专利名称：脯氨酸cci－779(与2,2－二(羟基甲基)丙酸的脯氨酸-纳巴霉素42-酯)和使用微生物脂 ...的制作方法
技术领域：
本发明的背景与2，2-二(羟基甲基)酸的纳巴霉素42-酯(CCI-779)是纳巴霉素的一种酯衍生物，它在体外和体内模型中对肿瘤生长表现出明显的抑制性作用。纳巴霉素的羟基酯(包括CCI-779)的制备和使用已经在US专利Nos.5,362,718和6,277,983中描述。
纳巴霉素在42-位的酯化反应从前通过直接将纳巴霉素与酰化剂反应而进行。但因为纳巴霉素包含两个在31和42位上的仲羟基基团，为了实现42-单酰化产物的选择性合成，这两个官能中心仍难以进行区分。目前，用于制备CCI-779的区位选择性工艺包括至少五个步骤(US专利No.6,277,983，国际专利出版物No.WO01/23395)。首先将纳巴霉素用甲硅烷基化剂处理以形成纳巴霉素31，42-二-甲硅烷基醚，并随后将42-甲硅烷基醚保护基团选择性地去除以提供纳巴霉素42-OH-31-甲硅烷基醚。该自由的42-OH随后用2，2，5-三甲基[1，3-二烷]-5-羧酸的2，4，6-三氯苄基混合酸酐酰化并随后进行两个去保护步骤，得到所需CCI-779。
CCI-779与抑制酶，mTOR(纳巴霉素的哺乳动物靶，也称作FKBP12-纳巴霉素相关的蛋白质[FRAP])的细胞质蛋白质FKBP结合并形成配合物。mTOR′s激酶活性的抑制作用抑制各种信号转导路径，包括细胞活素刺激的细胞增生，用于几种关键的调节细胞G1期的周期蛋白质的mRNAs翻译，和IL-2诱导的转录，因此抑制细胞周期从G1传变至S。CCI-779的抑制作用已在多种场合中表现得有效，包括抑制中枢神经系统癌，白血病，胸癌，前列腺癌，黑素瘤，胶质瘤，和成胶质细胞瘤。
需要用于区位特异生产CCI-779，和其类似物的更有效方法。
本发明的综述本发明提供CCI-779的脯氨酸类似物(与2，2-二(羟基甲基)丙酸的脯氨酸-纳巴霉素42-酯或脯氨酸-CCI-779)及其合成方法。脯氨酸-CCI-779是一种可用于肿瘤学和其它相关的适应症(免疫抑制，抗炎症，抗增生和抗肿瘤)的活性药物物质。
一方面，脯氨酸-CCI-779通过脯氨酸纳巴霉素的二-甲硅烷基化，单-去保护31，42-二-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素，和酰化单-甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素，随后水解而合成。
另一方面，本发明提供了一种两步酶工艺，包括使用微生物脂肪酶和2，2-二(羟基甲基)丙酸的活化酯衍生物在有机溶剂中进行纳巴霉素的区位特异酰化，随后去保护，得到CCI-779。
另一方面，本发明方法能够从脯氨酸-纳巴霉素(纳巴霉素类的一种非常相关的纳巴霉素化合物)合成脯氨酸CCI-779。
本发明的其它方面和优点对本领域熟练技术人员来说显而易见。
本发明的详细描述本发明描述了纳巴霉素二羟基酯的一种脯氨酸类似物和其用途。在一个实施方案中，本发明提供了一种脯氨酸CCI-779，其特征在于核心结构 本发明进一步提供一种合成纳巴霉素二羟基酯的脯氨酸类似物的方法。在一个实施方案中，脯氨酸纳巴霉素用作起始原料。
纳巴霉素和其制备描述于US专利No.3,929,992(1975年12月30日授权)。另外，纳巴霉素可商购[Rapamune，Wyeth]。脯氨酸纳巴霉素和其制备已被描述。参见，如，欧洲专利No.0589703。
在一个实施方案中，脯氨酸纳巴霉素被二-硅烷基化以形成31，42-二-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素。可用于该转化的甲硅烷基化剂包括，如，市售氯烷基硅烷，如氯三甲基硅烷，氯三乙基硅烷，氯三丙基硅烷或氯三异丙基硅烷。在一个实施方案中，甲硅烷基化剂是氯三甲基硅烷。尽管可以使用体积较大的甲硅烷基化剂，但这些试剂在随后反应中需要更多的时间在酸性介质中去保护。另外，在酸性介质中的反应时间越长，形成的降解副产物越多。在另一实施方案中，甲硅烷基化反应使用三甲基甲硅烷基氯与合适的有机碱和合适的有机溶剂在低温下进行以形成31，42-二-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素。在一个实施方案中，反应温度是约0至5摄氏度。在其它实施方案中，反应在较低温度下进行，导致较长的反应时间。可容易地选择合适的有机溶剂，包括，如，DMF。在一个实施方案中，乙酸乙酯是溶剂。类似地，合适的有机碱可适宜地选自本领域已知的那些，如，咪唑，1-甲基咪唑，三烷基胺和N，N-二异丙基乙基胺。在一个实施方案中，碱是咪唑，这样在本文所述的条件下在不足1小时就完成反应。
在0至5摄氏度下在稀酸条件下在42-位进行单-去保护，得到31-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素。
单-甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素使用2，2，5-三甲基[1，3-二烷]-5-羧酸的2，4，6-三氯苄基混合酸酐在4-二甲基氨基吡啶或类似催化剂的存在下在二氯甲烷中在-15至-10摄氏度下酰化，得到中间体。在另一实施方案中，单-甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素与2，2，5-三甲基[1，3-二烷]-5-羧酸的酰氯在有机碱催化剂如4-二甲基氨基吡啶的存在下偶联。其它有机催化剂可被替换为4-二甲基氨基吡啶，包括，如，其它叔有机碱如N，N-二甲基苯胺，吡啶，三乙基胺，和二异丙基乙基胺，以及其它。
在一个实施方案中，用于酰化反应的溶剂是二氯甲烷。在其它实施方案中，使用THF，二乙基醚或t-丁基甲基醚。反应可在低于0摄氏度的温度下进行。在一个实施方案中，反应在-10摄氏度，或更低的温度下进行。在一个实施方案中，单-甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素与混合酸酐和二甲基氨基吡啶在二氯甲烷中在-12摄氏度下偶联，得到中间体产物。
