专利名称：用于治疗rna依赖性rna病毒感染的核苷氨基磷酸芳基酯的制作方法
技术领域：
本发明涉及核苷氨基磷酸芳基酯、其合成法以及作为RNA依赖性RNA病毒聚合酶的抑制剂的前体的用途。本发明的化合物是RNA依赖性RNA病毒复制抑制剂的前体，并且用于治疗RNA依赖性RNA病毒感染。它们特别可用作丙型肝炎病毒(HCV)NS5B聚合酶的抑制剂的前体、HCV复制抑制剂的前体、以及用于治疗丙型肝炎感染。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是引起慢性肝病(例如肝硬化和肝细胞癌)的一个主要健康问题，受感染者的人数估计占世界人口的2～15％。根据美国疾病控制中心报道，在美国估计有4.5百万人感染。根据世界卫生组织报道，全世界有超过2亿的感染人群，且每年至少有3～4百万人感染。一旦感染，约20％的人清除病毒，但在其余的受感染者中，HCV却存留一生。10～20％的长期被感染者最后发展为肝脏损伤性的肝硬化或癌症。该病毒性疾病通过受污染的血液和血液制品、受污染的针而经肠胃外传播，或者通过受感染母体或母体携带者的通过性途径或垂直途径传染给后代。目前对于HCV感染的治疗方法仅限于单独使用或与核苷类似物病毒唑联合使用重组干扰素-α，它们的临床效果都是有限的。此外，对于HCV还没有已建定的疫苗。因此，急需有效抵抗慢性HCV感染的改良治疗剂。有关HCV感染的治疗技术的现状的综述参阅B.Dymock等“Novel approaches to the treatment of hepatitisC virus infection，”Antiviral Chemistry & Chemotherapy，1179-96(2000)；H.Rosen等“Hepatitis C viruscurrent understanding andprospects for future therapies，”Molecular Medicine Today，5393-399(1999)；D.Moradpour等，“Current and evolving therapies forhepatitis C，”European J.Gastroenterol.Hepatol.，111189-1202(1999)；R.Bartenschlager，“Candidate Targets for Hepatitis CVirus-Specific Antiviral Therapy，”Intervirology，40378-393(1997)；G.M.Lauer和B.D.Walker，“Hepatitis C Virus Infection，”N.Engl，J.Med.，34541-52(2001)；B.W.Dymock，“Emerging therapies forhepatitis C virus infection，”Emerging Drugs，613-42(2001)；和C.Crabb，“Hard-Won Advances Spark Excitement about Hepatitis C，”Science506-507(2001)；其全部内容在此引为参考。
目前已经采取了不同的HCV治疗方法，包括抑制病毒性丝氨酸蛋白酶(NS3蛋白酶)、解旋酶和RNA依赖性RNA聚合酶(NS5B)，以及开发疫苗。
HCV病毒是一种具备约9600碱基的单个寡核糖核苷酸基因组序列(其编码约3010个氨基酸的多蛋白)的有包膜的正链RNA病毒。HCV基因的蛋白质产物由结构性蛋白质C、E1和E2，以及非结构性蛋白质NS2、NS3、NS4A和NS4B以及NS5A和NS5B组成。据信非结构性(NS)蛋白为病毒复制提供了催化机构。NS3蛋白酶从多蛋白链释放NS5B，RNA依赖性RNA聚合酶。HCV NS5B聚合酶是从单链病毒RNA(其作为HCV复制循环的模板)合成双链RNA所需要的。因此，NS5B聚合酶被认为是HCV复制复合体中的必要成分[参阅K.Ishi等“Expressionof Hepatitis C Virus NS5B ProteinCharacterization of Its RNAPolymerase ActiVity and RNA Binding，”Hepatology. 291227-1235(1999)和V.Lohmann等“Biochemical and Kinetic Analyses ofNS5B RNA-Dependent RNA Polymerase of the Hepatitis C Virus，″Virology，249108-118(1998)]。因此，HCV NS5B聚合酶的抑制阻止了双链HCV RNA的形成，并因此构成了一诱人的开发HCV特异性抗病毒疗法的方法。
有关具有治疗HCV感染的潜在作用的HCV NS5B聚合酶的抑制剂的开发的综述参阅M.P.Walker等“Promising candidates for thetreatment of chronic hepatitis C，″Expert Opin.Invest.Drugs.121269-1280(2003)和P.Hoffmann等“Recent patents on experimentaltherapy for hepatitis C Virus infection(1999-2002)，”Expert Opin.Ther.Patente.″“131707-1723(2003)。在A.E.Eldrup等“Structure-ActivityRelationship of Purine Ribonucleosides for Inhibition of HCV RNA-Dependent RNA Polymerase，“J.Med.Chem.，472283-2295(2004)中报道了嘌呤核糖核苷抗HCV聚合酶的活性。仍然需要在结构上不同的核苷衍生物，作为HCV聚合酶抑制剂用于HCV治疗的治疗性疗法。
现已发现本发明的核苷氨基磷酸芳基酯是RNA依赖性RNA病毒复制(特别是HCV复制)的有效的抑制剂的前体。所述氨基磷酸酯在体内转化为其核苷5’-磷酸(核苷酸)衍生物，后者转化为相应的核苷5’-三磷酸衍生物——RNA依赖性RNA病毒聚合酶(特别是HCV NS5B聚合酶)的抑制剂。本发明的核苷氨基磷酸酯可以用于治疗RNA依赖性RNA病毒感染(特别是HCV感染)。
因此，本发明的另一个目的在于提供核苷氨基磷酸芳基酯，其被用作RNA依赖性RNA病毒聚合酶的抑制剂的前体，特别用作HCVNS5B聚合酶的抑制剂的前体。
本发明的另一个目的在于提供核苷氨基磷酸芳基酯，其被用作RNA依赖性RNA病毒复制抑制剂的前体，特别用作丙型肝炎病毒复制抑制剂的前体。
本发明的另一个目的在于提供核苷氨基磷酸芳基酯，其被用于治疗RNA依赖性RNA病毒感染，特别是用于治疗HCV感染。
本发明的另一个目的在于提供药物组合物，其包含本发明的核苷氨基磷酸芳基酯和药学上可接受的载体。
本发明的另一个目的在于提供包含本发明的核苷氨基磷酸芳基酯用作RNA依赖性RNA病毒聚合酶抑制剂的前体、特别是作为HCVNS5B聚合酶抑制剂的前体的药物组合物。
本发明的另一个目的在于提供包含本发明的核苷氨基磷酸芳基酯用作RNA依赖性RNA病毒复制抑制剂的前体、特别是作为HCV复制抑制剂的前体的药物组合物。
本发明的另一个目的在于提供包含本发明的核苷氨基磷酸芳基酯用于治疗RNA依赖性RNA病毒感染、特别是用于HCV感染的药物组合物。
本发明的另一个目的在于提供包含与其它抗RNA依赖性RNA病毒(特别是HCV)的活性剂联合的本发明核苷氨基磷酸芳基酯的药物组合物。
本发明的另一个目的在于提供抑制RNA依赖性RNA病毒聚合酶，特别是抑制HCV NS5B聚合酶的方法。
本发明的另一个目的在于提供抑制RNA依赖性RNA病毒复制，特别是抑制HCV复制的方法。
