在核酸固相上的吸附的制作方法

专利名称：在核酸固相上的吸附的制作方法
专利说明在核酸固相上的吸附 本发明涉及一种将核酸吸附，也就是以非共价键方式连接至固相上的方法。更进一步，本发明涉及一种从生物样品中分离核酸的方法。
许多生物物质，尤其是核酸，在将其从它们所存在的自然环境中分离出来时特别的困难。一方面，它们的浓度通常都很低，另一方面，它们经常包含在许多其他的固体物质和溶解物，例如细胞裂解物中。这使得它们难以被分离或测定，特别是在针对特定的核酸检测或核酸的特异性检测的生物特异性试验中。这些生物特异性试验在研发中的诊断学以及生物分析学领域起着重要的作用。生物特异性试验的例子有杂交试验、免疫试验和受体-配体试验。杂交试验利用特异性的碱基配对来对核酸分析物例如RNA和DNA进行分子检测。此时，18至20个核苷酸长度的寡核苷酸探针就能够特异性地识别所选择的互补序列，例如在人类基因组中的序列。另一个需要两个寡核苷酸引物选择性结合的试验是US4683195中所描述的聚合酶链式反应(PCR)。这种方法允许在脱氧核苷三磷酸存在时通过热稳定性聚合酶在儿个循环后将特定的核酸区域选择性地扩增至可检测水平。
如上所述，在核酸可以用上述试验之一进行分析或用于其它程序之前，必须将它们从生物样品中，从含有不同成分例如蛋白质和非蛋白质成分的复杂混合物中分离或纯化出来。通常第一步是将感兴趣的成分，例如核酸，进行富集。这些成分经常包含在细菌的细胞、真菌细胞、病毒颗粒、或一个更复杂的生物体的细胞，例如人血细胞或植物细胞中。核酸作为一种感兴趣的成分也可以被称为“目标成分”。
可以用酶或化学物质处理所述的细胞或颗粒，以使这些组织的细胞壁和细胞膜溶解、降解或变性来释放内容物。该步骤通常被称为裂解。所得到的含有裂解的物质的溶液称为细胞裂解液。在细胞裂解中经常遇到的一个问题是其它的酶会降解目标成分，例如可降解核酸的脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶，在细胞裂解过程中它们与目标成分接触而降解核酸。这些降解酶在细胞裂解前就可能存在于细胞外或细胞空间内不同的区室中，而此时得以与目标成分接触。在这个过程中另一些成分可能被释放，例如属于脂多糖家族的内毒素，它对细胞是有毒的，并可能使计划用于人或动物治疗用途的产品产生问题。
在细胞裂解步骤后接下来的样品制备步骤中，核酸被进一步富集。核酸在被用于基于探针的试验前，通常要从复杂的细胞裂解混合物中提取出来。有几种核酸提取的方法。序列依赖性的或生物特异性的方法包括例如亲和层析或与固定化的探针进行杂交。非序列依赖性的或物理化学的方法包括了例如，采用苯酚—氯仿进行的液相—液相抽提、用纯乙醇或异丙醇沉淀、用滤纸提取、用胶束形成剂如十六烷基三甲基溴化铵提取、与固定化的嵌入染料如吖啶类衍生物结合、吸附于基质如硅胶或硅藻土上、在离液序列高的条件下吸附于可磁性吸引的玻璃颗粒(MGP)或有机硅烷颗粒上。优选核酸与一种基质例如具有硅石表面的材料直接结合，因为除非其他原因，核酸不必被修饰，甚至天然的核酸也可以被结合。
虽然其他表面也可以吸附核酸，但玻璃表面对核酸的吸附更有利于达到分离的目的。
通过细胞裂解和/或细胞器如线粒体、质体、细胞核或其他含有核酸的细胞器的裂解所释放的核酸，可通过与固相比如无机基质结合，洗涤所述结合有核酸的无机基质并从所述的无机基质上释放所述核酸的方式而得以纯化。
在离液序列高的盐存在的条件下，玻璃颗粒或硅石颗粒吸附核酸是本领域公知的(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619)并为核酸的层析纯化及分离工艺提供了基础。利用高浓度的离液序列高的盐，例如碘化钠、高氯酸钠和硫氰酸胍从细胞裂解液中分离纯化RNA和DNA的方法也是本领域的公知技术(Boom，R.等，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503；Yamada，O.等，J.Virol.Methods 27(1990)203-209)。Marko，M.A.等在Anal.Biochem.121(1982) 382-387中描述了在高氯酸钠存在时利用玻璃粉从细菌中纯化质粒DNA。DE3724442中描述了通过醋酸沉淀噬菌体颗粒并通过高氯酸盐裂解噬菌体颗粒，然后利用玻璃纤维滤器分离单链M13噬菌体DNA的方法。在将结合于玻璃纤维滤器上的核酸洗涤后，用含有甲醇的Tris/EDTA缓冲液进行洗脱。Jakobi，R等在Anal.Biochem.175(1988)196-201中描述了一个类似的从λ噬菌体中纯化DNA的方法。该方法需要使核酸在高氯酸盐溶液中选择性地与玻璃表面结合并使得核酸与污染物例如琼脂糖、蛋白质或细胞碎片分离。为了使玻璃颗粒与污染物分离，可以对玻璃颗粒进行离心或将液体倒入玻璃纤维滤器中进行分离。但是该步骤有局限性，它不能用于大量样品的处理。
在加入盐和乙醇进行沉淀后，用磁性颗粒来固定核酸更为有利，这一方法在如Alderton，R.P.等，Anal.Biochem.201(1992)166-169及WO9100212中有所描述。在这一方法中，将核酸粘着于磁性颗粒上。通过施加磁场及洗涤步骤就可将粘着物与原溶液分离。经过一次洗涤后，将核酸溶解到Tris缓冲液中。但是这个方法还存在缺点，其中的沉淀过程对于核酸来说是不具有选择性的，而是还粘着许多固体及溶解物。因此，这种方法不能用来除去任何可能存在的有效量的特定酶反应的抑制因子。磁性的多孔玻璃也可以在市场上买到，它在多孔的、特殊的玻璃基质中含有磁性颗粒并覆盖有一层链霉亲和素膜。如果通过复杂的制备步骤将其修饰使之能与生物素以共价键结合，该产品就可用于生物物质，例如蛋白质或核酸的分离。可磁化的特殊吸附剂已被证明适用于自动样品制备且是非常高效的。亚铁磁性的和铁磁性的以及超顺磁性的色素也被用于此目的。最优选的MGPs在WO0137291中有所描述。
通过在高盐浓度下将核酸吸附于某种基质如无机基质来纯化核酸的方法也被用于其他复杂的混合物中。而这些例子对于分子生物学领域的技术人员来说都是已知的，而且还包括下述在例如核酸的体外合成如PCR、限制酶消化、连接反应等之后的反应混合物。例如在Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619中提出了一种在碘化钠存在时将琼脂糖凝胶中的核酸结合到碎燧石玻璃上的方法。通过在高盐浓度下将核酸吸附于某种基质如无机基质上来纯化核酸的方法的另一种用途是除去可与核酸共纯化的热原污染物。
在高盐浓度下核酸吸附于无机基质上的原理还不完全清楚。据推测核酸与溶剂之间的相互作用受到影响使得核酸吸附于无机基质上并产生变性。在高浓度离液剂存在的情况下这一反应几乎是定量的。被吸附的核酸可以通过在无机基质上施加低离子强度的缓冲液进行洗脱。
US5808041中公开了从某些生物样品中分离长度在50个碱基以上的核酸的方法。制备一种所含的离液序列高的离子浓度大约在2M以上的裂解水溶液，并将核酸从裂解液中吸附到硅石材料上(也指“结合”)。将一种含有硅石材料的泥浆或树脂及离液序列高的盐加入到生物材料中，从而使裂解过程和结合过程在一步中实现。该文献中所公开的裂解生物样品的方法包括利用碱金属氢氧化物和SDS裂解细菌、通过在2.8M胍盐存在下孵育噬菌体来裂解M13或λ噬菌体、以及通过在2.8M胍盐存在下孵育组织来裂解新鲜或冰冻的组织。此外，也利用N-十二烷基-肌氨酸来帮助裂解。
EP0389063和EP0819696中公开了一种通过将含有核酸的液相材料与离液序列高的物质及与固相结合的核酸混合来纯化核酸的方法。因此该文献中所公开的方法也代表一步裂解和结合的方法。在裂解与结合后，结合有核酸的固相从液相中分离。在一个洗涤步骤之后，核酸从固相上被洗脱。该文献公开了一种含有大约10M硫氰酸胍、约2％Triton-X100、约0.1M Tris盐及约50μMEDTA的裂解缓冲液。另一种裂解缓冲液进一步包含约40％重量/体积的硫酸葡聚糖。另外一种裂解缓冲液含有约10M硫氰酸胍和约50μM EDTA。该文献所公开的其他裂解缓冲液含有浓度约为3M的离液序列高的物质碘化钾或碘化钠、或碘化钾或碘化钠与1M或8M的尿素的组合。生物样品的裂解是通过将样品与裂解缓冲液孵育的方式进行的，因此50体积份的生物样品与900体积份的裂解缓冲液和40体积份的粗硅石相混合。作为使用粗硅石的替代，文献中所描述的其他的方法使用的是硅石过滤材料。