在另一实施方案中，酰化可例如按照US专利申请出版物No.US2005/0033046 A1(2005年2月10日出版)所述而进行。
因此，在一个实施方案中，单-甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素使用苯基烃基硼烷的2，4，6-三氯苄基混合酸酐在4-二甲基氨基吡啶或类似催化剂的存在下在二氯甲烷中在-11至-5摄氏度下酰化，得到中间体。在另一实施方案中，苯基烃基硼烷是2-苯基-1，3，2-二氧代烃基硼烷-5-羧酸。在另一实施方案中，苯基烃基硼烷是2-苯基-1，3，2-二氧杂烃基硼烷-4-基，其中苯基是视需要取代的。在另一实施方案中，苯基烃基硼烷是5-甲基-2-苯基-1，3，2-二氧杂烃基硼烷-5-羧酸。
在另一实施方案中，苯基基团用烷基，如C1，C2，C3，C4，C5，或C6烷基取代。其它芳基-(包括苯基-)硼酸可用于该反应。这些包括其中取代基是相同或不同的单，二，和三-取代的芳基硼酸。芳基基团上的取代基包括卤素，烷基，烷氧基，芳基氧基(如，苯氧基)，芳烷基，硝基，氰基，和稠合苯基如萘基硼酸。在作为基团或基团的一部分如烷氧基或芳烷基使用时，术语烷基包括具有1至12个碳原子，如，1-6个碳原子的烷基部分。
作为基团或基团的一部分，如，芳烷基或芳基氧基，术语芳基是指芳族基团，包括具有6-10个碳原子的那些，如，苯基或萘基。在一个实施方案中，用于酰化反应的溶剂是二氯甲烷。
在其它实施方案中，使用THF，二乙基醚或t-丁基甲基醚。反应可在低于0摄氏度的温度下进行。在一个实施方案中，反应在-10摄氏度，或更低的温度下进行。在一个实施方案中，单-甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素与混合酸酐和二甲基氨基吡啶在二氯甲烷中在-12摄氏度下偶联，得到中间体产物。
在合适的溶剂(如THF)和温度下进行温和的酸性水解，得到CCI-779的脯氨酸类似物。在一个实施方案中，使用稀的无机酸如硫酸，氢氯酸或磷酸。在另一实施方案中，使用稀的含水硫酸。浓度范围是0.1N至约3N。在一个实施方案中，浓度是2N，因为在这些条件下，缩醛和甲硅烷基保护基团都被同时水解。在更稀的酸性条件下，水解完成需要更多时间。在一个实施方案中，该步骤在25摄氏度或更低，或约0至5摄氏度下进行。
纯化可通过本领域熟练技术人员已知的方法而进行，包括，如，色谱，最终结晶(如，通过醚处理)，得到纯化脯氨酸CCI-779。在另一实施方案中，本发明提供了一种用于制备与2，2-二(羟基甲基)丙酸(CCI-779)和脯氨酸-CCI-779的纳巴霉素42-酯的新型工艺。以下描述用于制备CCI-779的该方法。但脯氨酸-CCI-779可通过相同的方法从脯氨酸纳巴霉素制成，如下所述。
合成需要两个步骤。第一步骤是将纳巴霉素与2，2-二(羟基甲基)丙酸衍生物的活化酯在有机溶剂中进行微生物脂肪酶-催化酰化。该反应是高度区位选择性的，导致以几乎定量产率仅形成单-42-酰化产物(即，保护的CCI-779)。随后去保护，以优异的总体产率得到CCI-779。
与化学制备相比，该化学酶路径提供明显较短步骤和较高产率。另外，该方法无需任何步骤用于保护纳巴霉素的31-OH基团。
以下方案说明CCI-779的该酶制备。以下实施例用于例证所要求的发明，和不应被理解为对公开内容或所要求的发明的限定。纳巴霉素和其制备描述于US专利No.3,929,992(1975年12月30日授权)。
另外，纳巴霉素可商购[Rapamune，Wyeth]。
对2，2-二(羟基甲基)酸侧链的合适活化酯的确认已被发现是该脂肪酶-催化酰化成功的关键。发明人已经发现，相应的烯醇酯提供最高的活性和最好的产率，尤其乙烯基酯。但也可使用其它酰化试剂如甲基，乙基酯，2，2，2-三氯乙基，2，2，2-三氟乙基酯和N-琥珀酰亚胺基酯。在丙酸的二-羟基基团上的保护基团还在反应中起着重要作用。在一个实施方案中，使用环缩酮和环状硼酸酯。但其它保护基团可选自足够小以使该侧链能够适合酶活性位的保护基团。
2，2-二(羟基甲基)丙酸的活化酯具有以下结构式 其中R是氢或甲基，R1和R2是氢，或共同形成具有以下结构的缩酮， R3，R4分别为，独立地，氢，直链或支链C1-6烷基，或共同形成C5-7环烷基或共同形成具有以下结构的环状硼酸酯， R5选自甲基，乙基，n-丙基，异丙基，n-丁基，异丁基和苯基。具有异亚丙基缩酮(I)或甲基硼酸酯(II)保护基团的乙烯基酯(R＝H)已被选择用于说明本发明的方法。
在一个实施方案中，本发明方法的第一步骤通过将纳巴霉素与乙烯基酯(I)或(II)在微生物源脂肪酶的存在下在合适的有机溶剂中在最佳温度下反应一段时间而进行。
本文所用的″微生物脂肪酶″，即，微生物源脂肪酶包括从非真核生物源中原始分离出的酶，如，黑曲霉，南极念珠菌，皱落念珠菌，米赫毛霉(Mucor miehei)，洋葱假单胞菌，荧光假单胞菌，delemar根霉。但选择用于本发明的酶无需从原始源中直接分离和纯化，但可以合成或重组方式，或通过其它合适的方式而制备。各种这些酶可得自一些商业源。另外，这些酶制剂可在各种供应商的不同的商品名下用作来自不同微生物源的粗品，部分纯化，纯化或固定制剂。
在一个实施方案中，脂肪酶PS-C″Amano″II，一种来自Amano的脂肪酶PS的固定形式，用于本发明方法。但其它脂肪酶可选择用于本发明。这些脂肪酶提供大于60％，大于75％，或高于90％的纳巴霉素至保护的CCI-779中间体的转化度。在另一实施方案中，这些脂肪酶避免形成显著量的源自脂肪酶-催化水解的断裂衍生物。
脂肪酶以有效的催化量使用，即，该量在合理的反应速率下有效地催化纳巴霉素的42-羟基的酰化以形成保护的CCI-779。本领域熟练技术人员可以理解酶的用量可以是约25至约300wt％(相对纳巴霉素的量)。在一个实施方案中，酶的用量是约50至约250wt％，约50至约200wt％，或约75至约150wt％。