本发明的另一个目的在于提供治疗RNA依赖性RNA病毒感染，特别是治疗HCV感染的方法。
本发明的另一个目的在于提供与其他抗RNA依赖性RNA病毒的活性剂联合治疗RNA依赖性RNA病毒感染的方法，特别是与其他抗HCV活性剂联合治疗HCV感染的方法。
本发明的另一个目的在于提供核苷氨基磷酸芳基酯及其药物组合物作为药物用于抑制RNA依赖性RNA病毒复制和/或治疗RNA依赖性RNA病毒感染，特别是用于抑制HCV复制和/或治疗HCV感染。
本发明的另一个目的在于提供本发明的核苷氨基磷酸芳基酯及其药物组合物在制造用于抑制RNA依赖性RNA病毒复制和/或治疗RNA依赖性RNA病毒感染，特别是用于抑制HCV复制和/或治疗HCV感染的药物中的用途。
从下述详细说明中，上述及其他目的将变得显而易见。
发明概述本发明涉及下面立体化学构型表示的结构式I的化合物 或其药学上可接受的盐，其中Y是CR9或N；Ar是未取代的或被1～3个独立选自下列组的取代基取代的苯基卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、氰基、硝基、氨基、羧基、三氟甲基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷基羰基氧基和C1-4烷基氧基羰基；R1选自氢、氟、叠氮基、氨基、羟基、C1-3烷氧基、巯基和C1-3烷硫基；
R2和R3独立地选自氢、甲基、C1-16烷基羰基、C2-18烯基羰基、C1-10烷基氧基羰基、C3-6环烷基羰基、C3-6环烷基氧基羰基；R4是氢、卤素、甲基、叠氮基或氨基；R5和R6独立地选自氢、羟基、卤素、C1-4烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、二(C3-6环烷基)氨基、苄基氨基、二苄基氨基或C4-6杂环烷基，其中烷基、环烷基、苄基和杂环烷基是未取代的或被1～5个独立选自卤素、羟基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基团取代；R7是氢、C1-5烷基、苯基或苄基；其中烷基是未取代的或被一个选自羟基、甲氧基、氨基、羧基、氨基甲酰基、胍基、巯基、甲硫基、1H-咪唑基和1H-吲哚-3-基的取代基取代；其中苯基和苄基是未取代的或被1～2个独立选自卤素、羟基和甲氧基的取代基取代；R8是氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、苯基或苄基；其中烷基和环烷基是未取代的或被1～3个独立选自卤素、羟基、羧基、C1-4烷氧基的取代基取代；其中苯基和苄基是未取代的或被1～3个独立选自卤素、羟基、氰基、C1-4烷氧基和三氟甲基的取代基取代；R9选自氢、氟、氰基、C1-3烷基、NHCONH2、CONR10R10、CSNR10R10、COOR10、C(＝NH)NH2、羟基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基和二(C1-4烷基)氨基；每个R10独立表示氢或C1-6烷基；R11是氢或甲基。
式I的化合物可以用作RNA依赖性RNA病毒聚合酶(特别是HCVNS5B聚合酶)的抑制剂的前体。其还是RNA依赖性RNA病毒复制(特别是HCV复制)抑制剂的前体，并用于治疗RNA依赖性RNA病毒感染(特别是治疗HCV感染)。
本发明的氨基磷酸芳基酯是作为相应的核苷5’-单磷酸酯的前药进行作用的，对于其作用机制没有限制。内源性激酶将5’-单磷酸酯转变成其5’-三磷酸酯衍生物——RNA依赖性RNA病毒聚合酶的抑制剂。因此，氨基磷酸芳基酯比核苷本身具有更有效的标靶细胞渗透，可能对代谢降解的敏感性更小，并能够靶向特定组织(例如肝脏)，从而在较低的抗病毒试剂总剂量下得到更广泛的治疗指数。
本发明还包括包含单独或与其他抗RNA依赖性RNA病毒(特别是抗HCV)的活性剂组合的该化合物的药物组合物、以及抑制RNA依赖性RNA病毒复制和治疗RNA依赖性RNA病毒感染的方法。
发明的详细说明本发明涉及下面立体化学构型表示的结构式I的化合物 或其药学上可接受的盐，其中Y是CR9或N；Ar是未取代的或被1～3个独立选自下列组的取代基取代的苯基卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、氰基、硝基、氨基、羧基、三氟甲基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷基羰基氧基和C1-4烷基氧基羰基；R1选自氢、氟、叠氮基、氨基、羟基、C1-3烷氧基、巯基和C1-3烷硫基；R2和R3独立地选自氢、甲基、C1-16烷基羰基、C2-18烯基羰基、C1-10烷基氧基羰基、C3-6环烷基羰基、C3-6环烷基氧基羰基；R4是氢、卤素、甲基、叠氮基或氨基；R5和R6各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-4烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、二(C3-6环烷基)氨基、苄基氨基、二苄基氨基或C4-6杂环烷基，其中烷基、环烷基、苄基和杂环烷基是未取代的或被1～5个独立选自卤素、羟基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基团取代；R7是氢、C1-5烷基、苯基或苄基；其中烷基是未取代的或被一个选自羟基、甲氧基、氨基、羧基、氨基甲酰基、胍基、巯基、甲硫基、1H-咪唑基和1H-吲哚-3-基的取代基取代；其中苯基和苄基是未取代的或被1～2个独立选自卤素、羟基和甲氧基的取代基取代；R8是氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、苯基或苄基；其中烷基和环烷基是未取代的或被1～3个独立选自卤素、羟基、羧基、C1-4烷氧基的取代基取代；其中苯基和苄基是未取代的或被1～3个独立选自卤素、羟基、氰基、C1-4烷氧基和三氟甲基的取代基取代；R9选自氢、氟、氰基、C1-3烷基、NHCONH2、CONR10R10、CSNR10R10、COOR10、C(＝NH)NH2、羟基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基和二(C1-4烷基)氨基；每个R10独立表示氢或C1-6烷基；R11是氢或甲基。
式I的化合物可以用作RNA依赖性RNA病毒聚合酶的抑制剂的前体。其还是RNA依赖性RNA病毒复制抑制剂的前体，并可用于治疗RNA依赖性RNA病毒感染。
在本发明化合物的一个实施方式中，Y是N，R1是氢或氟，且R2和R3是氢。在该类实施方式中R4是氢。
在本发明化合物的第二个实施方式中，Y是CR9，R1是氢或氟，且R2和R3是氢。在该类实施方式中R9是氢或氟，在该类的子类中，R4是氢。
在本发明化合物的第三个实施方式中，Ar是未取代的苯基。
在本发明化合物的第四个实施方式中，R11是氢，R7选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、异丁基、2-甲基-1-丙基、羟基甲基、巯基甲基、羧基甲基、氨基甲酰基甲基、1-羟基乙基、2-羧基乙基、2-氨基甲酰基乙基、2-甲硫基乙基、4-氨基-1-丁基、3-氨基-1-丙基、3-胍基-1-丙基、1H-咪唑-4-基甲基、苯基、4-羟基苄基和1H-吲哚-3-基甲基。在该类实施方式中R7是甲基或苄基。
在本发明化合物的第五个实施方式中，R8是C1-6烷基、环己基、苯基或苄基。在该类实施方式中R8是甲基。
在本发明化合物的第六个实施方式中，Ar是未取代的苯基、R7是甲基或苄基、R8是甲基、R11是氢。
结构式I的本发明化合物，其用作RNA依赖性RNA病毒聚合酶的抑制剂的前体，举例但非限制的实例如下