EP0658164描述了利用层析纯化核酸的方法。特别是其中描述了包括第一步裂解步骤和第二步结合步骤的两步法。在第一步(裂解)中，生物样品与离液剂混合，其中离液剂在混合物中的浓度为大约2M到大约4M。任选地，混合物中另外还含有苯酚、氯仿或乙醚。任选地，混合物中另外还含有去垢剂。在混合物中加入蛋白酶并进行孵育。在第二步(结合)中，加入乙醇并将所得混合物与结合核酸的固相接触。
现有技术中所给出的这些方法都具有某些不足。因此本发明的目的就是提供一种制备含有核酸的生物样品并将制剂中的核酸吸附于固相上的可选择性的方法。本发明的另一个目的是克服吸附步骤中对于乙醇的需要，因为乙醇是一种易燃的物质，因此希望限制对它的使用。
在本发明中应当理解术语“核酸”当然是代表至少一种核酸。进一步，术语“核酸”也可以代表核酸的混合物。术语“固相”和“基质”是指一种在水溶液中基本上不溶的物质，当该物质被添加到高离子强度的水溶液中时核酸可以吸附到它上面。这类物质的例子有多孔或无孔的矿物颗粒，例如硅石、玻璃、石英、沸石或其混合物。除此之外，术语“基质”还包括覆盖有硅石、玻璃、石英或沸石的磁性可吸附颗粒。进一步，以“粉末”或“被磨成粉末”为材料形式的基质当然是指最终被分离的材料，该材料在分散到液相例如液体有机化合物或水溶液中时可产生悬浮液。术语“粉末”或“被磨成粉末”的材料意指包括片剂，该片剂是由粉末材料聚集而成，但当加入液相例如水溶液中时仍可产生悬浮液。进一步，术语“高离子强度”和“高浓度”很清楚是指所溶解的盐浓度等于或大于约1M时所形成的水溶液的离子强度或浓度。离液序列高的盐浓度优选1至10M。
发明人意外地发现进行两步的裂解与结合方法具有优越性，由此在第一步中通过将生物样品与含有离液剂的裂解缓冲溶液的混合，并对混合物进行孵育从而完成裂解；在第二步中，增加混合物中离液剂的浓度并将混合物与能结合核酸的固相接触，由此液相中的核酸被吸附到固相上去。
因此本发明的第一个实施方式是一种将核酸从生物样品中吸附到固相上去的方法，包括以下步骤(a)提供含有离液剂的裂解缓冲溶液；(b)将裂解缓冲液与生物样品混合，由此得到的混合物中离液剂的浓度在1M至4M之间，并孵育混合物；(c)在步骤(b)的混合物中溶入额外量的离液剂或加入含有额外的离液剂的水溶液，以将混合物中离液剂的浓度提高0.5M以上；(d)将步骤(c)的混合物与固相接触，以使混合物中的核酸吸附到固相上去。
本发明的第二个实施方式是一种从生物样品中分离核酸的方法，包括以下步骤(a)提供含有离液剂的裂解缓冲溶液；(b)将裂解缓冲液与生物样品混合，由此得到的混合物中离液剂的浓度在1M至4M之间，并孵育混合物；(c)在步骤(b)的混合物中溶入额外量的离液剂或加入含有额外离液剂的水溶液，以将混合物中离液剂的浓度提高0.5M以上；(d)提供种固相并将步骤(c)的混合物与固相接触，以使混合物中的核酸吸附到固相上去；(e)将固相从液相中分离；(f)任选地以洗涤缓冲液清洗所得的固相；(g)将核酸由固相上洗脱下来以分离核酸；(h)任选地从洗脱液中沉淀步骤(g)所得的核酸并分离沉淀的核酸。
近年来提供了许多利用核酸与基质例如玻璃表面结合的特点将核酸从其自然环境中分离的方法。这些方法的共同点是在高盐条件下使用离液剂例如硫氰酸胍。高浓度的离液剂改变了水的体相性质(Cacace，M.G.等，Quarterly Review ofbiophysics(1997)30241-277)。
某些离子在水中趋向于增加疏水相互作用，而另外一些离子则会降低疏水相互作用。哪种离子趋向于哪种作用被描述于所谓的Hofmeister序列中。该序列如下 阳离子 NH4+＞Rb+＞K+＞Na+＞Cs+＞Li+＞Mg2+＞Ca2+＞Ba2+＞胍鎓离子 阴离子 PO43-＞SO42-＞HPO42-＞醋酸根＞柠檬酸根＞酒石酸根＞Cl-＞Br-＞NO3-＞ ClO3-＞ClO4-＞I-＞SCN- 据说左边的离子是“宇宙趋向性的”，可增强疏水相互作用，因此在高浓度时可使蛋白质沉淀或“盐析”。右边的离子被认为是“离液序列高的(chaotropic)”，趋向于减弱疏水相互作用。Hofmeister序列解释了胍盐是蛋白质变性剂的原因。它削弱了疏水相互作用导致蛋白质产生变性。相比之下，(NH4)2SO4可以解离为NH4+和SO42-。这两种离子都是宇宙趋向性的，并且其作用是相互独立的和可以累加的。这使得(NH4)2SO4成为一种通用的沉淀剂，被广泛地应用于蛋白质纯化程序中。NaCl位于这个排列的中间，因此它既非宇宙趋向性的也非离液序列高的。
发明人发现为了制备含有核酸的生物样品并将核酸从制剂吸附到固相，采用两步的裂解与结合的方法是有利的。第一步(裂解)中离液剂的浓度要比第二步(结合)中的低。在裂解步骤中，更确切地说在生物样品与裂解缓冲液的混合物中，优选的离液剂的浓度在1M至4M之间。因此本发明第一个优选的实施方式是一种将核酸从生物样品中吸附到固相上去的方法，包括以下步骤(a)提供含有离液剂的裂解缓冲溶液；(b)将裂解缓冲液与生物样品混合，由此得到的混合物中离液剂的浓度在1M至4M之间，并孵育混合物；(c)在步骤(b)的混合物中溶入额外量的离液剂或加入含有额外离液剂的水溶液，以将混合物中离液剂的浓度提高0.5M以上；(d)将步骤(c)的混合物与固相接触，以使混合物中的核酸吸附到固相上去。
优选的离液剂为离液序列高的盐。更优选的离液剂选自盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、碱金属碘化物及碱金属高氯酸盐。碱金属碘化物优选KI或NaI。碱金属高氯酸盐优选NaClO4或KClO4。这些化合物的混合物及这些化合物与尿素的混合物也是可行的。
步骤(b)的混合物中离液剂的最佳浓度因所选用的离液剂的不同而有所不同。例如，为获得类似的离液序列高的效果，选用盐酸胍或硫氰酸胍时，必须在所给出的1M至4M的范围内选择不同的浓度。导致这一不同的原因是硫氰酸胍溶于水时解离出两种离液序列高的离子，而盐酸胍的解离只产生一种离液序列高的离子。因此在步骤(b)的混合物中，优选离液剂的浓度在1M至2M之间。在步骤(b)的混合物中，离液剂的浓度更优选在1.5M至2M之间。在步骤(b)的混合物中，离液剂的甚至更优选的浓度约为2M。根据所用的离液剂的不同，步骤(b)的混合物中离液剂的浓度也可以优选在2M至4M之间。在步骤(b)的混合物中，离液剂的浓度更优选在2.5M至3M之间。在步骤(b)的混合物中，离液剂的甚至更优选的浓度约为3M。
在这一点上，本领域技术人员公知“大约”与数字量化的值连用其含意为这一数值可能会改变，而由这一数值描述或定义的所期望的技术效果仍然不变。一般地，应当理解“大约”暗指5％的变化。例如，一个约100的数值包含95至105之间的数值。
胍盐和硫氰酸盐离子各自在Hofmeister序列中被归为与诸如钾或钠阳离子、或碘或氯酸盐阴离子相比具有超增强了的离液序列高的性质的一类。因此在步骤(b)的混合物中，离液剂的浓度也可优选在2M至4M之间。
在第二步(结合)中，混合物中离液剂的浓度可通过在步骤(b)的混合物中再加入额外量的离液剂来提高。正如步骤(c)中所指出的，可采用几种方法来达到所需的提高。可以将离液剂以固体物质的形式加入步骤(b)的混合物中并使其溶解。也可以选择制备离液剂的水溶液然后加入步骤(b)的混合物中。优选水溶液中含有其他成分，例如缓冲盐、去垢剂或两者均有。这种水溶液的一个例子是在实施例2、3和4中描述的结合缓冲液。