合适的有机溶剂包括，但不限于，甲苯，叔丁基甲基醚(TBME)，乙基醚，THF(四氢呋喃)，MeCN，CH2Cl2，CHCl3，iPr2O，己烷，二烷，或包括这些溶剂的混合物。在一个实施方案中，使用TBME(叔丁基甲基醚)。本领域熟练技术人员可以理解，溶剂的用量可在开始时有效地溶解所有的或部分的起始纳巴霉素并使反应在合理的速率下进行。例如，溶剂，如TBME的用量可以是至少4wt体积(即，超过雷帕霉素量4倍(4X)的体积)至约10wt体积，或约5至8wt体积。
TBME可包含残余水(如，约0.05％)，会将纳巴霉素分解成所谓，断裂衍生物，一种大内酯-环开环产物。为了尽量减少该副反应，在反应体系中保持低量的水分。在一个实施方案中，无水溶剂与脂肪酶催化剂的标准商业制剂一起使用。在另一实施方案中，水分可通过通过加入干燥剂调节存在于脂肪酶溶液中的水的量而控制。在另一实施方案中，分子筛可用于控制水分。因为分子筛开始反应减慢，可加入更多的酶用于补偿，或可使用更长的反应时间。如果使用分子筛，5埃筛是尤其理想的。但可适宜地采用其它筛尺寸(包括，4和3埃，以及其它)。合适的分子筛可得自各种商业源。在另一实施方案中，干燥剂如MgSO4，Na2SO4等可用于控制水分含量。
反应在足够低的温度下进行以减少非所需副产物的形成，但不太低而需要过度长的反应时间。适用于该酶工艺的温度可以是约20摄氏度至约75摄氏度，约30摄氏度至65摄氏度，或约40摄氏度至55摄氏度。在一个实施方案中，如果使用TBME作为溶剂，反应温度可允许在45摄氏度。在这些条件下，反应可在48小时内基本上进行完全(＞99％转化率)。但可以使用较低或更高温度，且反应时间的长短可如本文所述而变化。在另一实施方案中，反应可根据要求或需要进行约12小时至120小时，18小时至96小时，24小时至72小时，或约30小时至60小时。反应时间的长短不构成对本发明的限制。在另一实施方案中，反应在N2下进行直至所有的起始原料被消耗。反应可通过各种技术如薄层色谱(TLC)和高效液体色谱(HPLC)而监控。另外，本领域熟练技术人员可以使用其它监控方法。
在一个实施方案中，通过将纳巴霉素，100wt％(相对纳巴霉素的量)脂肪酶PS-C″Amano″II和2，2-二(羟基甲基)丙酸(I)的异亚丙基缩酮保护的乙烯基酯在无水TBME中在45摄氏度下混合48小时，在过滤去除酶之后，得到缩酮保护的CCI-779，＞98％的产率。
在另一实施方案中，该方法通过将纳巴霉素，160wt％脂肪酶PS-C″Amano″II和2，2-二(羟基甲基)丙酸(II)的甲基硼酸酯保护的乙烯基酯在无水叔丁基甲基醚(TBME)中在45摄氏度下混合60小时，在过滤去除酶之后，得到高产率的环状甲基硼酸酯保护的CCI-779，基于回收的纳巴霉素。
在将缩酮-或硼酸酯-保护的2，2-二(羟基甲基)丙酸以酶方式安装到纳巴霉素的42-位之后，CCI-779可通过随后将所得中间体去保护而得到。
在硼酸酯衍生物的情况下，硼酸酯保护基团可通过使用醇溶剂而去除。在本发明的该实施方案中，合适的醇溶剂可容易选自甲醇(MeOH)，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，异丁醇，乙二醇，1，3-丙烷二醇和2-甲基戊烷-2，5-二醇，或这些溶剂的混合物。在一个实施方案中，将得自酶反应的粗品溶解在MeOH中和CCI-779中的硼酸酯部分通过与MeOH交换而形成挥发性二甲基硼酸酯，随后与溶剂一起在减压下蒸发。剩余的残余物包含所需CCI-779以及一些未反应的纳巴霉素，可通过一般方法如硅胶色谱而分离。
缩酮保护基团可在温和酸性条件下去除。一般来说，可采取在US专利No.6,277,983和其中所引用的文件中公开的步骤。在一个实施方案中，去保护在单个期含水酸/有机溶剂体系，如，在四氢呋喃(THF)中的稀硫酸，如2N H2SO4/THF中在约0至5摄氏度下进行。但该反应可需要约3天或更长时间才完成且在反应完成之后需要溶剂萃取从水介质中回收产物。
在另一实施方案中，该酸促进的去保护可在其它水混溶性溶剂如乙腈(MeCN)，n-丙醇和异丙醇中进行。这些溶剂可单独或作为乙腈和n-丙醇或异丙醇之间的混合物而使用。混合溶剂的比率可根据本文所述而在约5份乙腈/1份丙醇(v/v)，至约1份乙腈/5份丙醇之间变化。该比率不构成对本发明的限制。如果以上溶剂或其混合物用作反应介质，在一个实施方案中，使用含水硫酸，因为它尽量减少在使用其它酸，如含水氢氯酸时产生的杂质的形成，例如描述于US专利No.5,362,718。含水硫酸的浓度可以是3N至0.25N，约2N至0.35N，或约1.5N至0.5N.反应可在约25摄氏度或更低，约-5摄氏度至约10摄氏度，或约0摄氏度至约5摄氏度的温度下进行。
如果反应完成，粗品可通过例如描述于US专利No.6,277,983(国际专利出版物No.WO01/23395)的溶剂萃取，或通过将反应混合物加入冰冷的(0摄氏度至5摄氏度)磷酸盐缓冲剂中经由沉淀而回收。在一个实施方案中，磷酸盐缓冲剂的浓度是约2M至0.05M，1M至0.1M，或0.5M至0.15M，pH值是6至9，或7.5至8.5。在一个实施方案中，去保护在具有1.2N H2SO4的n-丙醇中在0摄氏度至5摄氏度下进行和反应在24h内完成，粗品随后通过将反应混合物加入用冰-水浴冷却的磷酸盐缓冲剂(0.5M，pH 8)中而被回收为灰白色粉末。在另一实施方案中，去保护在混合溶剂MeCN-n-丙醇(2.5/1.5v/v)中在0摄氏度至5摄氏度下进行，反应在0.6N H2SO4的存在下在28小时内完成，并通过将反应混合物加入磷酸盐缓冲剂(0.25M，pH 7.8)而将产物回收为灰白色粉末。
在另一实施方案中，CCI-779可通过使用在THF中的含水2NH2SO4直接水解酶反应混合物而得到，无需分离粗缩酮-保护的CCI-779。在该工艺，酶反应如上所述进行。如果反应完成，将酶过滤掉并用2倍体积的THF洗涤，将混合物随后浓缩至一定体积并用THF稀释。在处理与2N H2SO4在0-5摄氏度下处理一段时间之后，CCI-779可以高产率分离。