和 或其药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方式中，本发明的核苷氨基磷酸芳基酯可以用作正义单链RNA依赖性RNA病毒聚合酶的抑制剂、正义单链RNA依赖性RNA病毒复制抑制剂，和/或用于治疗正义单链RNA依赖性RNA病毒感染。在该类实施方式中，正义单链RNA依赖性RNA病毒是黄病毒科(Flaviviridae)病毒或小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)病毒。在该类的子类中，小核糖核酸病毒科病毒是鼻病毒、脊髓灰质炎病毒或甲型肝炎病毒。在该类的第二子类中，黄病毒科病毒包括丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、Banzi病毒和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。在该子类的子类中，黄病毒科病毒为丙型肝炎病毒。
本发明的另一方面涉及在哺乳动物中抑制RNA依赖性RNA病毒聚合酶的方法、抑制RNA依赖性RNA病毒复制的方法、和/或治疗RNA依赖性RNA病毒感染的方法，其包括对哺乳动物给药治疗有效量的结构式I的化合物。
本发明此方面的一个实施方式中，RNA依赖性RNA病毒聚合酶是正义单链RNA依赖性RNA病毒聚合酶。在该类实施方式中，正义单链RNA依赖性RNA病毒聚合酶是黄病毒科病毒聚合酶或小核糖核酸病毒科病毒聚合酶。在该类的子类中，小核糖核酸病毒科病毒聚合酶是鼻病毒聚合酶、脊髓灰质炎病毒聚合酶或甲型肝炎病毒聚合酶。在该类的第二子类中，黄病毒科病毒聚合酶包括丙型肝炎病毒聚合酶、黄热病病毒聚合酶、登革热病毒聚合酶、西尼罗河病毒聚合酶、日本脑炎病毒聚合酶、Banzi病毒聚合酶和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)聚合酶。在该子类的子类中，黄病毒科病毒聚合酶为丙型肝炎病毒聚合酶。
本发明此方面的第二个实施方式中，RNA依赖性RNA病毒复制是正义单链RNA依赖性RNA病毒复制。在该类实施方式中，正义单链RNA依赖性RNA病毒复制是黄病毒科病毒复制或小核糖核酸病毒科病毒复制。在该类的子类中，小核糖核酸病毒科病毒复制是鼻病毒复制、脊髓灰质炎病毒复制或甲型肝炎病毒复制。在该类的第二子类中，黄病毒科病毒复制包括丙型肝炎病毒复制、黄热病病毒复制、登革热病毒复制、西尼罗河病毒复制、日本脑炎病毒复制、Banzi病毒复制和牛病毒性腹泻病毒复制。在该子类的子类中，黄病毒科病毒复制为丙型肝炎病毒复制。
本发明此方面的第三个实施方式中，RNA依赖性RNA病毒感染是正义单链RNA依赖性RNA病毒感染。在该类实施方式中，正义单链RNA依赖性RNA病毒感染是黄病毒科病毒感染或小核糖核酸病毒科病毒感染。在该类的子类中，小核糖核酸病毒科病毒感染是鼻病毒感染、脊髓灰质炎病毒感染或甲型肝炎病毒感染。在该类的第二子类中，黄病毒科病毒感染包括丙型肝炎病毒感染、黄热病病毒感染、登革热病毒感染、西尼罗河病毒感染、日本脑炎病毒感染、Banzi病毒感染和牛病毒性腹泻病毒感染。在该子类的子类中，黄病毒科病毒感染为丙型肝炎病毒感染。
在本说明书中，下列术语具有如下的意义
上述烷基是指包括指定长度的直链或支链烷基。该烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等。
术语“烯基”是指2～6个总碳原子数(或该范围内任何碳原子数)的直链或支链烯烃(例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基等)。
术语“炔基”是指2～6个总碳原子数(或该范围内任何碳原子数)的直链或支链炔烃(例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等)。
术语“环烷基”是指3～8个总碳原子数(或该范围内任何碳原子数)的环状烷烃(例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基)。
术语“环杂烷基”包括含1～2个选自氮、氧和硫的杂原子的非芳香杂环。实例为4～6-员环杂烷基，包括氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、哌嗪基等。
术语“烷氧基”是指规定碳原子数(例如C1-4烷氧基)或该范围内任何碳原子数(例如甲氧基(MeO-)、乙氧基、异丙氧基等)的直链或支链烃氧化物。
术语“烷硫基”是指规定碳原子数(例如C1-4烷硫基)或该范围内任何碳原子数(例如甲硫基(MeS-)、乙硫基、异丙硫基等)的直链或支链烷基硫。
术语“烷基氨基”是指规定碳原子数(例如C1-4烷基氨基)或该范围内任何碳原子数(例如甲氨基、乙氨基、异丙氨基、叔丁氨基等)的直链或支链烷基胺。
术语“烷基磺酰”是指规定碳原子数(例如C1-6烷基磺酰)或该范围内任何碳原子数(例如甲磺酰(MeSO2-)、乙磺酰、异丙磺酰等)的直链或支链烷基砜。
术语“烷基氧基羰基”是指规定碳原子数(例如C1-4烷基氧基羰基)或该范围内任何碳原子数(例如甲基氧基羰基(MeOCO-)、乙基氧基羰基、丁基氧基羰基)的本发明羧酸衍生物的直链或支链酯。
术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
术语“磷酰基”是指-P(O)(OH)2。
术语“二磷酰基”是指具有下列结构的基团
术语“三磷酰基”是指具有下列结构的基团 术语“取代”应当认为包括被给定的取代基多重取代。在说明书或权利要求所述的多重取代基残基中，取代化合物可以独立地被一个或多个说明书的或权利要求所述的取代基残基一次或多次取代。
术语“5’-三磷酸酯”是指本发明的核苷化合物的5’-羟基的三磷酸酯衍生物，其具有下列结构通式II 其中Y和R1～R6定义如上。
术语“组合物”，例如在“药物组合物”中，包括含活性成分的产物和形成载体的惰性成分的产物，以及通过组合、络合或聚集任何两种或多种所述成分、或解离一种或多种所述成分、或经一种或多种所述成分的其他类型反应直接或间接得到的其他产物。因此，本发明的药物组合物包含本发明的化合物与药学上可接受的载体混合制得的任何组合物。
术语化合物的“给药”和“用药”应当理解为向所需个体提供本发明的化合物或本发明化合物的前药。
本发明的另一方面涉及联合一种或多种可用于治疗HCV感染的药剂使用本发明的化合物抑制HCV NS5B聚合酶的方法、联合一种或多种可用于治疗HCV感染的药剂使用本发明的化合物抑制HCV复制的方法，或联合一种或多种可用于治疗HCV感染的药剂使用本发明的化合物治疗HCV感染的方法。这种抗HCV的活性剂包括但不局限于病毒唑、左旋韦林(levovirin)、viramidine、胸腺素α-1、干扰素-β、干扰素-α、PEG化(pegylated)干扰素-α(PEG干扰素-α)、干扰素-α和病毒唑的组合、PEG干扰素-α和病毒唑的组合、干扰素-α和左旋韦林的组合、PEG干扰素-α和左旋韦林的组合。干扰素-α包括但不局限于重组干扰素-α2a(例如从Hoffmann-LaRoche，Nutley，NJ购得的Roferon干扰素)、PEG化干扰素-α2a(PegasysTM)、干扰素-α2b(例如从ScheringCorp.，Kenilworth，NJ购得的Intron-A干扰素)、PEG化干扰素-α2b(PegIntronTM)、重组共有序列干扰素(consensus interferon)(例如干扰素alphacon-1)和纯化干扰素-α产品。Amgen′s重组共有序列干扰素的商品名是Infergen。左旋韦林是病毒唑的L-对映异构体，其具有类似于病毒唑的免疫调节活性。Viramidine表示WO 01/60379(转让给ICN Pharmaceuticals)中公开的病毒唑的类似物。根据本发明的方法，该组合的单个成分可以在治疗的不同时期分别给药或以分开的或单一的组合的形式同时给药。因此本发明应理解为包含这种同时或交替治疗的全部方案，且术语“给药”应做相应的解释。很明显，本发明的化合物与用于治疗HCV感染的其他药剂组合在原则上包括与任何用于治疗HCV感染的药物组合物的任何组合。当本发明的化合物或其药学上可接受的盐与第二抗HCV的活性治疗剂联合使用时，每种化合物的剂量既可以与其单独使用时的剂量相同，也可以不同。