在步骤(c)的混合物中，离液剂的浓度被提高0.5M以上。因此优选步骤(c)包括在步骤(b)的混合物中溶入额外量的离液剂或加入含有额外的离液剂的水溶液，从而将混合物中离液剂的浓度提高至1.5M至10M之间的一个值。已注意到额外的离液剂可以以固体物质的形式加入步骤(b)的混合物中，直至混合物达到饱和。因此，更进一步优选步骤(c)包括在步骤(b)的混合物中溶入额外量的离液剂，以使混合物被离液剂所饱和。优选在步骤(c)中离液剂的浓度被提高0.5M至6M。更优选在步骤(c)中离液剂的浓度被提高0.5M至4M。甚至更优选在步骤(c)中离液剂的浓度被提高0.5M至3M。甚至更优选在步骤(c)中离液剂的浓度被提高0.5M至2M。甚至更优选在步骤(c)中离液剂的浓度被提高0.5M至1.5M。甚至更优选在步骤(c)中离液剂的浓度被提高0.5M至1M。
详细来说，将(至少一种)核酸(也指目标核酸)结合到一种基质例如硅石颗粒、硅石纤维、玻璃滤器或玻璃颗粒上的方法可以描述如下。本发明所述的方法在浓度为1.5M至l0M之间，优选2M至6M之间的离液序列高的盐存在的情况下进行。
在这些条件下，即离液剂以某一浓度存在时，DNA或RNA结合到具有玻璃表面的材料上。为了使裂解液与基质，即对核酸有亲和力的材料相接触，将裂解液与基质混合，并孵育足够长的时间以使结合发生。如果基质是含有例如玻璃、硅石、或石英纤维的滤器，可通过重力牵引力、施加压力或施加吸引力使裂解液(例如步骤(c)的混合物)通过滤器。当经过滤器时，液相中的核酸与固相接触并被吸附到固相上。有经验的技术人员一般知道液相与固相孵育所持续的时间。可以通过测定不同时间时固定于表面的生物材料的总量来对孵育进行优化。对于核酸来说，适当的孵育时间为10秒至30秒之间。
在核酸结合于固相或从生物样品中分离核酸的方法中，更进一步优选对生物样品进行裂解时，使用具有蛋白水解活性的酶以释放核酸。术语“具有蛋白水解活性的酶”很明显是包含能快速降解生物样品中的核酸降解酶或其他不需要的蛋白质的蛋白酶或蛋白酶混合物。在本发明的范围内，术语“蛋白酶”是指任何水解酶、肽酶、蛋白质酶或EC3.4-3.11中所包含的具有蛋白水解活性的酶(例如作用于肽键的水解酶)及其任何变体，该变体保留该酶的活性。具有蛋白水解活性的酶可从动物组织、植物组织、微生物中分离得到，或者可以用重组的方式获得。
因此，优选步骤(a)的裂解缓冲液中包含具有蛋白水解活性的酶。更优选具有蛋白水解活性的酶选自EC3.4-3.11中所包含的蛋白酶。甚至更优选具有蛋白水解活性的酶选自含有无色肽酶(Achromopeptidase)、氨肽酶、红口蝮蛇毒酶(Ancrod)、血管紧张素转化酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、半胱天冬酶(Caspase)、半胱天冬酶1(Caspase 1)、半胱天冬酶2(Caspase2)、半胱天冬酶3(Caspase 3)、半胱天冬酶4(Caspase 4)、半胱天冬酶5(Caspase5)、半胱天冬酶6(Caspase 6)、半胱天冬酶7(Caspase 7)、半胱天冬酶8(Caspase8)、半胱天冬酶9(Caspase 9)、半胱天冬酶10(Caspase 10)、半胱天冬酶13(Caspase 13)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、糜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体Clr、补体Cls、补体因子D、补体因子I、黄瓜素(Cucumisin)、二肽酰肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV)、白细胞弹性蛋白酶、胰弹性蛋白酶、Arg-C内切蛋白酶、Asp-N内切蛋白酶、Glu-C内切蛋白酶、Lys-C内切蛋白酶、Xa因子、无花果蛋白酶、弗林蛋白酶、粒酶A、粒酶B、HIV蛋白酶、IG酶、激肽释放酶组织(Kallikrein tissue)、亮氨酸氨肽酶、胞质亮氨酸氨肽酶、微粒体亮氨酸氨肽酶、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸氨肽酶、中性蛋白酶(Neutrase)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、氨酰基脯氨酸二肽酶、链霉蛋白酶E、前列腺特异性抗原、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)的嗜碱性蛋白酶(Alkalophilic protease)、曲霉菌的蛋白酶、佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、酱油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)的碱性蛋白酶、地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)的Alcalase、多粘芽胞杆菌的蛋白酶、芽孢杆菌属(Bacillus sp)的蛋白酶、芽孢杆菌属(Bacillus sp)的蛋白酶(Esperase)、根霉属(Rhizopus sp)的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、米曲霉的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白质C、焦谷氨酸氨肽酶、肾素、凝乳酶、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、组织纤维蛋白溶酶原活化因子、胰岛素、类胰蛋白酶和尿激酶的一组酶。甚至更优选具有蛋白水解活性的酶选自含有半胱天冬酶(Caspase)、蛋白酶K、链霉蛋白酶E、芽孢杆菌属(Bacillus sp)的蛋白酶(Esperase)和枯草杆菌蛋白酶的一组酶。由至少两种包含于EC3.4-3.11中的蛋白酶组成的混合物也是优选的。有经验的技术人员一般知道如何从蛋白酶选择方面对裂解缓冲液进行优化。正如实施例1中所描述的，本领域技术人员可以在含有不同浓度离液剂的缓冲液中检测所选择的蛋白酶的蛋白水解活性。优先选择在步骤(b)混合物的离液序列高的条件下有活力的蛋白酶。有经验的技术人员可对与蛋白酶一起孵育的时间及孵育温度进行优化。作为一个参数，本领域技术人员将确定从生物样品中释放至液湘中的核酸的量及其结合至基质上的能力。
非常优选的是步骤(a)的裂解缓冲液含有蛋白酶K。优选步骤(b)的混合液中蛋白酶K的活性在0.1U/ml至10U/ml之间。更优选步骤(b)的混合液中蛋白酶K的活性在1U/ml至6U/ml之间。甚至更优选步骤(b)的混合液中蛋白酶K的活性在2U/ml至4U/ml之间。甚至更优选步骤(b)的混合液中蛋白酶K的活性约为3U/ml。在这一点上此处列举的蛋白酶K的活性数值当然是反映了实施例1中所描述的被测定的活性数值。
当为了释放核酸而对生物样品进行裂解或将核酸结合到固相时，更进一步优选在方法中使用去垢剂，即阴离子、阳离子、两性离子或非离子去垢剂。这些去垢剂对于本领域技术人员来说是已知的。一般来说，“去垢剂”是一种表面活化剂(surface active agent)，也称作表面活性剂(surfactant)。去垢剂能够降低其所溶入的介质的表面张力，和/或与其他相之间的界面张力，从而将介质完全吸附到液/汽和/或其他界面上。因此，去垢剂是具有极性(水溶的)和非极性(疏水的)区域的两性分子。它们能够结合疏水性分子或由这些分子组成的结构域以赋予水溶性。根据去垢剂的离子特性，可将其分为离子性去垢剂、非离子性去垢剂和两性离子性去垢剂三类。离子性去垢剂可进一步分为阳离子去垢剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)、LiDS(十二烷基硫酸锂)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，和阴离子去垢剂，例如脱氧胆酸或十二烷基肌氨酸钠。而这些都是常见的强蛋白变性剂。上述非离子去垢剂是弱蛋白变性剂。两性离子去垢剂例如CHAPS或磺基三甲铵乙内酯14(Sulphobetaine 14)也是如此。两性离子性化合物，也称为两性离子、内盐或偶极离子，是具有形式上的相反符号的单位电荷的中性化合物。