本发明的合成路径相对在US专利Nos.5,362,718和6,277,983中公开的合成方法具有几个明显的优点。这些优点包括易处理，仅涉及两步操作，且所需42-酯的总体产率提高。例如，描述于US专利No.5,362,718的合成方法提供35％产率的异亚丙基缩酮-保护的CCI-779，和描述于US专利No.6,277,983的合成方法提供85％产率，而本文所述的两步酶工艺提供几乎定量产率的产物。
在另一实施方案中，提供了一种通过本文所述的相同的酶工艺由脯氨酸-纳巴霉素制备脯氨酸-CCI-779(一种与CCI-779非常相关的化合物)的方法。脯氨酸-纳巴霉素(一种来自纳巴霉素发酵粗品的微量组分)仅在结构上不同于氨基酸单元，即，用脯氨酸替代纳巴霉素中的2-哌啶酸。脯氨酸纳巴霉素，脯氨酸-CCI-779和其衍生物描述于EP589703。
根据本发明制备的所得CCI-779和脯氨酸CCI-779可用于药物组合物。这些组合物可通过本领域描述用于纳巴霉素或其衍生物的任何合适的方法而配制。
包含本文所述活性化合物的口服配方可包括任何常用的口服形式，包括片剂，胶囊，口腔形式，药片，锭剂和口服液体，悬浮液或溶液。胶囊可包含活性化合物与惰性填料和/或稀释剂如药物可接受淀粉(如，谷类，马铃薯或木薯淀粉)，糖，人造增甜剂，粉状纤维素，如结晶和微晶纤维素，面粉，明胶，树胶，等的混合物。有用的片剂配方可通过常规压缩，湿造粒或干造粒方法而制成和采用药物可接受稀释剂，结合剂，润滑剂，崩解剂，表面改性剂(包括表面活性剂)，悬浮或稳定剂，包括，但不限于，硬脂酸镁，硬脂酸，滑石，月桂基硫酸钠，微晶纤维素，羧甲纤维素钙，聚乙烯基吡咯烷酮，明胶，藻酸，阿拉伯胶，黄原胶，枸橼酸钠，复合硅酸盐，碳酸钙，甘氨酸，糊精，蔗糖，山梨醇，二磷酸钙，硫酸钙，乳糖，白陶土，甘露醇，氯化钠，滑石，干淀粉和粉状糖。在一个实施方案中，表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性例子包括，但不限于，泊洛沙姆188，苯扎氯铵，硬脂酸钙，鲸蜡硬脂基醇，鲸蜡聚乙二醇乳化蜡，脱水山梨醇酯，胶体二氧化硅，磷酸盐，十二烷基硫酸钠，硅酸铝镁，和三乙醇胺。口服配方在此可采用标准延迟或时间释放配方以改变活性化合物的吸收。口服配方也可将活性成分在水或果汁中给药，其中根据需要包含合适的溶解剂或乳化剂。
在一个实施方案中，与3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸的纳巴霉素42-酯的口服配方描述于US出版专利申请No.US 2004-0077677A1(也是US专利申请No.10/663,506)，在此作为参考并入本发明。这种口服配方包含使用湿造粒工艺而制成的粒剂。类似口服配方可使用本发明的脯氨酸-CCI-779而制备。
有时也许需要将这些化合物以气溶胶的形式直接向气道给药。
这些化合物也可不经肠道或腹膜内给药。作为游离碱或药理可接受盐的这些活性化合物的溶液或悬浮液可在水中合适地与表面活性剂如羟基-丙基纤维素混合而制成。分散体也可在甘油，液体聚乙二醇和其在油中的混合物中而制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防微有机体生长。
适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的和必须是流动的使得具有易注射性。它必须在制造和储存条件下稳定和必须针对微有机体如细菌和真菌的污染作用加以保护。载体可以是溶剂或包含，例如，水，乙醇，多元醇(如，甘油，丙二醇和液体聚乙二醇)，其合适的混合物，和植物油的分散介质。
在一个实施方案中，可注射配方描述于US专利出版物No.US2004-0167152 A1(也是US专利申请No.10/626,943)，在此作为参考并入本发明。用于脯氨酸-CCI-779的类似不经肠道配方可容易制备。
在另一实施方案中，可用于本发明的可注射配方提供包含如上所述的不经肠道可接受溶剂和抗氧化剂的CCI-779或脯氨酸-CCI-779助溶剂浓缩物和包含CCI-779或脯氨酸-CCI-779(由CCI-779或脯氨酸-CCI-779组成)，不经肠道可接受助溶剂，抗氧化剂，稀释剂溶剂，和表面活性剂的不经肠道配方。可用于本发明的任何给定配方可包含每类组分的多个成分。在一个实施方案中，不经肠道可接受溶剂可包括非醇溶剂，醇溶剂，或其混合物。
合适的非醇溶剂的例子包括，如，二甲基乙酰胺，二甲基亚砜或乙腈，或其混合物。″醇溶剂″可包含一种或多种醇作为该配方的醇溶剂组分。
可用于本发明配方的溶剂的例子包括，但不限于，乙醇，丙二醇，聚乙二醇300，聚乙二醇400，聚乙二醇600，聚乙二醇1000，或其混合物。这些助溶剂是尤其理想的，因为这些助溶剂通过氧化和内酯裂解发生变质的程度较低。另外，乙醇和丙二醇可相结合以得到不太可燃性的产物，但混合物中的较大量的乙醇一般带来较好的化学稳定性。在混合物中的30至100％v/v乙醇的浓度是优选的。
在另一实施方案中，CCI-779或脯氨酸-CCI-779在不经肠道可接受醇助溶剂中的稳定性通过向配方中加入抗氧化剂而增加。可接受抗氧化剂包括，但不限于，柠檬酸，d，l-α-维生素E，BHA，BHT，单硫代甘油，抗坏血酸，没食子酸丙酯，和其混合物。一般，可用于本发明该实施方案的不经肠道配方本发明包含浓度0.001％至1％w/v的抗氧化剂组分，或0.01％至0.5％w/v的助溶剂浓缩物，但较低或更高浓度可以是所需的。在一个实施方案中，d，l-α-维生素E的使用浓度是0.01至0.1％w/v，或0.075％w/v的助溶剂浓缩物。
在其它实施方案中，本发明配方的抗氧化剂组分还具有螯合活性。这些螯合剂的例子包括，如，柠檬酸，乙酸，和抗坏血酸(可在本配方中用作标准的抗氧化剂和螯合剂)。其它螯合剂包括能够键接溶液中的金属离子的那些材料，如亚乙基二胺四乙酸(EDTA)，其盐，或能够增加CCI-779或脯氨酸-CCI-779的稳定性的氨基酸如甘氨酸。在其它实施方案中，具有螯合活性的组分被包括在本发明配方中作为唯一的″抗氧化剂组分″。在一个实施方案中，这些金属-结合组分在用作螯合剂时以本文所提供的抗氧化剂组分的浓度范围的下限使用。另外，这些螯合剂可与作为本发明抗氧化剂组分的一部分的其它抗氧化剂结合使用。例如，可接受配方可包含柠檬酸和，d，l-α-维生素E。本领域熟练技术人员容易地根据本文所提供的信息确定所选抗氧化剂的最佳浓度。
