专利名称：有机酸的制造方法
技术领域：
本发明是关于使用细菌来制造有机酸的方法。
背景技术：
以发酵来生产琥珀酸等时，通常使用厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)属、放线杆菌(Actinobacillus)属等的厌氧细菌(美国专利公开号5,143,834、美国专利公开号5,504,004以及International Journal of Systematic Bacteriology(1999)，49，207-216)。使用厌氧细菌的时候，产物的收率高，但另一方面，由于为了增殖而需要很多的营养素，在培养基中添加大量的CSL等有机氮源是必要的。这些有机氮源的大量添加不仅会带来培养基成本的增加，还涉及到在取出产物时精制成本的增加，不经济。
另外，下述方法也是已知的在好氧性条件下一度培养好氧细菌使菌体增殖之后，收集细菌、洗净、不通氧气以静止菌体生产有机酸(特开平11-113588号公报)。在这种情况下，在使菌体增殖时，有机氮的添加量少比较好，由于用简单的培养基就能够充分地增殖而比较经济，但目的有机酸的生成量或每个菌体的生产速度还不足够，希望建立更优良的方法。
此外，通过将细菌重复培养的连续培养来制备L-谷氨酸或L-天冬氨酸的方法也是已知的(特开昭62-48394号公报、以及特开平5-260985号公报)。然而，使用棒状杆型细菌(コリネ型细菌)、杆菌属细菌、或根瘤菌属细菌等的细菌，尤其是通过在厌氧条件下将细菌重复培养来制备琥珀酸的方法，到目前为止没有报道。
发明内容
本发明以提供发酵效率很高的有机酸的制造方法为所要解决的课题。
本发明者为解决上述课题进行锐意研究，结果发现通过将在生产上使用过一次或一次以上的菌体进行再利用来提高有机酸的生产速度和收率。本发明是基于这些发现而完成的。
也就是说根据本发明提供如下发明。
(1)通过在含有有机原料的水性反应液中使细菌菌体或其处理物作用而由该有机原料制备有机酸的方法，其特征在于，回收反应后的水性反应液，从回收的水性反应液中分离菌体或其处理物，通过使分离的菌体或其处理物在新的水性反应液中作用，重复使用菌体或其处理物。
(2)(1)中所述的方法，其中细菌选自棒状杆型细菌、杆菌属细菌或根瘤菌属细菌中的任意一种。
(3)(1)或(2)中所述的方法，其中细菌是与该细菌的野生型相比乳酸生产能力降低至10％或10％以下的变异株。
(4)(1)～(3)中任一项所述的方法，其中使用缺乏乳酸脱氢酶(LDH)的细菌。
(5)(1)～(4)中任一项所述的方法，其中反应液含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体。
(6)(1)～(5)中任一项所述的方法，其中在含有有机原料的水性反应液中，在厌氧氛围气下，使细菌菌体或其处理物作用。
(7)(1)～(6)中任一项所述的方法，其中有机原料是葡萄糖。
(8)(1)～(7)中任一项所述的方法，其中菌体或其处理物的重复使用次数是3次或3次以上。
(9)(1)～(8)中任一项所述的方法，其中有机酸是琥珀酸、苹果酸或富马酸。
(10)(1)～(9)中任一项所述的方法，其中将反应结束后的水性反应液的全部量直接用于下一次的反应。
(11)(1)～(10)中任一项所述的方法，其中有机酸的第2次以后的生产量是第一次生产量的80％或80％以上。
(12)(1)～(11)中任一项所述的方法，其中琥珀酸的第2次以后的生产量是第一次生产量的80％或80％以上。
(13)含有有机酸的组合物，其是根据(1)～(12)中任一项方法制备的。
(14)权利要求13中所述的含有有机酸的组合物，其中有机酸是琥珀酸。
(15)制备含有有机酸的聚合物的方法，其包括根据(1)～(12)中任一项方法来制备有机酸的工序以及以所得的有机酸作为原料来进行聚合反应的工序。
(16)(15)中所述的制备含有有机酸的聚合物的方法，其中有机酸是琥珀酸。
实施发明的最佳方式以下就本发明的实施方式进行详细说明。
本发明在于有机酸的制备方法，其特征是是通过使用细菌菌体的反应来制备有机酸，并将在制备中使用一次以上的菌体的50％或50％以上再利用。想要以使用棒状杆型细菌进行的厌氧发酵来制备乳酸时，乳酸的生产量由于重复使用菌体而显著下降。与此相对比，在本发明中，发现了即使重复使用菌体也不会特别地使琥珀酸的生产量下降。
在本发明方法中，通过使细菌的菌体或其处理物在含有有机原料的水性反应液中作用而由该有机原料制备有机酸时，回收反应结束的水性反应液，从回收的水性反应液中分离菌体或其处理物，通过使分离的菌体或其处理物在新的水性反应液中作用而再次进行有机酸的制备。同上所述，本发明的方法是以重复使用菌体或其处理物为特征的。