因此，优选在步骤(a)的裂解缓冲液中含有去垢剂。更优选在步骤(a)的裂解缓冲液中含有阴离子、阳离子、两性离子或非离子去垢剂。甚至更优选步骤(a)的裂解缓冲液中所含的去垢剂选自含有十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、十六烷基三甲基溴化铵、脱氧胆酸、十二烷基肌氨酸钠、Triton-X100、吐温20(Tween 20)、辛基β-D-葡糖苷、乙基苯基聚乙二醇P40(Nonidet P40)、CHAPS或磺基三甲铵乙内酯14的组。但是也可以使用其他去垢剂。一般地，当联合使用离液剂、去垢剂和蛋白酶对生物样品进行裂解时，本领域技术人员在保持蛋白水解活性的基础上对步骤(b)的混合物中的去垢剂及其浓度进行选择。
优选的固相由选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维和沸石的多孔或无孔的无机基质构成。也可优选固相包含选自金属氧化物，和/或金属与氧化物的混合物(metal mixed oxides)、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、多孔或无孔无机基质和主要由玻璃构成的材料。同样优选固相含有颗粒大小为0.1μm至1000μm的无机基质。同样优选的固相包含具有2至1000nm大小的孔径的多孔无机载体材料。更优选多孔或无孔的载体材料，特别地，沸石是以疏松的方式装填的。甚至更优选地，固相含有玻璃、石英形式的过滤片或陶瓷过滤片、和/或含有硅胶的膜和/或无机载体的颗粒或纤维及石英或玻璃棉织物。含有可磁性吸附的颗粒的固相也同样是优选的。更优选可磁性吸附的颗粒表面被选自硅胶、玻璃、石英和沸石的无机基质所覆盖。甚至更优选基质包含磁性玻璃颗粒。
本发明更进一步的实施方式是一种从生物样品中分离核酸的方法，包括以下步骤(a)提供含有离液剂的裂解缓冲溶液；(b)将裂解缓冲液与生物样品混合，由此得到的混合物中离液剂的浓度在1M至4M之间，并孵育混合物；(c)在步骤(b)的混合物中溶入额外量的离液剂或加入含有额外的离液剂的水溶液，将混合物中离液剂的浓度提高0.5M以上；(d)提供一种固相，并将步骤(c)的混合物与固相接触，以使混合物中的核酸吸附到固相上去；(e)将固相从液相中分离；(f)任选地用洗涤缓冲液清洗所得的固相；(g)将核酸由固相上洗脱以分离核酸；(h)任选地从洗脱液中沉淀步骤(g)所得的核酸并分离沉淀的核酸。
优选固相含有的多孔或无孔无机基质选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维和沸石。同样优选固相包含磁性玻璃颗粒。
非常优选的离液剂是离液序列高的盐。更优选离液剂选自盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、碱金属碘化物及碱金属高氯酸盐。
同样优选步骤(a)的裂解缓冲液含有具有蛋白水解活性的酶和去垢剂。具有蛋白水解活性的酶非常优选选自EC3.4-3.11中所包含的蛋白酶。具有蛋白水解活性的酶甚至更优选选自半胱天冬酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶E、芽孢杆菌属的蛋白酶(Esperase)和枯草杆菌蛋白酶。由至少两种包含于EC3.4-3.11中的蛋白酶组成的混合物也是优选的。同时也非常优选步骤(a)的裂解缓冲液中含有阴离子、阳离子、两性离子或非离子去垢剂。甚至更优选步骤(a)的裂解缓冲液中所含的去垢剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、十六烷基三甲基溴化铵、脱氧胆酸、十二烷基肌氨酸钠、Triton-X100、吐温20、辛基β-D-葡糖苷、乙基苯基聚乙二醇P40、CHAPS或磺基三甲铵乙内酯14。
优选在步骤(b)中，混合物的pH值在8.5至4之间。更在优选步骤(b)中，混合物的pH值在7.5至5之间。甚至更优选在步骤(b)中，混合物的pH值在7至6之间。甚至更优选在步骤(b)中，混合物的pH值约为6。
非常优选步骤(b)含有生物样品的混合物，其中硫氰酸胍的浓度在1.5M至3M之间、Tris盐的浓度在20mM至40mM之间、Triton-X100的浓度在5％至20％v/v之间、在混合物中蛋白酶K的蛋白水解活力在1U/ml至5U/ml之间、混合物的pH在8.5至6.0之间。很清楚，在这点上蛋白酶K的活力是用实施例1所描述的方法进行测定的。
高度优选步骤(b)含有生物样品的混合物，其中硫氰酸胍的浓度在1.5M至2.5M之间、Tris盐的浓度在20mM至30mM之间、Triton-X100的浓度在5％至15％体积与体积比之间、在混合物中蛋白酶K的蛋白水解活力在2U/ml至4U/ml之间、混合物的pH在8.5至6.0之间。
高度优选步骤(b)含有生物样品的混合物，其中硫氰酸胍的浓度约为2M、Tris盐的浓度约为25mM、Triton-X100的浓度约为10％v/v、在混合物中蛋白酶K的蛋白水解活力约为3U/ml、混合物的pH约为6。甚至更优选pH为6。这样的混合物的一个例子为实施例2的实验4中所使用的裂解混合物。
同样高度优选的是步骤(b)含有生物样品的混合物，其中盐酸胍的浓度约为2.7M、尿素的浓度约为5mM、Tris盐的浓度约为5mM、Triton-X100的浓度约为9％体积与体积比、在混合物中蛋白酶K的蛋白水解活力约为3U/ml、混合物的pH在4.4至6.5之间。
同样高度优选的是步骤(b)含有生物样品的混合物，其中盐酸胍的浓度约为2.4M、尿素的浓度约为1.6mM、Tris盐的浓度约为85mM、EDTA的浓度约为88mM、NaCl的浓度约为8mM、Triton-X100的浓度约为9％v/v、在混合物中蛋白酶K的蛋白水解活力约为3U/ml、混合物的pH在4.4至6.5之间。
更进一步优选将包含蛋白酶的步骤(b)的混合物在允许蛋白水解反应进行的环境条件下孵育一定的时间。优选将步骤(b)的混合物在20℃至75℃的温度下孵育10分钟至30分钟，并对混合物进行搅拌。优选的搅拌工具是滚轴搅拌器(roller mixer)或热搅拌器(thermomixer)。术语“搅拌”和“使搅拌”应理解为移动装有步骤(b)混合物的试管以使试管每秒颠倒一次。该术语也包括对于步骤(b)混合物有相同搅拌效果的运动。搅拌的程度也可以受到所要分离的核酸长度的影响。过分的搅拌会产生剪切力，导致对混合物中核酸分子长度的限制。因此有经验的技术人员会选择较慢的搅拌。
更优选将步骤(b)的混合物在室温下孵育30分钟，并以滚轴搅拌器对混合物进行搅拌。甚至更优选将步骤(b)的混合物在50℃至75℃的温度下孵育10分钟至20分钟，并以热电搅拌器对混合物进行搅拌。甚至更优选将步骤(b)的混合物在56℃的温度下孵育10分钟至20分钟，并以滚轴搅拌器或热电搅拌器对混合物进行搅拌。甚至更优选将步骤(b)的混合物在56℃的温度下孵育15分钟，并以滚轴搅拌器或热搅拌器对混合物进行搅拌。将步骤(b)的混合物在72℃的温度下孵育10分钟至20分钟，并以滚轴搅拌器或热搅拌器对混合物进行搅拌也是非常优选的。甚至更优选将步骤(b)的混合物在72℃的温度下孵育10分钟，并以滚轴搅拌器或热搅拌器对混合物进行搅拌。