有利地，在可用于本发明的不经肠道配方的某些实施方案中，CCI-779或脯氨酸-CCI-779在用含水浸泡溶液或血液稀释时的沉淀通过使用包含在稀释剂溶液中的表面活性剂而得到预防。稀释剂的最重要的组分是不经肠道可接受表面活性剂。一种尤其理想的表面活性剂是聚山梨酯20或聚山梨酯80。但本领域熟练技术人员可容易从视需要与卵磷脂相结合的胆汁酸的盐(牛磺胆酸盐，甘氨胆酸盐，胆酸盐，脱氧胆酸盐，等)中选择其它合适的表面活性剂。另外，乙氧基化植物油，如pegylated蓖麻油[如PEG-35蓖麻油，如，以名称CremophorEL销售，BASF]，维生素E维生素E丙二醇琥珀酸酯(维生素E TGPS)，和聚氧基亚乙基-聚氧基亚丙基嵌段共聚物，以及聚山梨酯类如聚山梨酯20或60的其它成分可在稀释剂中用作表面活性剂。稀释剂的其它组分可包括水，乙醇，聚乙二醇300，聚乙烯400，聚乙烯600，聚乙烯1000，或包含一种或多种这些聚乙二醇，丙二醇和其它不经肠道可接受助溶剂或用于调节溶液容积渗透克分子浓度的试剂如氯化钠，乳糖，甘露醇或其它不经肠道可接受糖，多元醇和电解质的共混物。表面活性剂预期包含2至100％w/v稀释剂溶液，5至80％w/v，10至75％w/v，15至60％w/v，或至少5％w/v，或至少10％w/v的稀释剂溶液。
可用于本发明的不经肠道配方可作为单个溶液而制成。在另一实施方案中，可用于本发明的不经肠道配方可作为包含CCI-779或脯氨酸-CCI-779，醇溶剂，和抗氧化剂的助溶剂浓缩物而制成，随后与包含稀释剂溶剂和合适的表面活性剂的稀释剂相结合。在使用之前，助溶剂浓缩物与包含稀释剂溶剂，和表面活性剂的稀释剂混合。如果CCI-779或脯氨酸CCI-779被制成根据本发明的助溶剂浓缩物，那么该浓缩物可包含浓度0.05mg/mL，2.5mg/mL，5mg/mL，10mg/mL或25mg/mL最高约50mg/ml的CCI-779或脯氨酸-CCI-779。该浓缩物可与稀释剂混合最高约1份浓缩物/1份稀释剂，得到具有浓度1mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL，最高约25mg/ml的CCI-779或脯氨酸CCI-779的不经肠道配方。例如，CCI-779或脯氨酸-CCI-779在不经肠道配方中的浓度可以是约2.5至10mg/mL。本发明还包括具有较低浓度的CCI-779或脯氨酸-CCI-779在助溶剂浓缩物，和其中1份浓缩物与大于1份的稀释剂混合的配方中的应用，如，浓缩物∶稀释剂的比率为约1∶1.5，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，或1∶9v/v等等，直至具有低至最低检出水平的CCI-779或脯氨酸-CCI-779浓度的不经肠道配方。
在一个实施方案中，抗氧化剂可占配方的约0.0005至0.5％w/v，表面活性剂可占配方的约0.5％至约10％w/v，和醇溶剂可占配方的约10％至约90％w/v。
可用于本发明的不经肠道配方可用于得到适合通过直接注射或通过加入至用于静脉内浸泡的无菌浸泡流体而给药的剂型。
就本公开内容而言，透皮给药要理解为包括通过体表和体内(包括上皮和粘膜组织)而进行的所有给药。这些给药可使用本化合物，或药物可接受其盐，在洗剂，膏，泡沫材料，贴，悬浮液，溶液，和栓剂(直肠和阴道)中进行。
透皮给药可通过使用透皮贴而实现，其中包含活性化合物和对活性化合物惰性，对皮肤无毒，和使用于全身吸收的试剂能够通过皮肤传输到血流中的载体。载体可呈现许多形式如膏和软膏，糊，凝胶，和封闭设备。膏和软膏可以是水包油或油包水型的粘稠液体或半固体乳液。糊也是合适的，由分散在包含活性成分的石油或亲水石油中的吸收性粉末组成。各种封闭设备可用于将活性成分释放到血流中，如覆盖包含有或没有载体的活性成分的储器的半透膜，或包含活性成分的基质。其它封闭设备是文献中已知的。
栓剂配方可由传统材料，包括可可脂，有或者没有加入蜡以改变栓剂′s熔点，和甘油制成。也可使用水可溶栓剂基料，如各种分子量的聚乙二醇。
本发明进一步提供包含根据本发明制成和配制成通过合适的传输方法给药的脯氨酸-CCI-779或CCI-779的包装和成套工具。各种合适的容器(包括瓶，小瓶，多孔包装，和类似物)是本领域熟练技术人员已知的。这些包装和成套工具可进一步包含其它组件，包括，如，使用指示，注射器，涂覆器，和类似物。
实施例以下实施例说明脯氨酸CCI-779的生产。从以上的详细描述可容易理解，本发明不限于在这些实施例中提供的试剂和条件。
实施例1-合成脯氨酸CCI-779 该实施例描述了一种用于合成CCI-779的脯氨酸类似物的方法，该方法在以上提供的方案中说明。
A.制备31，42-二(三甲基甲硅烷基)脯氨酸纳巴霉素(化合物B)向3颈50mL烧瓶中装入脯氨酸纳巴霉素(方案中的化合物A)(1.47g，1.63mmol)，咪唑(0.45g，6.6mmol，4eq.)和乙酸乙酯(22.5mL)。磁力搅拌的混合物变得浑浊。将混合物冷却至0-5摄氏度。在氮保护下，将三甲基甲硅烷基氯(0.62g，5.7mmol，3.5eq.)在0.5h内通过注射器加入，同时在加入过程中将温度保持在0-5摄氏度。将注射器用2.5ml乙酸乙酯漂洗并将混合物保持0.75小时(0.75小时)，这样形成白色沉淀物。反应通过薄层色谱(TLC)(30∶70丙酮∶庚烷洗脱剂)而监控。TLC样品通过将3-4滴反应混合物淬灭到0.25mL饱和碳酸氢钠和10滴乙酸乙酯中而制备。将混合物振荡并使其沉降。上有机层针对起始原料(脯氨酸纳巴霉素)进行斑点分析。如果不再存在更起始原料，那么反应完成。