用于治疗HCV感染时，本发明的化合物还可以联合HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂进行给药。HCV NS3丝氨酸蛋白酶是一种基本病毒酶。且已经将它们描述为抑制HCV复制的优异标靶。HCV NS3蛋白酶抑制剂的底物和非底物基抑制剂公开于WO 98/22496、WO98/46630、WO 99/07733、WO 99/07734、WO 99/38888、WO 99/50230、WO 99/64442、WO 00/09543、WO 00/59929、GB-2337262、WO02/48116、WO 02/48172和美国专利US 6,323,180。HCV NS3蛋白酶作为用于开发HCV复制抑制剂和用于治疗HCV感染的标靶的内容如B.W.Dymock，″Emerging therapies for hepatitis C virus infection，″Emerging Drugs，613-42(2001)所述。
病毒唑、左旋韦林和viramidine可以通过抑制细胞内酶肌苷单磷酸酯脱氢酶(IMPDH)来调节细胞内鸟嘌呤核苷酸库，从而发挥它们的抗HCV效果。IMPDH是从头鸟嘌呤核苷酸生物合成路线上的限速酶。病毒唑很容易细胞内磷酸化，且该单磷酸酯衍生物是IMPDH的抑制剂。因此，抑制IMPDH代表了发现HCV复制抑制剂的另一个有用标靶。因此，本发明的化合物也可以与以下物质联合给药IMPDH抑制剂，例如VX-497，如WO 97/41211和WO 01/00622(转让给Vertex)所述；另一种IMPDH抑制剂，如WO 00/25780(转让给Bristol-MyersSquibb)；或mycophenolate mofetil(参阅A.C.Allison和E.M.Eugui，Agents Action.44(Suppl.)165(1993))所述。
用于治疗HCV感染时，本发明的化合物还可以联合抗病毒剂金刚烷胺(1-氨基金刚烷)(该药剂的详细说明参阅J.Kirschbaum，Anal.Profiles Drug Subs.121-36(1983))给药。
本发明的化合物还可与抗病毒2’-C-分支核糖核苷联合治疗HCV感染，所述2’-C-分支核糖核苷如R.E.Harry-O′kuru等，J.Org.Chem..621754-1759(1997)；M.S.Wolfe等，Tetrahedron Lett..367611-7614(1995)；美国专利US 3,480,613(Nov.25，1969)；国际专利申请WO01/90121(29 November 2001)；国际专利申请WO 01/92282(6 December2001)；国际专利申请WO 02/32920(25 April 2002)；国际专利申请WO04/002999(8 January 2004)；国际专利申请WO 04/003000(8 January2004)；国际专利申请WO 04/002422(8 January 2004)所述；其全文在此引为参考。该2’-C-分支核糖核苷包括但不限于2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基尿苷、2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基鸟苷和9-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-2，6-二氨基嘌呤以及核糖C-2’、C-3’、C-5’羟基的相应氨基酸酯和5’-磷酸酯衍生物相应的任选取代的环状1，3-丙二醇酯。
本发明的化合物还可与其他具有抗HCV特性的核苷组合治疗HCV感染，例如，如WO 02/51425(4 July 2002)，转让给MitsubishiPharma Corp.；WO 01/79246、WO 02/32920和WO 02/48165(20 June2002)，转让给Pharmasset，Ltd.；WO 01/68663(20 September 2001)，转让给ICN Pharmaceuticals；WO 99/43691(2 Sept.1999)；WO02/18404(7 March 2002)，转让给Hoffmann-LaRoche；U.S.2002/0019363(14 Feb.2002)；WO 02/100415(19 Dec.2002)；WO03/026589(3 Apr.2003)；WO 03/026675(3 Apr.2003)；WO 03/093290(13Nov.2003)；US 2003/0236216(25 Dec.2003)；US 2004/0006007(8 Jan.2004)；WO 04/011478(5 Feb.2004)；WO 04/013300(12 Feb.2004)；US2004/0063658(1 Apr.2004)和WO 04/028481(8 Apr.2004)所述的那些。
本发明的化合物还可与HCV聚合酶的非核苷抑制剂组合治疗HCV感染，例如，如WO 01/77091(18 Oct.2001)，转让给Tularik，Inc.；WO 01/47883(5 July 2001)，转让给Japan Tobacco，Inc.；WO02/04425(17 January 2002)，转让给Boehringer Ingelheim；WO02/06246(24 Jan.2002)，转让给Istituto di Ricerche di BiologiaMoleculare P.Angeletti S.P.A.；和WO 02/20497(3 March 2002)所述的那些。
“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容，且对接受者无害。
含本发明的核苷氨基磷酸芳基酯与药学上可接受的载体的药物组合物也包括在本发明内。本发明的另一个实例是通过将任何上述化合物与药学上可接受的载体结合制得的药物组合物。本发明的另一个实例是制备药物组合物的方法，包括将任何上述化合物与药学上可接受的载体结合。
本发明还包括含有效量的本发明化合物和药学上可接受的载体、用于抑制RNA依赖性RNA病毒聚合酶，特别是HCV NS5B聚合酶的药物组合物。本发明还包括用于治疗RNA依赖性RNA病毒感染，特别是HCV感染的药物组合物，以及抑制RNA依赖性RNA病毒聚合酶，特别是HCV NS5B聚合酶的方法，和治疗RNA依赖性的病毒复制，特别是HCV复制的方法。此外，本发明涉及含治疗有效量的本发明化合物与另一治疗有效量的抗RNA依赖性RNA病毒(特别是抗HCV)活性剂的药物组合物。抗HCV的活性剂包括但不局限于，病毒唑、左旋韦林、viramidine、胸腺素α-1、HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂、干扰素-α、PEG化干扰素-α(PEG干扰素-α)、干扰素-α和病毒唑的组合、PEG干扰素-α和病毒唑的组合、干扰素-α和左旋韦林的组合、PEG干扰素-α和左旋韦林的组合。干扰素-α包括但不局限于重组干扰素-α2a(例如从Hoffmann-LaRoche，Nutley，NJ购得的Roferon干扰素)、干扰素-α2b(例如从Schering Corp.，Kenilworth，NJ购得的Intron-A干扰素)、共有序列干扰素和纯化干扰素-α产品。对于病毒唑及其抗HCV活性的论述参阅J.O. Saunders和S.A. Raybuck，″InosineMonophosphate DehydrogenaseConsideration of Structure，Kinetics，and Therapeutic Potential，″Ann.Rep.Med.Chem.，35201-210(2000)。