在将步骤(c)的混合物中的核酸吸附至固相后，被结合的核酸从液相中分离。一般而言，这一步可以通过重力分离或在核酸结合于磁性玻璃颗粒上的方便的情况下，通过施加磁场将结合于磁性颗粒上的物质分离的方式达到分离。例如，磁性颗粒可被吸引至用于进行孵育的容器的壁上。然后可将含有未与磁性颗粒结合的样品内容物的液体除去。所用的去除方法取决于进行孵育的容器类型。适用的步骤包括采用移液管或用抽吸装置将液体去除。
如果固相是一种过滤器(例如含有石英或玻璃纤维的滤器)，则步骤(c)的混合物优选通过过滤器。那么从固相中分离液相就受重力牵引力、施加的压力或施加的吸引力的影响。
随后可对结合有DNA或RNA的固相进行洗涤。该步骤是任选的，取决于不需要的物质的性质和数量以及所需要的被分离核酸的纯度。如果洗涤步骤是需要的，则优选对固相进行至少一次洗涤，例如用体积与体积比为1-90％的醇如异丙醇或乙醇的混合物洗涤。洗涤溶液的例子有实施例2(A)中所描述的“去抑制因子缓冲液”和“洗涤缓冲液”。一般来说，所用的洗涤溶液不会导致核酸从固相表面被释放但却能尽可能彻底地洗去不需要的污染物。该洗涤步骤优选通过将结合有核酸的材料与洗涤溶液孵育来进行。优选在这一步中将固相悬浮。如果固相是过滤器，则优选让洗涤溶液通过过滤器。被污染的洗涤溶液优选像上述结合核酸的步骤中所描述的一样被去除。甚至更优选进行两步连续的洗涤步骤，其中第一步洗涤步骤用去抑制因子缓冲液来进行，第二步洗涤步骤用洗涤缓冲液来进行。去抑制因子缓冲液的特点是含有离液剂。用去抑制因子缓冲液来进行洗涤可以除去能够影响例如限制酶或聚合酶所催化的酶反应的有毒物质或抑制因子。用洗涤缓冲液进行洗涤可以从被结合的核酸中除去残留的离液剂。在最后一步洗涤步骤之后，可简单地在真空中或使液体蒸发来对材料进行干燥。也可以使用丙酮进行预处理。
然后，可以颠倒条件，例如降低盐浓度以洗脱结合到材料上的DNA或RNA。洗脱缓冲液在DE3724442及Jakobi，R.等，Anal.Biochem.175(1988)196-201中已公开。具有低盐成分的洗脱缓冲液是内容物低于0.2M的特殊缓冲液。优选地，洗脱缓冲液含有用于缓冲目的的Tris物质。非常优选洗脱缓冲液是含有Tris盐的水溶液，其中Tris盐的浓度为50mM。更优选洗脱缓冲液是含有Tris盐的水溶液，其中Tris盐的浓度为50mM并且pH在6.5至8.5之间。甚至更优选pH为7.5。软化水也同样是优选的洗脱缓冲液。现在含有纯化的DNA或RNA的溶液可被用于其他的反应。任选地，可以用例如乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀。沉淀物可用于进一步的洗涤步骤。这类方法是本领域技术人员所公知的并详细描述于Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第三版，CSHL出版社，2001中。
目标核酸可被检测并被鉴定。上述纯化方法是优选的，接着进行鉴定或检测步骤，或者在纯化步骤后接着进行扩增和检测或鉴定步骤。目标核酸或感兴趣的核酸可能包含于非目标核酸的基质中，甚至可能在所述特定核酸的混合物中是少量成分。适用的DNA检查方法是本领域技术人员所公知的，并且在标准教科书如Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，CSHL出版社，2001；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley and Sons，NY，1987中有所描述。
在DNA检测步骤进行之前也可能还有进一步的纯化步骤，例如沉淀步骤。检测方法可以包括但不局限于结合或插入特殊的染料例如溴化乙锭，在插入到双链DNA中后并因此改变其荧光性。纯化的DNA也可以通过电泳的方法进行分离，任选电泳在限制性消化之后进行，并在此后将其显现出来。还有基于探针的试验，该试验使用寡核苷酸与特定序列杂交并随后检查杂交物。也可以在本领域技术人员公知的进一步步骤之后对DNA进行测序。其他方法是将多种不同的DNA序列施加于结合有特定探针的硅片上，并在有互补序列结合时产生信号。
本发明还涉及含有核酸的蛋白质和非蛋白质成分的混合物，其中核酸包括DNA或RNA或两者均有。
本发明还涉及生物样品，核酸被从中纯化，这些生物样品包括病毒或细菌细胞，也包括来自多细胞生物体的分离细胞例如人和动物细胞的白细胞，以及免疫活性低或高的化合物分子，例如半抗原、抗原、抗体以及核酸、血浆、脑液、唾液、粪便、活组织标本、骨髓、漱口液、血清、组织、尿或其混合物。本发明同时还涉及例如是人或动物的体液的生物样品；优选该生物样品是全血、血浆、血清或尿。全血样品优选是EDTA血、肝素或柠檬酸盐血。血浆优选是EDTA、肝素或柠檬酸盐血浆。在本发明的一个实施方式中，生物样品包括细菌细胞、真核细胞、病毒或其混合物。
还优选核酸与蛋白质材料的混合物，它包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或两者均有，优选DNA或RNA或两者来自于一种病毒或一种(至少一种)微生物。病毒可以是甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)或细小病毒B19。
还优选目标核酸组分及其他核酸基本上按上文描述的方法进行纯化。然后目标核酸组分被进一步处理和检测，也就是以聚合酶链式反应进行扩增，特异性扩增目标序列至可检测的量。其他可行的扩增反应是连接酶链式反应(LCR，Wu，D.Y和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569，和Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)、聚合酶连接酶链式反应(Barany，F.，PCRMethods and Applic.1(1991)5-16)、Gap-LCR(WO90/01069)、修复链式反应(Repair Chain Methods)(EP0439182)、3SR(Kwoh，D.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO92/08800)、和NASBA(US5130238)。进一步地，还有链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Q-β-扩增(综述参见例如Whelen，A.C.，和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.，和Myers，T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47)。
特别优选WO92/02638和相关的美国专利US5210015、US5804375、US5487972中描述的TaqMan_检测方法。该方法利用聚合酶的核酸外切酶活性来产生信号。具体地说，就是通过一个程序来对目标核酸组分进行检测，该程序包括将样品跟含有与目标核酸组分的一个区域的相互补的序列的寡核苷酸及含有与同一目标核酸组分序列链的第二个区域互补的序列，但不包括由第一段寡核苷酸所确定的核酸序列的标记了的寡核苷酸相接触，在杂交条件下产生双链体的混合物，其中双链体包含目标核酸，该目标核酸被退火到第一段寡核苷酸及标记了的寡核苷酸上时，使得第一段寡核苷酸的3’末端与标记的寡核苷酸的5’末端相邻。然后用具有5’至3’核酸酶活性的模板依赖性的核酸聚合酶对混合物进行处理，在允许聚合酶5’至3’核酸酶活性存在的条件下切下已退火的、标记了的寡核苷酸并释放被标记的片段。检测和/或测量由标记的寡核苷酸的水解而产生的信号。TaqMan_技术不需要形成固相与反应复合物的结合而且使其能够被检测。更一般地说，公开了用于对目标核酸组分进行纯化其后跟着一个检测步骤的方法，其中扩增和/或检测反应采用的是均质的溶液相。
下文所给出的实施例、参考文献和附图是为了帮助理解本发明，本发明真正的范围在附加的权利要求书中阐明。很清楚，对于上述方法的可能的修改未超出本发明的实质内容。