在本发明中使用的细菌，只要是具有生产有机酸的能力即可没有特别限定，但其中优选芽孢杆菌属(Bacillus)、根瘤菌属(Rizobium)或棒状杆型细菌等好氧细菌。
上述好氧细菌中优选的是棒状杆型细菌，作为棒状杆型细菌而优选的可以列举出属于棒杆菌属的微生物、属于短杆菌属的微生物或属于节杆菌属属的微生物。其中优选的可以列举出属于棒杆菌属或短杆菌属的微生物，更优选的是属于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)或乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的微生物。
上述微生物的特别优选的具体例子，可以列举出黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MJ-233(FERM BP-1497)、黄色短杆菌MJ-233AB-41(FERM BP-1498)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)ATCC6872、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC31831、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869。
在本发明方法中使用的上述微生物，不仅是野生株，通过UV照射或NTG处理等通常变异处理而得到的变异株、通过细胞融合或者是基因重组法等遗传学手法诱导的重组株等的任何株都可以。还有，作为上述基因重组株的宿主，只要是可以转化的微生物，与亲株是同属的可以，不同属的也可以，以上述的好氧细菌作为宿主是优选的。
这其中，在本反应中，使用缺乏乳酸脱氢酶的变异株是非常有效的。作为棒状杆型细菌的乳酸脱氢酶缺乏变异株的具体制备方法，可以列举出特开平11-205385号公报中所述的方法，按照该方法可以简单地制备。
在本发明中也可以使用菌体的处理物。作为菌体的处理物是指例如用丙烯酰胺、角叉菜胶等将菌体固定化的固定化菌体，将菌体破碎后的破碎物，其离心分离的上清液，或者用硫酸铵处理等将其上清液部分精制得的级分等。还有，为了在本发明的方法中使用好氧性棒状杆型细菌，优选首先将菌体在通常的好氧条件下培养然后再使用。培养所使用的培养基，可以使用通常微生物培养能够使用的培养基。例如可以使用硫酸铵、磷酸钾、硫酸镁等无机盐组成上添加了肉膏、酵母提取物、蛋白胨等天然营养源的一般培养基。培养后的菌体通过离心分离、膜分离等进行回收，用于如下所示的反应中。
在本反应中使用上述细菌时，可以将在琼脂培养基等固体培养基中斜面培养的细菌直接用于反应，但优选使用将上述细菌在预先的液体培养基(种培养)中培养了的细菌。
作为为了对这些细菌进行培养以及反应而使用的培养基的有机原料，只要是该微生物能够利用的碳源就没有特别的限定，通常使用半乳糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、砂糖、蔗糖、淀粉、纤维素等碳水化合物，甘油、甘露醇、木糖醇、核糖醇等多元醇类发酵性糖质，其中优选葡萄糖、果糖、甘油，特别优选葡萄糖。
此外，也可以使用含有上述发酵性糖质的淀粉糖化液、糖蜜等。这些发酵性糖类可以单独使用也可以组合使用。
上述碳源的使用浓度没有特别的限定，但在不阻碍有机酸生成的范围内，尽可能的高是有利的，通常在5～30％(w/V)优选在10～20％(W/V)范围内进行反应。
此外，根据与反应进行相伴随的上述碳源的减少，也可以追加添加碳源。
作为氮源，只要是该微生物能够利用的氮源就没有特别的限定，但具体地可以列举出铵盐、硝酸盐、尿素、大豆水解物、酪蛋白分解物、蛋白胨、酵母提取物、肉膏、玉米浆等的各种有机、无机的氮化合物。
作为无机盐，可以使用各种磷酸盐，硫酸盐，镁、钾、锰、铁、锌等金属盐。
此外，根据必要添加生物素、泛酸、肌醇、烟酸等维生素类，核苷酸、氨基酸等促进生育因子。
此外，为了抑制反应时的起泡，可以在培养液中预先添加适量的市售消泡剂。
作为本发明中使用的反应液，可以使用水、缓冲液、培养基，但优选使用培养基。可以使培养基中含有例如上述的有机原料和碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体，在厌氧条件下反应。碳酸根离子或碳酸氢根离子由碳酸或重碳酸或者它们的盐或二氧化碳气体来提供。作为碳酸盐或碳酸氢盐的具体例子可以列举出碳酸铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾等。这样添加碳酸根、碳酸氢根离子的浓度为1～500mM，优选2～300mM，更优选3～200mM。在使含有二氧化碳气体的情况下，每1L溶液中含有50mg～25g二氧化碳气体，优选100mg～15g，更优选150mg～10g。