B.制备31-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素，化合物E在以上反应完成时，取出2-3滴反应混合物并作为31，42-二(三甲基甲硅烷基)脯氨酸纳巴霉素参考文件标准保留用于以下步骤。在0.5小时内向50ml烧瓶中加入0.5N硫酸(4.5mL)，同时保持温度在0-5摄氏度.混合物变得不太浑浊。将混合物保持2.5小时并通过薄层色谱(TLC，30∶70丙酮∶庚烷洗脱剂)监控。TLC样品通过将3-4滴反应混合物淬灭到0.25mL饱和碳酸氢钠和10滴乙酸乙酯中而制备。将混合物振荡并使其沉降。上有机层针对31，42-二(三甲基甲硅烷基)脯氨酸纳巴霉素参考进行斑点分析。如果基本上不存在31，42-二(三甲基甲硅烷基)纳巴霉素，那么反应完成。加入乙酸乙酯(5mL)并分层。将下方的水层用乙酸乙酯(7.5mL)提取。将合并的有机层按照顺序用盐水(7.5mL)，饱和碳酸氢钠(6mL)，随后用洗涤水(3×7.5mL)洗涤。最后水洗液的pH是6-7。将有机层再次用盐水(7.5mL)洗涤和在硫酸钠(4g)上干燥20min。将混合物滤人250mL烧瓶和浓缩至无水。将固体在室温下在高真空(10mmHg或更低)下干燥20小时。重量＝1.51g灰白色泡沫材料。
C.制备中间体，化合物F向配有机械搅拌器的3颈100mL烧瓶中装入在二氯甲烷(7.5mL)中的2，2，5-三甲基[1，3-二烷]-5-羧酸，化合物C(0.63g，3.6mmol)。加入二异丙基乙基胺(0.77g，5.9mmol)，随后用二氯甲烷(1mL)漂洗。加入2，4，6-三氯苯甲酰氯(0.85g，3.5mmol)，随后用二氯甲烷(1.5mL)漂洗。混合物在室温下保持4.5小时。将溶液冷却至-12±2摄氏度。
将31-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素，化合物E(1.51g)在二氯甲烷(8mL)中溶解和加入100mL烧瓶中。加入二氯甲烷(2mL)用于漂洗。制备二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.77g，6.8mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液并在2.5h内在保持温度-12#2摄氏度的同时加入100mL烧瓶中。加入二氯甲烷(1mL)用于漂洗。混合物保持16h和通过将3-4滴反应混合物淬灭到0.25mL水和0.2mL乙酸乙酯中用HPLC监控。HPLC样品通过取出2滴上有机层，在氮气下在HPLC小瓶中吹干样品和使用移动相再溶解而制备。
HPLC柱CSC Hypersil ODS/BDS 5μm。
移动相68.5％二烷水+0.01M KH2PO4波长λ＝280nm流速1mL/min时间60min停留时间化合物E ～14.0-14.5min化合物F ～33.4-33.8min如果存在＜0.5％的起始原料，那么反应完成。将反应混合物用水(6mL)淬灭。加入二氯甲烷(10mL)并分层。将水层用二氯甲烷(10mL)提取。将合并的有机层用0.5N硫酸(12mL)，盐水(10mL)，饱和碳酸氢钠(6mL)，和水(3×10mL)按顺序洗涤。最后水洗液的pH是6-7。将透明黄色溶液浓缩成泡沫材料。将固体在室温下在高真空(10mmHg或更低)下干燥24h。重量＝1.88g黄色泡沫材料。
D.制备粗脯氨酸CCI-779向配有机械搅拌器的1颈50mL烧瓶中装入在THF(18.8mL，10vols)中的化合物F并随后冷却至0-5摄氏度(或约-2.5摄氏度)。在2.5h内加入2N硫酸(9.4mL，5vols)。在完全加入之后，将混合物是暖至2.5摄氏度并随后保持45h。反应通过将3-4滴反应混合物淬灭到0.25mL饱和碳酸氢钠和0.25mL乙酸乙酯中用HPLC监控。HPLC样品通过取出5滴上有机层，在氮气下在HPLC小瓶中吹干样品和使用移动相再溶解而制备。
HPLC柱CSC Hypersil ODS/BDS 5μm。
移动相68.5％二烷水+0.01M KH2PO4波长λ＝280nm流速1mL/min时间60min停留时间化合物F ～33.4-33.8min
去硅烷基化化合物F(中间体) ～10.5-11.5min脯氨酸CCI-779 ～5.0-5.5min首先形成化合物F的去硅烷基化中间体。如果留下＜0.5％的硅烷基化类似物，那么反应完成。加入乙酸乙酯(27mL)和盐水(7.5mL)并分层。将水层用乙酸乙酯(10mL)提取。将合并的有机层用盐水(10mL)，饱和碳酸氢钠(7.5mL)，和水(3×7.5mL)按顺序洗涤。最后水洗液的pH是6-7。将混合物在硫酸钠(5g)上干燥30min，过滤到250mL烧瓶中和浓缩至无水。重量＝1.58g黄色泡沫材料。
E.色谱纯化粗脯氨酸CCI-779准备硅胶柱(31.6g，60埃，200-400目)(22cm长度×2.5cm直径)并用15∶85丙酮∶HPLC级己烷(1L)调控。制备在丙酮(1.58mL)中的黄色粗脯氨酸CCI-779(1.58g)并色谱处理。将柱用剩余的15∶85丙酮∶己烷混合物，随后用25∶75丙酮∶己烷(4L)洗脱。将阳性级分合并并浓缩至无水。将所得泡沫材料在35摄氏度下高真空(即，10mmHg或更低)干燥24h。重量＝1.12g浅黄色泡沫材料。
F.脯氨酸CCI-779的醚处理向1颈50mL烧瓶中装入脯氨酸CCI-779(1.12g)和溶解在醚(1.5mL)中。将混合物保持2h。将醚汽提，得到泡沫材料。将泡沫材料在35摄氏度下在高真空(10mmHg或更低)下干燥12h，随后在室温下干燥过夜(12h)。重量＝1.09g。