图1相对于硫氰酸胍的不同浓度(0分钟时的数值)，蛋白酶K在t＝0分钟时的活力。x轴表示硫氰酸胍的摩尔浓度，y轴以[％]表示蛋白酶K的活力。
图2相对于硫氰酸胍的不同浓度(15分钟时的数值)，蛋白酶K在t＝15分钟时的活力。x轴表示硫氰酸胍的摩尔浓度，y轴以[％]表示蛋白酶K的活力。
图3依据实施例2和表3的DNA的产量，单位为μg/ml血。X轴代表各次实验，y轴代表以μg/ml血为单位的DNA的产量。同时给出标准偏差。
图4依据实施例3和表5的DNA的产量，单位为μg/ml血。X轴代表各次实验，y轴代表以μg/ml血为单位的DNA的产量。同时给出标准偏差。
图5依据实施例4和表7的DNA的产量，单位为μg/ml血。X轴代表各次实验，y轴代表以μg/ml血为单位的DNA的产量。同时给出标准偏差。
实施例1 (A)在离液剂存在下孵育蛋白酶K 将10μl 20mg/ml蛋白酶K的储存液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheimm，目录号745723；90mg溶于4.5ml水中)与含有50mM Tris-HCl pH6.0、1％DTT、20％Triton-X 100和xM硫氰酸胍(x＝0，1，2，3，4，5，6)的离液序列高的缓冲液混合。混合后，立即用下述实验测量混合物的第一个等分试样(10μl)的蛋白酶K的活力(0分钟时的活力值)。在混合15分钟后，用下述实验测量混合物的第二个等分试样(10μl)的蛋白酶K的活力(15分钟时的活力值)。
(B)蛋白酶K的活力测定试验 将在10μl离液序列高的缓冲液中的蛋白酶K(见上述步骤，(A))与试验缓冲液，即980μl 0.2M三乙醇胺、0.05％(重量比体积)PEG6000、0.1M氯化钙及10μl 200mM的底物溶液混合。底物为Suc-Ala-Ala-Ala-p-硝基苯胺。将试验缓冲液加入试管中。混合后，立即将试管放入光度计中。在25℃下进行测量(吸收)15分钟。试验缓冲液中蛋白酶K的活性由405nm处吸收值的变化所显示出的动力学特性计算得出。
表1列出在(A)中所给出的在不同浓度的硫氰酸胍的存在下，蛋白酶K在0分钟时的活力。表2列出在(A)中所给出的在不同浓度的硫氰酸胍的存在下蛋白酶K在15分钟时的活力以及对照值(不含离液剂)。这些数值是相对于在不含离液剂的对照缓冲液(见(A))中蛋白酶K在0分钟时的活力值(对应于0.5U/ml)而表示的；该对照数值被设定为100％。表1和表2中的数据图示于图1和图2中。
表1 相对于不同浓度的硫氰酸胍(0分钟时的数值)，蛋白酶K在t＝0分钟时的活力 浓度[M]活力[％]081 1942100366415060 表2 相对于不同浓度的硫氰酸胍(15分钟时的数值)，蛋白酶K在t＝15分钟时的活力 浓度[M]活力[％]010519529531405060 实施例2 (A)试剂 a)蛋白酶K储存液重组蛋白酶K，PCR级，50U/ml b)裂解缓冲液4M硫氰酸胍，50mM Tris-HCl，20％Triton-X 100，pH6.0 c)结合缓冲液4M硫氰酸胍，50mM Tris-HCl，20％Triton-X 100，pH6.0 d)去抑制因子缓冲液5M盐酸胍，20mM Tris-HCl，38％乙醇，pH6.6 e)洗涤缓冲液20mM NaCl，2mM Tris-HCl，80％乙醇，pH7.5 f)洗脱缓冲液50mM Tris-HCl，pH8.2 g)乙醇(100％) 另外必需可商业获得的含有硅石膜的旋转柱(spin columns)，例如NucleoSpin Blood L，由Machery&Nagel分发。
(B)实验1无蛋白酶K处理的一步法 1.用移液管移1000μl EDTA血入15ml Falcon管中 2.加入1000μl裂解缓冲液，轻轻涡旋 3.在室温下在滚轴搅拌器上孵育15分钟，搅拌 4.将旋转柱放入一个新的Falcon管中 5.将步骤1-2的混合物(约2000μl)转移至旋转柱 6.在1900×g下离心3分钟 7.加入1000μl去抑制因子缓冲液 8.在4500×g下离心2分钟 9.加入2000μl洗涤缓冲液 10.在4500×g下离心10分钟 11.弃去流下的液体并将过滤柱放入一个新的Falcon管中 12.用300μl预热(70℃)的洗脱缓冲液进行洗脱 13.在室温下孵育5分钟 14.在4500×g下离心2分钟 15.在260、280和320nm处测量洗脱液的OD值 (C)实验2包括蛋白酶K处理的一步法 1.用移液管将125μl蛋白酶K移入一支15ml Falcon管中 2.加入1000μl EDTA血，轻轻涡旋 3.加入1000μl裂解缓冲液，轻轻涡旋 4.在56℃摇动孵育15分钟(例如使用热电搅拌器)，搅拌 5.将旋转柱放入一个新的Falcon管中 6.将步骤1-3的混合物(约2125μl)转移至旋转柱 7.在1900×g下离心3分钟 8.加入1000μl去抑制因子缓冲液 9.在4500×g下离心2分钟 10.加入2000μl洗涤缓冲液 11.在4500×g下离心10分钟 12.弃去流下的液体并将过滤柱放入一个新的Falcon管中 13.用300μl预热(70℃)的洗脱缓冲液进行洗脱 14.在室温下孵育5分钟 15.在4500×g下离心2分钟 16.在260、280和320nm处测量洗脱液的OD值 (D)实验3包括乙醇的两步法 1.用移液管将125μl蛋白酶K移入一支15ml Falcon管中 2.加入1000μl EDTA血，轻轻涡旋 3.加入1000μl裂解缓冲液，轻轻涡旋 4.在56℃下摇动孵育15分钟(例如使用热搅拌器)，搅拌 5.加入1000μl乙醇，轻轻涡旋 6.将旋转柱放入一个新的Falcon管中 7.将步骤1-5的混合物(约3125μl)转移至旋转柱 8.在1900×g下离心3分钟 9.加入1000μl去抑制因子缓冲液 10.在4500×g下离心2分钟 11.加入2000μl洗涤缓冲液 12.在4500×g下离心10分钟 13.弃去流下的液体并将过滤柱放入一个新的Falcon管中 14.用300μl预热(70℃)的洗脱缓冲液进行洗脱 15.在室温下孵育5分钟 16.在4500×g下离心2分钟 17.在260、280和320nm处测量洗脱液的OD值 (E)实验4包括结合缓冲液的两步法 1.用移液管将125μl蛋白酶K移入一支15ml Falcon管中 2.加入1000μl EDTA血，轻轻涡旋 3.加入1000μl裂解缓冲液，轻轻涡旋 4.在56℃摇动孵育15分钟(例如使用热搅拌器)，搅拌 5.加入1000μl结合缓冲液，轻轻涡旋 6.将旋转柱放入一个新的Falcon管中 7.转移步骤1-5的混合物(约3125μl)至旋转柱 8.在1900×g下离心3分钟 9.加入1000μl去抑制因子缓冲液 10.在4500×g下离心2分钟 11.加入2000μl洗涤缓冲液 12.在4500×g下离心10分钟 13.弃去流下的液体并将过滤柱放入一个新的Falcon管中 14.用300μl预热(70℃)的洗脱缓冲液进行洗脱 15.在室温下孵育5分钟 16.在4500×g下离心2分钟 17.在260、280和320nm处测量洗脱液的OD值 表3 人DNA的产量，单位[μg/ml血] 实验1实验2实验3实验4(a)8.7211.7821.2317.96(b)8.8112.5717.4317.30平均值8.7712.1819.3317.63SD0.060.552.680.46 (a)和(b)表示重复实验的数据；SD标准偏差 表4 通过用320nm值校正的260nm/280nm比值测定的DNA纯度 实验1实验2实验3实验41.951.921.871.881.961.851.881.84(a)(b) (a)和(b)表示重复实验的数据(见表3) 关于DNA的纯度，1.8±0.1的260nm/280nm的比值(包括320nm校正 值)被认为是可接受的。该数据显示本发明所述的方法，即实验4的方法与实验3的方法相比所得纯度相同(如果不是一个更高纯度的DNA)。