培养液和反应液的pH，通常调整到pH5～10，优选pH6～9.5，也可在反应中根据必要以碱性物质、碳酸盐、尿素等调节到上述范围内。
本反应中使用的微生物的繁育最适温度通常是25℃～35℃。反应时的温度通常是25℃～40℃，优选30℃～37℃。
反应通常进行5小时至120小时。反应所用的菌体的量没有特别的规定，可以用1～700g/l，优选10～500g/l，更优选20～400g/l。
在培养时，通气、搅拌和供给氧是必要的。在反应时，可以通气、搅拌，但可以不通气、不供给氧。本发明中所述的厌氧条件是指降低溶液中溶解氧的浓度来反应。在这种情况下，作为溶解的氧的浓度，希望是以0～2ppm，优选0～1ppm，更优选0～0.5ppm来反应。作为为了达到此目的的方法，可以采用例如将容器密闭不通气来反应、供给氮气等不活性气体来反应、通含有二氧化碳气体的不活性气体等。
有机酸的合成反应通常可以以培养液中葡萄糖等有机原料被消耗掉的时间点作为反应结束。此时，在反应液中生成了琥珀酸、苹果酸或富马酸等有机酸。其中，琥珀酸因是蓄积度最高的产物而优选。
在本发明中，回收反应后的水性反应液，但这里所说的“反应后”是指残留的有机原料(例如葡萄糖等)在初期添加量的50％或50％以下，优选在20％或20％以下，更优选在5％或5％以下，或者是残留原料的浓度在5重量％或5重量％以下，优选在2重量％或2重量％以下，更优选在0.5重量％或0.5重量％以下。
在本发明中，如上所述，回收有机酸合成反应结束后的水性反应液，从回收的水性反应液中分离菌体或其处理物，通过使分离的菌体或其处理物在新的水性反应液中作用来再次进行有机酸的制备。从回收的水性反应液中对菌体或其处理物的分离，可以以离心分离等本领域人员公知的方法来进行。
此外，可以使用回收的水性反应液的全部量或其一部分来分离菌体或其处理物，但优选使用回收的水性反应液的全部量。使分离的菌体或其处理物在新的水性反应液中作用，但这里所说的新的水性反应液是指含有葡萄糖等有机原料的水性反应液。
在重复使用上述菌体或其处理物的情况下，有机酸的第2次以后的生产量优选是第一次生产量的80％或80％以上，更优选90％或90％以上，特别优选95％或95％以上。特别优选的例子中，琥珀酸的第2次以后的产量是第一次产量的80％或80％以上，更优选90％或90％以上，特别优选95％或95％以上。
在本发明中，可以将菌体或其处理物重复使用2次或2次以上。重复的次数优选3次或3次以上，其上限是在能生产有机酸的限度内没有特别限定，可以重复例如10次、20次、30次或在其之上的任意次数。
在根据上述本发明的方法所得的反应液中，生成了琥珀酸、苹果酸或富马酸等有机酸。含有该有机酸的组合物本身也在本发明的范围内。作为含有有机酸的组合物，琥珀酸蓄积度高的是特别优选的。
此外，在反应液(培养液)中蓄积的有机酸可以按照通常的方法从反应液中分离、精制。具体地是，可以通过离心分离、过滤等将菌体等固形物除去之后，以离子交换树脂等脱盐，通过从溶液中结晶化或者柱色谱法将有机酸进行分离、精制。
还有，在本发明中，可以在根据上述本发明方法制备了有机酸后，通过以所得的有机酸作为原料进行聚合反应制备含有有机酸的聚合物。
近年来，顾及环境的工业制品数量正在增加，对采用来源于植物的原料的聚合物的越来越受到关注，本发明中制备的有机酸可以用来加工成叫做聚酯或聚酰胺的聚合物。此外，这样的有机酸可以用作食品添加物或者医药品、化妆品中的直接或中间体。
以下举出实施例来对本发明进行更详细的说明，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例(实施例1)按照特开平11-206385号公报，由黄色短杆菌MJ233AB-41(FERMBP-1498)制备缺乏乳酸脱氢酶(LDH)的株MJ233AB-41LDH(-)株。即，以根据通常的方法由MJ-233株提取的全DNA作为模板，使用特开平11-206385号公报中所述的两个引物(CARAARCCNG GNGARAC(序列号1)、以及TCNCCRTGYT CNCCNAT)(序列号2)进行PCR反应(但是，R是指A或G，Y是指C或T，N是指A、G、C或T)。将所得的反应液3μl和PCR产物克隆用载体pGEM-T(由PROMEGA可商业获得)1μl混合，添加50mM tris缓冲液(pH7.6)、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP、10mM MgCl2以及T4DNA连接酶1个单位的各成分，在4℃反应15小时，使结合。用得到的质粒混合液，通过氯化钙法将大肠杆菌JM109(宝酒造制)进行转化，涂布到含有氨苄青霉素50mg的培养基(胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g以及琼脂16g溶解于1L蒸馏水中)上。
