后弃去培养基，将带有Cy3标记的VEGF siRNA与Au DSNSs按照不同的N/P复合(N/P= 10，15， 20,25)共同孵育15-20分钟，用含有此复合物的DMEM培养液替换并在37°C和5%⑶2下与 U87MG细胞共培养4小时。培养结束后用PBS清洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在 ImL PBS中，通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度(见图12)。实验结果表明，在N/P = 20 的时候，荧光强度最高，VEGF siRNA的传递效率最好。
[0080] 实施例12
[00811采用共聚焦显微镜来进一步探究Au DSNSs与Cy3-siRNA复合物在胞内的定位及细 胞吞噬量。先将盖玻片放置于12孔细胞培养板中并用DMEM培养基浸泡12h，然后每孔补充 l.OmL培养基并接种2X105个/孔U87MG细胞，培养一天。然后再将U87MG细胞分别与含有 卩85、8丨1?祖和本发明制备的41105吧8/^73-8丨1?熟0/?=10，15,20,25)的01^]\1培养液在371€ 和5%C02下共培养4小时。然后在油镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后的荧光信号(见图13)。从 图中可以看出，经过PBS处理的细胞内没有荧光，经过单独的VEGF Cy3-siRNA转染的细胞有 少量微弱的荧光，而经过不同N/P的Au DSNSs与Cy3-siRNA复合物处理的细胞均显示出了较 高的荧光强度，其中与流式细胞术结果相符。当N/P = 20的时候，U87MG细胞内的荧光强度最 强，基因传递效率最尚。
[0082] 实施例13
[0083]为了验证RGD修饰的功能化金纳米星对模型细胞U87MG具有靶向作用，自由RGD阻 断实验用于表征载体的靶向转染能力，在U87MG细胞培养基中添加自由的RGD-SH来阻断ανβ3 整合素的表达，使用Au DSNSs与Cy3-siRNA复合物分别转染未经处理的U87MG细胞和阻断的 细胞。将自由的RGD-SH加入到U87MG细胞的培养基中，作用1-2小时，再加入I 3BSdiRNA和A