实施例3 (A)试剂 (a)裂解缓冲液/结合缓冲液，离液序列高的(7M[裂解缓冲液]/4M[结合缓冲液]硫氰酸胍，50mM Tris-HCl，20％Triton-X 100，pH6.0) (b)去抑制因子缓冲液(5M盐酸胍，20mM Tris-HCl，38％乙醇，pH6.6) (c)洗涤缓冲液(20mM NaCl，2mM Tris-HCl，80％乙醇，pH7.5) (d)洗脱缓冲液(50mM Tris，pH8.1) (e)乙醇(无水的) 另外必需玻璃纤维过滤柱(带有硅石膜，例如NucleoSpin Blood L，可由Machery-Nagel购得) (B)实验5，一步法裂解缓冲液7M，无结合缓冲液 用移液管将1000μl EDTA血移入一支15ml Falcon管中，加入1000μl裂解缓冲液(7M)并涡旋该管。混合物在热搅拌器上于56℃孵育15分钟。取一支新的带有玻璃纤维过滤柱的Falcon管并将配制的全部样品(大约2000μl；离液剂浓度为3.5M)转移至过滤柱。在1900×g下离心3分钟后，将1000μl去抑制因子缓冲液加入到过滤柱中，跟着以4200×g进行2分钟的另一次离心。此后，在柱上加入2000μl洗涤缓冲液，然后以4200×g离心10分钟。弃去流下的液体并将过滤柱放入一个新的Falcon管中。用500μl预热(70℃)的洗脱缓冲液对结合的核酸进行洗脱。将洗脱缓冲液转移至柱上并于室温孵育5分钟。以4200×g离心2分钟后，对流下的液体通过230、260、280和320nm处的光密度测定进行分析。
(C)实验6，两步法裂解缓冲液7M，结合缓冲液4M 用移液管将1000μl EDTA血移入一支15ml Falcon管中，加入1000μl裂解缓冲液(7M)并涡旋该管。将混合物在热搅拌器上于56℃孵育15分钟。加入500μl结合缓冲液(4M)通过涡旋进行混合。取一支新的带有玻璃纤维过滤柱的Falcon管并将配制的全部样品(大约2500μl；离液剂浓度4.5M)转移至过滤柱。以1900×g离心3分钟后，将1000μl去抑制因子缓冲液加入过滤柱，跟着以4200×g进行2分钟的另一次离心。此后，在柱上加入2000μl洗涤缓冲液，然后以4200×g离心10分钟。弃去流下的液体并将过滤柱放入一个新的Falcon管中。用500μl预热(70℃)的洗脱缓冲液对结合的核酸进行洗脱。将洗脱缓冲液转移至柱上并于室温孵育5分钟。以4200×g离心2分钟后，对流下的液体以230、260、280和320nm处的光密度测定进行分析。
表5 人DNA的产量，单位[μg/ml血] 实验5实验6(a)5.9511.35(b)11.3513.02平均值8.6512.18SD3.821.18 (a)和(b)表示重复实验的数据；SD标准偏差 表6 通过用320nm值校正的260nm/280nm比值测定的DNA纯度 实验5实验61.921.941.881.811.901.88(a)(b)平均值 (a)和(b)表示重复实验的数据(见表5) 实施例4 (A)试剂 (a)裂解缓冲液/结合缓冲液，离液序列高的(7M[裂解缓冲液]/5M[结合缓冲液]/4M[结合缓冲液]硫氰酸胍，50mM Thris-HCl，20％Triton-X 100，pH6.0) (b)去抑制因子缓冲液(5M盐酸胍，20mM Tris-HCl，38％乙醇，pH6.6) (c)洗涤缓冲液(20mM NaCl，2mM Tris-HCl，80％乙醇，pH7.5) (d)洗脱缓冲液(50mM Tris，pH8.1) (e)乙醇(无水的) 另外必需玻璃纤维过滤柱(带有硅石膜，例如NucleoSpin Blood L，可由Machery-Nagel购得) (B)实验7，一步法裂解缓冲液7M，无结合缓冲液 用移液管将1000μl EDTA血移入一支15ml Falcon管中，加入1000μl裂解缓冲液(7M)并涡旋该管。将混合物在热搅拌器上于56℃孵育15分钟。取一支新的带有玻璃纤维过滤柱的Falcon管并将配制的全部样品(大约2000μl；离液剂浓度3.5M)转移至过滤柱。以1900×g离心3分钟后，将1000μl去抑制因子缓冲液加入过滤柱，跟着以4200×g进行2分钟另一次离心。此后，在柱上加入2000μl洗涤缓冲液，然后以4200×g离心10分钟。弃去流下的液体并将过滤柱放入一个新的Falcon管中。用500μl预热(70℃)的洗脱缓冲液对结合的核酸进行洗脱。将洗脱缓冲液转移至柱上并于室温孵育5分钟。以4200×g离心2分钟后，对流下的液体以230、260、280和320nm处的光密度测定进行分析。
(C)实验8，两步法裂解缓冲液5M，结合缓冲液4M 用移液管将1000μl EDTA血移入一支15ml Falcon管中，加入1000μl裂解缓冲液(5M)并涡旋该管。将混合物在热搅拌器上于56℃孵育15分钟。加入500μl结合缓冲液(4M)通过涡旋进行混合。取一支新的带有玻璃纤维过滤柱的Falcon管并将配制的全部样品(大约2500μl；离液剂浓度3.5M)转移至过滤柱。以1900×g离心3分钟后，将1000μl去抑制因子缓冲液加入过滤柱，跟着以4200×g进行2分钟的另一次离心。此后，在柱上加入2000μl洗涤缓冲液，然后以4200×g离心10分钟。弃去流下的液体并将过滤柱放入一个新的Falcon管中。用500μl预热(70℃)的洗脱缓冲液对结合的核酸进行洗脱。将洗脱缓冲液转移至柱上并于室温孵育5分钟。以4200×g离心2分钟后，对流下的液体以230、260、280和320nm处的光密度测定进行分析。
表7 人DNA产量，单位[μg/ml血] 实验7实验8(a)5.957.16(b)11.3512.20平均值8.659.68SD3.823.57 (a)和(b)表示重复实验的数据；SD标准偏差 表8 通过用320nm值校正的260nm/280nm比值测定的DNA纯度 实验7实验81.921.911.881.921.901.92 (a) (b) 平均值 (a)和(b)表示重复实验的数据(见表7)
参考文献
Abramson，R.D.，和Myers，T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47
Alderton，R.P.等，Anal.Biochem.201(1992)166-169
Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley and Sons，NY，1987
Barany，F.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16
Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193
Boom，R.等，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503
Cacace，M.G.等，Quarterly Review of Biophysics(1997)30241-277
DE 3724442
EP 0439182
EP 0389063
EP 0658164
EP 0819696
Guatelli，J.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878
Jakobi，R.等，Anal.Biochem.175(1988)196-201
Kwoh，D.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177
Marko，M.A.等，Anal.Biochem.121(1982)382-387
Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，CSHL出版社，2001