将该培养基上的生育株按照通常的方法进行液体培养，由培养液制备质粒DNA。向20μl的该质粒DNA中添加50mM tris缓冲液(pH7.5)、1mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2、100mM NaCl、限制酶SphI以及SalI 1个单位的各成分，在37℃反应1小时。使用Gene Clean II(フナコシ社制)从得到的DNA溶液中进行300bp片断的回收，将该DNA溶液10μl与耐氯霉素的克隆用载体pHSG396(宝酒造制)1μl的SphI以及SalI分解物混合，添加50mMtris缓冲液(pH7.6)、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP、10mM MgCl以及T4DNA连接酶1个单位的各成分，在4℃反应15小时，使结合。用得到的质粒混合液，通过氯化钙法将大肠杆菌JM109(宝酒造制)进行转化，涂布到含有氨苄青霉素50mg的培养基(胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g以及琼脂16g溶解于1L蒸馏水中)上。
将该培养基上的生育株按照通常的方法进行液体培养，由培养液制备质粒DNA。通过电脉冲法将该质粒导入到黄色短杆菌MJ-233中，涂布到含有氯霉素5mg的培养基(尿素2g，硫酸铵7g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸一氢钾0.5g，硫酸镁·7水合物0.5g，硫酸亚铁·7水合物20mg，硫酸锰·水合物20mg，D-生物素200μg，盐酸硫胺素200μg，酵母提取物1g，水解酪蛋白氨基酸1g，以及琼脂16g溶解于1L蒸馏水中)上。在该培养基上生育的菌株中，选择LDH活性为十分之一或十分之一以下的株作为MJ233AB-41LDH(-)株。
培养基尿素4g，硫酸铵14g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸一氢钾0.5g，硫酸镁·7水合物0.5g，硫酸亚铁·7水合物20mg，硫酸锰·水合物20mg，D-生物素200μg，盐酸硫胺素200μg，酵母提取物1g，水解酪蛋白氨基酸1g，以及蒸馏水1000ml，将100mL的该培养基放入到500mL的三角烧瓶中，于120℃加热20分钟灭菌。将其冷却至室温，添加预先灭菌了的50％葡萄糖水溶液4ml、无菌过滤过的0.1％氯霉素水溶液5ml，接种前述的MJ233AB-41LDH(-)株，于30℃进行种培养24小时。
培养基尿素1.6g，硫酸铵5.6g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸一氢钾0.2g，硫酸镁·7水合物0.2g，硫酸亚铁·7水合物8mg，硫酸锰·水合物8mg，D-生物素80μg，盐酸硫胺素80μg，酵母提取物0.4g，水解酪蛋白氨基酸0.4g，消泡剂(アデカノ-ルLG294旭电化制)0.4ml以及蒸馏水200ml，将该培养基放入到1L的发酵槽中，于120℃加热20分钟灭菌。将其冷却至室温后，添加预先灭菌了的20％葡萄糖水溶液200ml，向其中加入前述的种培养液的全部量，在30℃保温。用2M的碳酸钠将pH保持在8.0，在通气(在反应中使反应液中的溶解氧保持在2ppm以下)每分钟100mL、搅拌每分钟400转下进行反应。31小时之后，葡萄糖几乎已都被消耗掉，琥珀酸蓄积为31g/L。
(实施例2)
通过将实施例1中得到的全部培养液以10000rpm离心分离10分钟来收集细菌，添加与实施例1相同的培养基，在30℃保温。用2M碳酸钠将pH保持在8.0，在通气(在反应中使反应液中的溶解氧保持在2ppm以下)每分钟100mL、搅拌每分钟400转下进行反应。21小时之后，葡萄糖几乎已都被消耗掉，各种有机酸蓄积为琥珀酸42g/L、富马酸2.2g/L、醋酸3.7g/L、苹果酸0.8g/L、丙酮酸1.9g/L、草酰醋酸0.1g/L。
(实施例3)通过将实施例2中得到的全部培养液以10000rpm离心分离10分钟来收集细菌，添加与实施例1相同的培养基，在30℃保温。用2M碳酸钠将pH保持在8.0，在通气(在反应中使反应液中的溶解氧保持在2ppm以下)每分钟100mL、搅拌每分钟400转下进行反应。20小时之后，葡萄糖几乎已都被消耗掉，各种有机酸蓄积为琥珀酸47g/L、富马酸1.3g/L、醋酸12g/L、苹果酸0.6g/L、丙酮酸2.0g/L、草酰醋酸0.1g/L。