本发明另一方面提供核苷氨基磷酸芳基酯及其药物组合物用于制备抑制RNA依赖性RNA病毒复制(特别是HCV复制)，和/或治疗RNA依赖性RNA病毒感染(特别是HCV感染)的药物的用途.本发明另一方面提供核苷氨基磷酸芳基酯及其药物组合物用作抑制RNA依赖性RNA病毒复制(特别是HCV复制)，和/或治疗RNA依赖性RNA病毒感染(特别是HCV感染)的药物。
本发明的药物组合物包含作为活性成分的结构式I的化合物或其药学上可接受的盐，并可还包含药学上可接受的载体和任选地其他治疗成分。
所述组合物包括如下组合物，其适合于口服、直肠、局部、肠胃外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、眼(眼用药)、肺部(鼻或口腔吸入)或鼻给药，在任何给出的情形中最合适的途径取决于所需治疗的状况的性质和严重程度，以及活性成分的特征。它们可以方便地以单元剂量形式存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。
在实际使用中，结构式I的化合物可作为活性成分根据常规的药物混配技术与药物载体紧密混合。该载体可以是各种形式，取决于希望给药的制剂形式，例如口服或肠胃外(包括静脉内)。在制备组合物的口服剂量形式时，可以使用任何常见的药物介质，例如在口服液体制剂例如悬浮液、酏剂和溶液情况下，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或在口服固体制剂例如粉末、硬和软胶囊和片剂情况下，载体比如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，其中相对于液体制剂更优选固体口服制剂。
由于易于给药，片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单元形式，在此时显然是使用固体药物载体。如果需要，可以通过标准的含水或非水工艺对片剂进行包衣。这种组合物和制剂应包含至少0.1％的活性化合物。这些组合物中活性化合物的百分比当然可以改变，可适宜地在约2％～约60％单元重量。在这种治疗上可用组合物中的活性化合物的量使得得到有效的剂量。该活性化合物还可以鼻内给药，例如以液体滴剂或喷雾剂的形式存在。
片剂、丸、胶囊等还可以包含粘合剂，例如黄著胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂比如磷酸二钙；崩解剂比如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸；润滑剂比如硬脂酸镁；和甜味剂比如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单元形式为胶囊时，它除上述类型的材料外还可以包含液体载体，例如脂油。
多种其他材料可以作为包衣存在或用来改进剂量单元的物理形式。例如片剂可以涂有虫胶、糖或两者皆有。糖浆或酏剂，除活性成分外，还可以包含蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料，和调味剂例如樱桃或橙味香料。
结构式I的化合物还可以肠胃外给药。可以在与表面活性剂(例如羟基-丙基纤维素)适当混合的水中制备这些活性化合物的溶液或悬浮液。可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散体。在普通储存条件和使用下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散体，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有的情况中，药物形式都必须是无菌的，且必须呈流动态达到容易注射的程度。它在制备和储存条件下中必须稳定，且必须在防止抗微生物(例如细菌和真菌)污染作用的条件下保存。载体可以是溶剂或分散介质，其中包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适当的混合物和植物油。
可以采用任何适当的给药途径对哺乳动物(尤其是人类)使用有效剂量的本发明化合物。例如可以采用口服、直肠、局部、肠胃外、眼、肺部、鼻等途径。剂量形式包括片剂、锭剂、分散体、悬浮液、溶液、胶囊、乳剂、软膏剂、气雾剂等。优选结构式I的化合物以口服给药。
对于向人类口服给药，在分剂量(divided doses)中，剂量范围为0.01～1000mg/kg体重。在一个实施方式中，在分剂量中，剂量范围是0.1～100mg/kg体重。在另一个实施方式中，在分剂量中，剂量范围是0.5～20mg/kg体重。对于口服给药，组合物优选形式为片剂或胶囊，包含1.0～1000毫克的活性成分，特别是1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900和1000毫克的活性成分，以根据需治疗的患者的症状调整剂量。
使用的活性成分的有效剂量可以变化，其取决于使用的具体化合物、给药模式、被治疗的状况和被治疗的状况的程度。本领域技术人员可以很容易确定这样的剂量。可以调整该剂量方案以提供最佳的治疗反应。
本发明的化合物包含一个或多个不对称中心，因此可以以外消旋物和外消旋混合物、单个对映异构体、非对映异构体混合物和单个非对映异构体存在。当R11是氢且与结构式I中磷原子连接的氨基酰基残基中的R7在下式中不是氢时， 所述氨基酸残基包含不对称中心，并且意图包括单独的R-和S-立体异构体以及RS-立体异构体混合物。在一个实施方式中，在产生立体化学的(stereogenic)碳原子上的立体化学对应于S-氨基酸的立体化学，即天然存在的α-氨基酸的立体化学。
结构式I的化合物中四取代的磷构成另一不对称中心，并且本发明的化合物意图包括该磷原子上的所有两种立体化学构型。
本发明意在包括，具有下述结构式所示的五-员呋喃糖环β-D立体化学构型的核苷氨基磷酸芳基酯，即这样的核苷氨基磷酸芳基酯，其中五-员呋喃糖环的C-1和C-4取代基具有β-立体化学构型(粗线表示“向上”的立体取向)。
本文描述的某些化合物含有烯属双键，除非另外特别说明，意在包括E和Z两种几何异构体。
本文描述的某些化合物可以以互变异构体存在，例如酮-烯醇互变异构体。单个互变异构体及其混合物包括在结构式I的化合物中。意图包括在本发明化合物中的酮-烯醇互变异构体的实例举例说明如下 结构式I的化合物可以分离成单个的非对映异构体，通过例如从适的溶剂中(例如甲醇、乙酸乙酯或其混合物)分级结晶进行，或通过使用旋光固定相经手性色谱法进行。
另外，结构式I的化合物的任何立体异构体也可以使用已知构型的光学纯起始原料或试剂通过立体专一性合成得到。