1H NMR(500和600MHz，DMSO-d6)δ5.45(H-1)，6.12(H-2)，6.27(H-3)，6.41(H-4)，6.20(H-5)，3.66(H-7)，1.14和1.86(H-8)，4.02(H-9)，1.19和1.81(H-10)，1.52(H-11)，2.03(H-12)，3.23和3.54(H-18)，1.76(H-19)，2.20和1.89(H-21)，4.22(H-22)，4.87(H-25)，2.28和2.70(H-26)，3.22(H-28)，5.11(H-29)，4.04(H-31)，4.17(H-32)，2.25(H-34)，0.985和1.38(H-35)，2.22(H-36)，1.76(H-37)，0.961和1.11(H-38)，1.31(H-39)，0.726和1.90(H-40)，3.14(H-41)，4.46(H-42)，1.22和1.81(H-43)，0.888和1.60(H-44)，1.60(H-45)，3.05(H-46，OCH3)，0.697(H-47)，6.48(H-48)，0.821(H-49)，1.76(H-50)，近似值5.1-5.3(H-51)，3.17(H-52，OCH3)，0.755(H-53)，0.966(H-54)，0.805(H-55)，3.29(H-56，OCH3)，3.46(H-59)，1.01(H-60)，近似值4.3-4.7(O-61).13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ139.12(C-1)，130.53(C-2)，132.49(C-3)，127.08(C-4)，127.21(C-5)，137.12(C-6)，81.93(C-7)，40.40(C-8)，65.83(C-9)，29.45(C-10)，25.87(C-11)，34.21(C-12)，99.25(C-13)，198，17(C-15)，165.55(C-16)，47.01(C-18)，24.04(C-19)，28.93(C-21)，58.50(C-22)，170.44(C-23)，73.24(C-25)，39.96(C-26)，207.67(C-27)，44.51(C-28)，123.92(C-29)，136.56(C-30)，75.84(C-31)，84.86(C-32)，209.49(C-33)，40.76(C-34)，39.20(C-35)，35.05(C-36)，32.73(C-37)，38.42(C-38)，32.06(C-39)，36.01(C-40)，80.12(C-41)，75.92(C-42)，29.25(C-43)，30.24(C-44)，10.27(C-45)，55.48(C-46，OCH3)，15.46(C-47)，15.59(C-49)，14.41(C-50)，56.56(C-52，OCH3)，12.67(C-53)，21.50(C-54)，14.89(C-55)，57.27(C-56，OCH3)，174.22(C-57)，49.90(C-58)，63.59和63.98(C-59)，16.82(C-60).MS[M+NH4+]1033.5，[ESI(+)，M+Na+]1038.7.
以下实施例说明CCI-779的区位特异生产。实施例2说明可用于本发明的乙烯基酯的生产。但本发明不限于这些乙烯基酯或这些生产方法。合适的用于产生乙烯基酯的其它方法是本领域熟练技术人员熟知的。实施例3说明使用实施例2的乙烯基酯进行的CCI-779的区位特异生产，和实施例4说明使用实施例2的乙烯基酯进行的脯氨酸-CCI-779的区位特异生产。从以上的详细描述可容易理解，本发明不限于在这些实施例中提供的试剂和条件。
实施例2-合成乙烯基酯A.I的合成 将PdCl2(708mg，4mmol)，LiCl(168mg，4mmol)在MeOH(16mL)中加热回流直至混合物变成透明溶液，MeOH随后在减压下被去除，加入乙酸乙烯酯(10mL)并将溶液浓缩至无水。将残余物随后再溶解在乙酸乙烯酯(20mL)中并加入2，2-二(羟基甲基)丙酸(34.8g，200mmol)在乙酸乙烯酯(280mL)中的混合物。将混合物随后轻微回流过夜(约16h)。将溶液在减压下浓缩，向该残余物中加入庚烷(150mL)并通过celite垫过滤去除黑色沉淀物。将庚烷溶液浓缩并将残余物在减压下蒸馏，得到乙烯基酯I作为无色液体(30.1g，75％)B.II的合成
将I(10g)在MeCN(50mL)中的溶液用含水H2SO4(20mL，0.25N)在室温下处理4h。混合物随后用EtOAc稀释，用盐水，2.5％NaHCO3，和盐水洗涤。将有机层在MgSO4上干燥。过滤和浓缩至约60mL，随后将(MeBO)3(2.2mL)滴加至以上溶液。将混合物在室温下搅拌1.5h，用己烷(60mL)稀释，加入MgSO4(3g)并将混合物搅拌另外10min。过滤和浓缩得到一种油状残余物，将它在减压下蒸馏，得到II作为无色液体(7.2g，78％)。
实施例3-合成CCI-779 A.通过中间体A合成CCI-779方法1将纳巴霉素(6g)，乙烯基酯I(2g)，脂肪酶PS-C″Amano″II(6g)在无水TBME(36mL)中的混合物在45摄氏度下在Ar2下搅拌2天。将混合物冷却至室温并将酶通过过滤而去除，将滤液浓缩，将油状残余物在搅拌下加入庚烷中。将批料随后冷却至-15摄氏度达2h，在Buchner漏斗上收集固体和用冷庚烷洗涤，A作为灰白色固体而得到，粗产率98％。MS(EI)1070将以上粗品A(6g)溶解在用冰-水浴冷却至0摄氏度的n-PrOH(24mL)中，向该溶液中加入含水H2SO4(12mL，1.2N)。将混合物在0摄氏度下搅拌24h并随后加入冷磷酸盐缓冲剂(300ml，pH＝7.8)中，在Buchner漏斗上收集固体并用DI水洗涤和在真空下干燥，用己烷-丙酮洗脱进行硅胶柱纯化，得到CCI-779作为白色固体(5.2g，90％)。
MS(EI)1030
方法2将纳巴霉素(30.0g，32.8mmol)，乙烯基酯I(10.0g，50mmol)，脂肪酶PS-C″Amano″II(30g)和分子筛(5埃)(10.0g)在无水TBME(150mL)中的混合物在42-43摄氏度下在Ar2下加热48小时。加入THF(100mL)以溶解沉淀物并将混合物冷却至室温。
酶通过过滤而去除和用THF(200mL)洗涤，将滤液浓缩至约60mL和用THF(320mL)稀释。将溶液随后冷却至0-5摄氏度，在1小时内滴加H2SO4(180mL，2N)。将混合物在0-5摄氏度下搅拌48hr或直至A消失(通过TLC监控)。将混合物用盐水(300mL)稀释和用EtOAc(三次)提取。合并的有机层用H2O，5％NaHCO3，随后用盐水洗涤和干燥(MgSO4)。将溶剂蒸发，得到浅黄色半固体，将它通过闪蒸色谱(己烷/丙酮，2∶1)而纯化，得到CCI-779作为白色固体(30.77g，91％，对于两个步骤)。