US 4683195
US 5130238
US 5210015
US 5487972
US 5804375
US 5808041
Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619
Whelen，A.C.，和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373
WO 01/37291
WO 90/01069
WO 91/00212
WO 92/02638
WO 92/08800
Wu，D.Y和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569
Yamada，O.等，J.Virol.Methods 27(1990)203-209
权利要求
1.一种将生物样品中的核酸吸附到固相上的方法，包括以下步骤
(a)提供含有离液剂的水性裂解缓冲溶液；
(b)将该裂解缓冲液与生物样品混合，从而使混合物中离液剂的浓度在1M至4M之间，并孵育混合物；
(c)向步骤(b)的混合物中溶入额外量的离液剂或加入含有额外的离液剂的水溶液，从而将混合物中离液剂的浓度提高0.5M以上；
(d)将步骤(c)的混合物与固相接触，从而使混合物中的核酸吸附到固相上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的离液剂选自盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、碱金属碘化物及碱金属高氯酸盐。
3.根据权利要求1和2中任意一项所述的方法，其特征在于步骤(a)的裂解缓冲液中含有具有蛋白质水解活性的酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于具有蛋白质水解活性的酶选自于半胱天冬酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶E、芽孢杆菌属的蛋白酶(Esperase)和枯草杆菌蛋白酶。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于步骤(a)的裂解缓冲液中含有去垢剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(a)的裂解缓冲液中的去垢剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、十六烷基三甲基溴化铵、脱氧胆酸、十二烷酰基肌氨酸钠、Triton-X100、吐温20、辛基β-D-葡糖苷、乙基苯基聚乙二醇、CHAPS或磺基三甲铵乙内酯14。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其特征在于固相包含选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维和沸石的多孔或无孔无机基质。
8.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其特征在于固相含有磁性玻璃颗粒。
9.一种从生物样品中分离核酸的方法，包括以下步骤
(a)提供含有离液剂的裂解缓冲溶液；
(b)将裂解缓冲液与生物样品混合，从而使混合物中离液剂的浓度为在1M至4M，并孵育混合物；
(c)在步骤(b)的混合物中溶入额外量的离液剂或加入含有额外离液剂的水溶液，从而将混合物中离液剂的浓度提高0.5M以上；
(d)提供一种固相并且将步骤(c)的混合物与固相接触，从而使混合物中的核酸吸附到固相上；
(e)将固相从液相中分离；
(f)任选地用洗涤缓冲液清洗步骤(e)中的固相；
(g)将核酸由固相上洗脱下来从而分离核酸；
(h)任选地从洗脱液中沉淀步骤(g)所得的核酸并分离沉淀下来的核酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于离液剂选自盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、碱金属碘化物及碱金属高氯酸盐。
11.根据权利要求9和10中任意一项所述的方法，其特征在于步骤(a)的裂解缓冲液中含有具有蛋白质水解活性的酶和去垢剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于具有蛋白质水解活性的酶选自于半胱天冬酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶E、芽孢杆菌属的蛋白酶(Esperase)和枯草杆菌蛋白酶，并且去垢剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、十六烷基三甲基溴化铵、脱氧胆酸、十二烷基肌氨酸钠、Triton-X100、吐温20、辛基β-D-葡糖苷、乙基苯基聚乙二醇、CHAPS或磺基三甲基铵乙内酯14。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤(b)的混合物中含有生物样品、浓度约为2M的硫氰酸胍、浓度约为25mM的Tris盐、浓度约为10％v/v的Triton-X100和蛋白酶K，从而在混合物中蛋白酶K的蛋白水解活力约为3U/ml，由此使混合物的pH约为6。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤(b)的混合物中含有生物样品、浓度约为2.7M的盐酸胍、浓度约为5mM的尿素、浓度约为5mM的Tris盐、浓度约为9％v/v的Triton-X100和蛋白酶K，从而在混合物中蛋白酶K的蛋白水解活力约为3U/ml，由此使混合物的pH为4.4至6.5。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤(b)的混合物中含有生物样品、浓度约为2.4M的盐酸胍、浓度约为1.6mM的尿素、浓度约为85mM的Tris盐、浓度约为88mM的EDTA、浓度约为8mM的NaCl、浓度约为9％v/v的Triton-X100和蛋白酶K，从而在混合物中蛋白酶K的蛋白水解活力约为3U/ml，由此使混合物的pH为4.4至6.5。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于将步骤(b)的混合物在20℃至75℃的温度下孵育10分钟至30分钟，并对混合物进行搅拌。
17.根据权利要求9至16中任意一项所述的方法，其特征在于所述的固相含有选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维和沸石的多孔或无孔无机基质。
18.根据权利要求9至16中任意一项所述的方法，其特征在于所述的固相含有磁性玻璃颗粒。
19.根据权利要求9至18中任意一项所述的方法，其特征在于所述的生物样品包括细菌的细胞、真核细胞、病毒或其混合物。
全文摘要
本发明涉及一种利用两步法将核酸吸附，也就是非共价键连接至固相上的方法。更进一步，本发明涉及一种从生物样品中分离核酸的方法。在该方法的第一步中，通过将生物样品与含有离液剂的水性裂解缓冲溶液混合并且温育混合物来进行裂解；在第二步中，增加混合物中离液剂的浓度并将混合物与固相接触，由此将液相中的核酸吸附到固相上。
文档编号C07H1/00GK1680421SQ20051005423
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月18日 优先权日2004年2月20日
发明者R·齐伦斯基, K·盖斯勒, T·瓦尔特尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司