本发明的化合物可以以药学上可接受的盐的形式给药。术语“药学上可接受的盐”是指从药学上可接受的无毒碱或酸(包括无机或有机碱和无机或有机酸)制备的盐。包含在术语“药学上可接受的盐”中的碱性化合物的盐指通常由游离碱与适当的有机或无机酸反应制备的本发明化合物的无毒盐。本发明的碱性化合物的代表性盐，包括但不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸化物、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐(edisylate)、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷盐(glycollylarsanilate)、hexylresorcinate、哈胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、isothionate、乳酸盐、乳糖醛酸盐(lactobionate)、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐(napsylate)、硝酸盐、N-甲基葡萄糖胺铵盐、油酸盐、乙二酸盐、双羟萘酸盐、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐、多聚半乳糖醛酸盐(polygalacturonate)、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物和戊酸盐。此外，当本发明的化合物带有酸性结构部分时，其适当的药学上可接受的盐，包括但不限于，来自无机碱(包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠、锌等)的盐。特别优选铵、钙、镁、钾、钠盐。来自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺、叔胺、环胺和碱离子交换树脂比如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡萄糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、哈胺、异丙胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤类、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血酸胺等的盐。
此外，如果本发明的化合物中存在羧酸(-COOH)或羟基基团时，可以采用药学上可接受的羧酸衍生物的前药酯类(例如甲酯、乙酯或特戊酰氧甲酯)或核糖C-2’、C-3’和C-5’羟基的前药酰基衍生物(例如O-乙酰基、O-特戊酰基、O-苯甲酰基、O-氨基酰基)。包括本领域已知的用于改进生物利用率、组织分布、溶解度和水解特征的那些酯和酰基，用于缓释或前药制剂。所考虑的该衍生物可以在体内很容易转化成所需的化合物.因此，在本发明的治疗方法中，术语“给药”和“用药”是指包括使用具体公开的化合物，或虽然没有具体公开但在哺乳动物(包括人类患者)给药后可以在体内转化成该指定化合物的化合物，对所描述的病毒感染进行治疗。适当的前药衍生物的选择与制备的常规程序描述在例如“Design of Prodrugs”，H.Bundgaard编辑，Elsevier，1985，其全文在此引为参考。
本发明氨基磷酸芳基酯的制备在国际专利申请公开WO 02/057287(25 July 2002)和WO02/057425(25 July 2002)中描述了用于磷酸化反应的核苷中间体的制备。用于磷酸化反应的氯化磷酸芳基酯(aryl phosphorochloridates)根据美国专利6,455,513描述的方法制备，其全文在此引为参考。生成本发明的氨基磷酸芳基酯的磷酸化反应根据美国专利US 6,455,513和C.McGuigan等，J.Med.Chem.，361048(1993)描述的方法进行。
下列实施例用于举例说明制备本发明化合物的条件。这些实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围，不应对其作这种解释.核苷和核苷酸合成领域的技术人员很容易理解，可以使用已知的对下列制备工序条件和过程的变型来制备本发明的这些化合物和其他化合物。除非另作说明，所有的温度规定是摄氏度。
实施例1和22’-C-甲基腺苷5’-[甲氧基-(S)-丙氨酰基磷酸苯基酯] 在室温下将2’-C-甲基腺苷(500mg)，甲氧基-(S)-丙氨酰基氯化磷酸苯基酯[1.3g，根据J.Med.Chem.，361048(1993)制备]，N-甲基咪唑(0.8mL)和1，4-二氧六环(10mL)的溶液搅拌18小时。浓缩该反应化合物，放入饱和的碳酸氢钠水溶液中，并用氯仿萃取三次。该氯仿萃取物在无水硫酸镁上干燥，过滤，浓缩得到棕褐色固体。所需的产物在硅胶上使用色谱法使用10％甲醇/二氯甲烷作为洗脱液纯化，然后冻干得到无色固体——为磷原子上非对映异构体的混合物。使用反相液相色谱(Kromasil C8，4.6×250mm，梯度20％～50％乙腈溶于0.1％三氟乙酸水溶液，历时15分钟，1.5mL/分钟)分离所述非对映异构体，得到呈无色固体的每个非对映异构体。各异构体的质谱m/z＝523。
实施例3和42’-C-甲基鸟苷5’-[甲氧基-(S)-丙氨酰基磷酸苯基酯] 在室温下将2’-C-甲基鸟苷(40mg)，1，4-二氧六环(2mL)，N-甲基咪唑(70μL)和所述氯化磷酸酯(73mg)的溶液搅拌一整夜。浓缩混合物除去二氧六环，混合物在饱和的碳酸氢钠水溶液和氯仿之间分配。所需的产物留在含水的级分中。非对映异构体混合物的水溶液经过反相液体色谱(Kromasil C8，4.6×250mm，梯度20％～50％乙腈溶于0.1％三氟乙酸水溶液，历时15分钟，1.5mL/分钟)得到呈无色固体的各非对映异构体。各异构体的质谱m/z＝539。
实施例5和64-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶5’-[甲氧基-(S)-丙氨酰基磷酸苯基酯]
以4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶为起始原料，按照实施例1和2相同方法制备实施例5和6，得到非对映异构体混合物，非对映异构体混合物使用实施例1和2的条件通过反相液相色谱拆分。各异构体的质谱m/z＝522。
1HNMR(CD3OD，500MHz)异构体Aδ 0.80(s，3H)，1.30(d，3H)，3.66(s，3H)和6.30(s，1H)；异构体Bδ 0.84(s，3H)，1.34(d，3H)，3.62(s，3H)和6.28(s，1H)。
实施例7和82-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮5’-[甲氧基-(S)-丙氨酰基磷酸苯基酯]
以2-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮为起始原料，按照制备实施例3和4的步骤制备实施例7和8，得到非对映异构体混合物。使用实施例3和4的条件通过反相液相色谱分离非对映异构体。各异构体的质谱m/z＝538。
1HNMR(CD3OD，500MHz)异构体Aδ 0.85(s，3H)，1.31(d，3H)，3.67(s，3H)和6.10(s，1H)；异构体Bδ 0.87(s，3H)，1.35(d，3H)，3.63(s，3H)和6.05(s，1H)。
实施例9和102，4-二氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶5’-[甲氧基-(S)-丙氨酰基磷酸苯基酯]
以2，4-二氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶为起始原料，按照实施例1和2相同方法制备实施例9和10，得到非对映异构体混合物，非对映异构体混合物使用实施例1和2的条件通过反相液相色谱拆分。各异构体的质谱(M+1)m/z＝537.