B.通过中间体B合成CCI-779将纳巴霉素(3g)，乙烯基酯II(1.2g)，脂肪酶PS-C″Amano″II(5g)在无水TBME(45mL)中的混合物在45摄氏度下在Ar2下加热60h。将混合物冷却至室温并将酶通过过滤而去除，将滤液浓缩，将MeOH(20mL)加入残余物中并浓缩至无水。粗品用己烷-丙酮洗脱进行硅胶柱纯化，得到CCI-779作为白色固体(2.3g)，和回收纳巴霉素(0.81g)。产率是93％，基于回收的纳巴霉素。
实施例4-合成脯氨酸-CCI-779本发明的酶步骤也可用于在与实施例2，步骤A用于由纳巴霉素合成CCI-779基本上相同的条件下由脯氨酸-纳巴霉素合成脯氨酸CCI-779。
本发明的范围不限于本文所述的特定实施方案。确实，本领域熟练技术人员根据以上描述和附图
显然得出除本文所述之外的本发明的各种变型。这些改进意味着落入所附权利要求书的范围内。
进一步要理解，数值是近似值，且为了说明而提供。
专利，专利申请，出版物，步骤等在整个申请中被引用，其公开内容在此作为参考并入本发明。因为说明书和参考文件之间可存在抵触，以在此公开的语言为准。
权利要求
1.与2，2-二(羟基甲基)丙酸(脯氨酸-CCI-779)的脯氨酸-纳巴霉素42-酯。
2.一种用于区位特异制备与2，2-二(羟基甲基)丙酸(CCI-779和脯氨酸-CCI-779)的纳巴霉素42-酯或脯氨酸-纳巴霉素42-酯的方法，包括步骤(a)将纳巴霉素或脯氨酸-纳巴霉素与具有以下结构的2，2-二(羟基甲基)酸的活化酯衍生物 其中R1和R2是氢，或一起形成具有以下结构的缩酮 其中R3和R4分别为，独立地，氢，C1-6烷基，直链或支链，或一起形成C5-7环烷基或一起形成具有以下结构的环状硼酸酯， 其中R5选自甲基，乙基，n-丙基，异丙基，n-丁基，异丁基和苯基；在合适的有机溶剂中在有效量微生物脂肪酶的存在下反应；和(b)将得自步骤(a)的中间体去保护，得到CCI-779或脯氨酸-CCI-779。
3.根据权利要求2的方法，其中活化酯具有结构 其中R是氢或甲基，和R1和R2定义如权利要求2。
4.根据权利要求2或3的方法，其中活化酯是乙烯基酯。
5.根据权利要求4的方法，其中活化酯选自乙烯基酯(I)和乙烯基酯(II)。
6.根据任何一项权利要求2至5的方法，其中微生物脂肪酶使用是选自微有机体黑曲霉，南极念珠菌，皱落念珠菌，米赫毛霉，洋葱假单胞菌，荧光假单胞菌，delemar根霉的脂肪酶。
7.根据权利要求6的方法，其中所用的脂肪酶是来自洋葱假单胞菌的脂肪酶PS或PS-C。
8.根据任何一项权利要求2至7的方法，其中合适的有机溶剂选自甲苯，叔丁基甲基醚(TBME)，乙基醚，THF(四氢呋喃)，MeCN，CH2Cl2，CHCl3，iPr2O，己烷，二烷，或包括这些溶剂的混合物。
9.根据任何一项权利要求2至8的方法，进一步包括在步骤(a)中加入选自无水MgSO4和无水Na2SO4的干燥剂。
10.根据任何一项权利要求2至9的方法，进一步包括将分子筛应用于步骤(a)中的反应。
11.根据任何一项权利要求2至10的方法，其中步骤(a)中的反应在温度20摄氏度至75摄氏度下进行。
12.根据任何一项权利要求2至11的方法，其中去保护步骤(b)包括硼酸酯-保护的CCI-779或硼酸酯-保护脯氨酸-CCI-779溶解在选自甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，异丁醇，乙二醇，1，3-丙烷二醇，和2-甲基戊烷-2，5-二醇，或其混合物的醇溶剂。
13.根据任何一项权利要求2至11的方法，其中去保护步骤(b)用于缩酮-保护的CCI-779或缩酮-保护脯氨酸-CCI-779进行在冷却稀释酸在水混溶性有机溶剂。
14.一种用于制备与2，2-二(羟基甲基)丙酸(脯氨酸-CCI-779)的脯氨酸-纳巴霉素42-酯的方法，包括步骤使用三甲基甲硅烷基氯和咪唑在乙酸乙酯将脯氨酸纳巴霉素二-甲硅烷基化以形成31，42-二-三甲基甲硅烷基脯氨酸；将31，42-二-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素在42-位在稀酸条件下单-去保护以提供31-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素；将混合酸酐与31-三甲基甲硅烷基脯氨酸纳巴霉素和二甲基氨基吡啶在二氯甲烷中反应；和将产物水解以提供脯氨酸-CCI-779。
15.一种根据任何一项权利要求2至13的方法制备的与2，2-二(羟基甲基)丙酸(脯氨酸-CCI-779)的脯氨酸-纳巴霉素42-酯。
16.一种组合物，包含根据权利要求1或15的与2，2-二(羟基甲基)丙酸(脯氨酸-CCI-779)的脯氨酸-纳巴霉素42-酯和生理相容的载体。
17.一种根据任何一项权利要求2至13的方法制备的与2，2-二(羟基甲基)丙酸(CCI-779)的纳巴霉素42-酯。
18.一种组合物，包含根据权利要求17的与2，2-二(羟基甲基)丙酸(CCI-779)的纳巴霉素42-酯和生理相容的载体。
19.一种产品，包含根据权利要求16或18的组合物和用于所述组合物的容器。
全文摘要
本发明公开了一种与2，2－二(羟基甲基)丙酸(脯氨酸－CCI－779)的脯氨酸－纳巴霉素42－酯以及一种用于区位特异制备与2，2－二(羟基甲基)丙酸(CCI－779和脯氨酸－CCI－779)的纳巴霉素42－酯或脯氨酸－纳巴霉素42－酯的方法，包括步骤(a)将纳巴霉素或脯氨酸－纳巴霉素与具有结构(A)的2，2－二(羟基甲基)丙酸的活化酯衍生物，其中R
文档编号C07F7/18GK1942477SQ200580011277
公开日2007年4月4日 申请日期2005年4月12日 优先权日2004年4月14日
发明者J·顾, M·E·鲁彭, P·拉维德拉纳斯, W·丘, C·-C·肖 申请人:惠氏公司