(实施例4～11)在与实施例3相同的条件下反应。22小时后，终止反应，重复使用。各种有机酸的产量在下表1中表示。
表1
产业上应用的可能性根据本发明的方法，基于使用细菌制备有机酸，可以高反应速度和高收率的得到目的物。
本申请是要求基于2003年7月9日提出的日本专利申请(特愿2003-194240)的优先权的申请，其内容在本说明书中引入作为参考。此外，本说明书中引用的文献内容也在本说明书中引入作为参考。
序列表<110>三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation)Ajinomoto Co.，Inc.
<120>有机酸的制造方法<130>A41540A<160>2<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>n代表任意碱基<220>
<221>misc_feature<222>(12)<223>n代表任意碱基<400>1caraarccng gngarac 17<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<220>
<221>misc_feature<222>(3)<223>n代表任意碱基<220>
<221>misc_feature<222>(12)<223>n代表任意碱基<220>
<221>misc_feature<222>(15)<223>n代表任意碱基<400>2tcnccrtgyt cnccnat 1权利要求
1.通过在含有有机原料的水性反应液中使细菌菌体或其处理物作用而由该有机原料制备有机酸的方法，其特征在于，回收反应后的水性反应液，从回收的水性反应液中分离菌体或其处理物，通过使分离的菌体或其处理物在新的水性反应液中作用，重复使用菌体或其处理物。
2.权利要求1中所述的方法，其中细菌选自棒状杆型细菌、杆菌属细菌或根瘤菌属细菌中的任意一种。
3.权利要求1或2中所述的方法，其中细菌是与该细菌的野生型相比乳酸生产能力降低至10％或10％以下的变异株。
4.权利要求1～3中任一项所述的方法，其中使用缺乏乳酸脱氢酶(LDH)的细菌。
5.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中反应液含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体。
6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中在含有有机原料的水性反应液中，在厌氧氛围气下，使细菌菌体或其处理物作用。
7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中有机原料是葡萄糖。
8.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中菌体或其处理物的重复使用次数是3次或3次以上。
9.权利要求1～8中任一项所述的方法，其中有机酸是琥珀酸、苹果酸或富马酸。
10.权利要求1～9中任一项所述的方法，其中将反应结束后的水性反应液的全部量直接用于下一次的反应。
11.权利要求1～10中任一项所述的方法，其中有机酸的第2次以后的生产量是第一次生产量的80％或80％以上。
12.权利要求1～11中任一项所述的方法，其中琥珀酸的第2次以后的生产量是第一次生产量的80％或80％以上。
13.含有有机酸的组合物，其是根据权利要求1～12中任一项方法制备的。
14.权利要求13中所述的含有有机酸的组合物，其中有机酸是琥珀酸。
15.制备含有有机酸的聚合物的方法，其包括根据权利要求1～12中任一项方法来制备有机酸的工序以及以所得的有机酸作为原料来进行聚合反应的工序。
16.权利要求15中所述的制备含有有机酸的聚合物的方法，其中有机酸是琥珀酸。
全文摘要
本发明以提供发酵效率很高的有机酸的制造方法为所要解决的课题。根据本发明通过在含有有机原料的水性反应液中使细菌菌体或其处理物作用而由该有机原料制备有机酸的方法，其特征在于，回收反应后的水性反应液，从回收的水性反应液中分离菌体或其处理物，通过使分离的菌体或其处理物在新的水性反应液中作用，重复使用菌体或其处理物。
文档编号C07C57/15GK1820076SQ20048001949
公开日2006年8月16日 申请日期2004年7月8日 优先权日2003年7月9日
发明者山岸兼治 申请人:三菱化学株式会社, 味之素株式会社