1HNMR(CD3OD，500MHz)异构体Aδ 0.89(s，3H)，1.32(d，3H)，3.64(s，3H)和6.12(s，1H)；异构体Bδ 0.91(s，3H)，135(d，3H)，3.62(s，3H)和6.10(s，1H)。
生物试验用于测量HCV NS5B聚合酶和HCV复制的抑制的试验描述如下。
下列试验用于测量本发明的化合物作为HCV NS5B RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的抑制剂的有效性。
A.HCV NS5B聚合酶的抑制试验该试验用于测量本发明的核苷氨基磷酸芳基酯在杂聚RNA模板上抑制丙型肝炎病毒(HCV)RNA依赖性RNA聚合酶(NS5B)酶活性的能力。
程序试验缓冲液条件(50μL-总量/反应)20mM Tris，pH 7.550μM EDTA5mM DTT2mM MgCl280mM KCl0.4U/μL RNAsin(Promega，原液为40单元/μL)0.75μg t500(500-nt RNA，其用来自丙型肝炎基因组的NS2/3区序列使用T7失控转录制得)1.6μg纯化丙型肝炎NS5B(21个氨基酸C端截短形成)1μM A、C、U、GTP(核苷三磷酸酯混合物)[α-32P]-GTP或[α-33P]-GTP化合物在多种浓度下测试，最多达100μM终浓度。
制备适量的包括酶和模板t500的反应缓冲剂。将本发明的核苷衍生物移液入96孔板的孔中。制备核苷三磷酸酯(NTP’s)混合物，包括放射性标记的GTP在内，并移液入96孔板的孔中。添加酶-模板反应溶液后开始反应，并在室温下进行1～2小时。
加入20μL 0.5 M EDTA，pH 8.0猝灭反应。包括空白反应(其中，在加入反应缓冲剂之前向NTP’s中加入猝灭溶液)。
50μL猝灭的反应物点到DE81滤盘(Whatman)上，并干燥30分钟。使用0.3 M甲酸铵，pH 8(150 mL/每次洗涤，直到1mL洗涤液的cpm小于100，通常为6次洗涤)洗涤过滤器。在5mL闪烁流体中使用闪烁计数器对过滤器进行计数。
根据下列等式计算抑制百分比抑制％＝[1-(测试反应中cpm-空白中cpm)/(对照反应中cpm-空白中cpm)]×100。
在HCV NS5B聚合酶试验中测试的代表性化合物显示IC50小于100微摩尔。
B.HCV RNA复制的抑制试验还在含亚基因组HCV复制子的培养肝瘤(HuH-7)细胞中评价本发明的化合物影响丙型肝炎病毒RNA复制的能力。试验详情描述如下。该复制子试验是在对V.Lohmann，F.Korner，J-O.Koch，U.Herian，L.Theilmann和R.Bartenschlager，“Replication of a Sub-genomicHepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line”，Science285110(1999)的试验进行了修进的条件下进行的。
方案该试验是原位核糖核酸酶保护，基于闪烁亲近的板试验(SPA)。将10000～40000个细胞置于96孔cytostar板(Amersham)中100～200μL含0.8mg/mL G418的培养基中。在0～18小时内向细胞加入各种浓度(最多达100μM溶于1％DMSO)的化合物，然后培养24～96小时。使细胞固定(20分钟，10％福尔马林)，可渗透(20分钟，0.25％ TritonX-100/PBS)并使用与RNA病毒基因组中所含的(+)链NS5B(或其他基因)互补的单链33p RNA探针杂交(整夜，50℃)。洗涤细胞，用RNAse处理，洗涤，加热至65℃，并在Top-Count中计数。复制的抑制读取为每分钟计数(cpm)的减少。
被选择含有亚基因组复制子的人类HuH-7肝瘤细胞携带一胞质RNA，其由HCV 5’非翻译区(NTR)、新霉素可选标记、EMCV IRES(内部核糖体进入部位)和HCV非结构蛋白NS3至NS5B、随后是3’NTR组成。
在复制试验中测试的代表性化合物显示EC50小于100微摩尔。
C.细胞内代谢试验还评价本发明的化合物进入人类肝瘤细胞系并在细胞内转化成相应的核苷5’-单-、二-和三磷酸酯的能力。
HuH-7和HBI10A两个细胞系用于本发明化合物的细胞内代谢研究。HuH-7是人类肝瘤细胞系，HBI10A表示衍生自携带HCV双顺反子复制子的HuH-7细胞的克隆系。HuH-7细胞置于含10％胎牛血清的完全Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中，HBI10A细胞置于含G418(0.8mg/mL)的同样培养基中，1.5×106细胞/60-mm皿，以至于在加入化合物时有80％的细胞汇合。氚化物以2μM在细胞培养基中培养3或23小时。收集细胞，用磷酸盐缓冲的盐水洗涤并计数。然后在70％甲醇、20mM EDTA、20mM EGTA中提取细胞，并离心。干燥该胞溶产物，在连接至在线β-RAM闪烁探测器(IN/US Systems)的Waters Millenium系统上使用离子对反相(C-18)HPLC分析放射性标记的核苷酸。HPLC流动相由(a)含2mM四丁铵氢氧化物的10mM磷酸钾和(b)含10mM磷酸钾和2mM四丁铵氢氧化物的50％甲醇组成。通过和标准比较保留时间进行峰鉴别。活性表示为在106HuH-7或HBI10A细胞中检测的核苷酸的皮摩尔数。
还在下述的反筛选中评价本发明的核苷氨基磷酸芳基酯的细胞毒性和抗病毒特异性。
C.反筛选在下列试验中测量本发明核苷氨基磷酸芳基酯抑制人类DNA聚合酶的能力。
a.人类DNA聚合酶α和β的抑制反应条件50μL反应体积反应缓冲剂组分20mM Tris-HCl，pH 7.5200μg/mL牛血清白蛋白100mM KCl2mM β-巯基乙醇10mM MgCl21.6μM dA，dG，dC，dTTPα-33P-dATP酶和模板0.05mg/mL缺口的(gapped)鱼精(fish sperm)DNA模板0.01 U/μL DNA聚合酶α或β缺口鱼精DNA模板的制备将5μL 1M MgCl2加入500μL活化的鱼精DNA(USB 70076)；升温至37℃，并加入30μL 65U/μL的核酸外切酶III(GibcoBRL18013-011)；
在37℃下培养5分钟；通过加热至65℃10分钟终止反应；取50～100μL等份装载到用20mM Tris-HCl，pH 7.5平衡的Bio-spin 6色谱柱(Bio-Rad 732-6002)上；通过在1000Xg下离心洗脱4分钟；收集洗脱物，并在260nm下测定吸光度用来测定浓度。
DNA模板稀释入适量的20mM Tris-HCl，pH 7.5，酶稀释入适量的20mM Tris-HCl(含2mM β-巯基乙醇)和100mM KCl。模板和酶移液入微量离心管或96孔板中。还分别使用酶稀释缓冲剂和测试化合物溶剂准备排除酶的空白反应和排除测试化合物的对照反应。使用含上面所列组分的反应缓冲剂启动反应。该反应在37℃下温育1小时。加入20μL 0.5 M EDTA猝灭反应。50μL猝灭的反应物点到WhatmanDE81滤盘上并风干。用150mL 0.3 M甲酸铵，pH 8，反复洗涤滤盘，直到1mL洗涤液＜100cpm。用150mL绝对乙醇洗涤盘两次，用150mL无水乙醚洗涤一次，干燥，在5mL闪烁流体中计数。
根据下列等式计算抑制百分比抑制％＝[1-(测试反应中cpm-空白中cpm)/(对照反应中cpm-空白中cpm)]×100。
b.人类DNA聚合酶γ的抑制测量对人类DNA聚合酶γ的抑制的效力，反应物包括0.5ng/μL酶；10μM dATP，dGTP，dCTP和TTP；2μCi/反应[α-33P]-dATP，和0.4μg/μL活化的鱼精DNA(从US Biochemical购得)于含20mM TrispH 8、2mM β-巯基乙醇、50mM KCl、10 mM MgCl2和0.1μg/μL BSA的缓冲剂中。该反应在37℃下进行1小时，通过加入0.5M EDTA至终浓度为142mM猝灭反应。通过阴离子交换滤器结合和闪烁计数量化产物的形成.在最高达50μM测试化合物。
根据下列等式计算抑制百分比抑制％＝[1-(测试反应中cpm-空白中cpm)/(对照反应中cpm-空白中cpm)]×100。
在下列试验中测量本发明的核苷氨基磷酸芳基酯抑制HIV感染性和HIV传播的能力。
c.HIV感染性试验使用表达CXCR4和CCR5二者(选择用于低背景β-半乳糖苷酶(β-gal)表达)的HeLa Magi细胞变体进行反应。细胞感染48小时，使用化学发光底物(Galactolight Plus，Tropix，Bedford，MA)量化由整合的HIV-1 LTR启动子产生的β-gal。在始于100μM连续两倍稀释液中进行抑制剂滴定(平行两份)；相对于对照感染计算在每个浓度时的抑制百分比。
d.HIV 传播的抑制本发明的化合物抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)传播的能力是通过美国专利US.5,413,999(May 9，1995)，和J.P.Vacca等，Proc.Natl.Acad.Sci.914096-4100(1994)中所描述的方法进行测量的，其全部内容在此引为参考。
还在如下试验中所述，在基于MTS-细胞的试验中，针对含亚基因组HCV复制子的培养肝瘤(HuH-7)细胞的细胞毒性对本发明的核苷氨基磷酸芳基酯进行了筛选。Huh-7细胞系如H.Nakabayashi等，CancerRes.，423858(1982)所述。
e.细胞毒性试验细胞培养物在适当的培养基中制得，对悬浮培养物，浓度约1.5×105细胞/mL，温育3天，对附着培养物，浓度在5.0×104细胞/mL，温育3天。99μL细胞培养物转入96孔组织培养物处理过的板中，加入1μL 100倍终浓度的溶于DMSO的测试化合物。该板在37℃下5％CO2中温育一指定时间段。温育期过后，向每个孔中加入20μL CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂(MTS)(Promega)，该板在37℃下5％CO2中再温育一段时间，最多3小时。振荡该板以充分混合，使用板读取器在490nm下读取吸光度。在加入MTS试剂前准备已知细胞数的悬浮培养细胞的标准曲线。代谢活性细胞还原MTS为甲。甲在490nm吸收。比较在490nm下有化合物存在的吸光度和没有加入任何化合物的细胞中的吸光度。
参阅Cory，A.H.等，“Use of an aqueous solubletetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture，”CancerCommun.3207(1991)。
采用下列试验测量本发明的化合物抗其他RNA依赖性RNA病毒的活性。
a.化合物体外抗鼻病毒的抗病毒活性测定(细胞病变效果抑制试验)试验条件如Sidwell和Huffman，“ Use of disposable microtissueculture plates for antiviral and interferon induction studies，”Appl.Microbiol.22797-801(1971)所述。
病毒如Sidwell和Huffman参考文献中所述，鼻病毒2型(RV-2)，HGP株，与KB细胞和培养基(0.1％NaHCO3，不含抗生素)一起使用。从ATCC获得的病毒，来自于患轻度急性发热性上呼吸道疾病的成年男性的咽喉拭子。
鼻病毒9型(RV-9)，211株，和鼻病毒14型(RV-14)，ToW株，也从Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。RV-9来自人类咽喉洗涤物，并且RV-14来自患上呼吸道疾病的年轻成人的咽喉拭子。这两种病毒与HeLa Ohio-1细胞(Dr.Fred Hayden，Univ.ofVA)(为人类颈上皮样癌细胞)-起使用。含5％胎牛血清(FBS)和0.1％NaHCO3的MEM(Eagle氏极限必需培养基)作为生长培养基。
所述三种病毒的抗病毒测试培养基是含5％FBS、0.1％NaHCO3、50μg庆大霉素/mL和10mM MgCl2的MEM。
用于试验本发明化合物的最大浓度为2000μg/mL。加入测试化合物后，大约5分钟后，向试验板中加入病毒。适当的对照也进行。试验板在37℃下，湿润空气和5％CO2中温育。通过在显微镜下观察形态变化，监测对照细胞的细胞毒性。病毒CPE数据和毒性对照数据的回归分析得出ED50(50％有效剂量)和CC50(50％细胞毒浓度)。通过如下公式计算选择指数(SI)SI＝CC50÷ED50。
b.化合物体外抗登革热、Banzi和黄热病的抗病毒活性的测定(CPE抑制试验)上述Sidwell和Huffman参考文献提供了试验的详情。
病毒从疾病控制中心获得登革热病毒2型，新几内亚株。两个非洲绿猴肾细胞系用于培养该病毒(Vero)，并进行抗病毒测试(MA-104)。由感染的小鼠脑制备的黄热病病毒，17D株，和从南非发热男孩的血清分离的Banzi病毒，H336株，均得自ATCC。Vero细胞被用于这两种病毒和试验。
细胞和培养基MA-104细胞(BioWhittaker，Inc.，Walkersville，MD)和Vero细胞(ATCC)用于培养基199(含5％FBS和0.1％NaHCO3，不含抗生素)。
用于登革热、黄热病和Banzi病毒的试验培养基是MEM，含2％FBS、0.18％NaHCO3、50μg庆大霉素/mL。
根据Sidwell和Huffman参考文献和类似上述鼻病毒抗病毒测试的方式进行本发明的化合物的抗病毒测试。对于每种所述病毒，在5～6天后达到足够的细胞病变效应(CPE)读数。
c.化合物在体外抗西尼罗河病毒的抗病毒活性的测定(CPE抑制试验)上述Sidwell和Huffman参考文献提供了试验的详情。西尼罗河病毒，来源于乌鸦脑的纽约分离物，从疾病控制中心获得。Vero细胞如上生长和使用。试验培养基是MEM，含1％FBS、0.1％NaHCO3、50μg庆大霉素/mL。
根据类似于用于鼻病毒活性试验的方式的Sidwell和Huffman方法进行本发明化合物的抗病毒测试。在5～6天后达到足够的细胞病变效应(CPE)读数。
d.化合物在体外抗鼻病毒、黄热病病毒、登革热病毒、Banzi病毒和西尼罗河病毒的抗病毒活性测定(中性红摄取试验)进行上述CPE抑制试验后，使用另外的细胞病变检测方法，其描述在“Microtiter Assay for InterferonMicrospectrophotometricQuantitation of Cytopathic Effect，”Appl.Environ.Microbiol.3135-38(1976)。使用Model EL309微量板读取器(Bio-Tek Instruments Inc.)读取试验板。如上计算ED50和CD50。
药物制剂的实例作为本发明化合物的口服组合物的一个具体实施方式
，将50mg实施例1或实施例2的化合物与充分细碎的乳糖配制，总量为580～590mg，并填充O号硬明胶胶囊中。
已经参照具体实施方式
描述并举例说明了本发明，但本领域技术人员应该理解，其中可进行各种变化、改进和替换而不脱离本发明的精神和范围。例如，由于针对HCV感染程度，被治病人的响应度不同，结果，除上文所述的优选剂量外的有效剂量可能是适用的。同样，观察到的药理学反应可能根据和依赖于所选特定活性化合物或是否存在药物载体以及制剂类型和使用的用药模式而变化，且遵循本发明目的和实践考虑了这样的预期变化或结果差异。因此，本发明仅仅被权利要求范围限制，且权利要求在合理情况下尽可能广泛地进行解释。
权利要求
1.结构式I的化合物 或其药学上可接受的盐，其中Y是CR9或N；Ar是未取代的或被1～3个独立选自下列组的取代基取代的苯基卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、氰基、硝基、氨基、羧基、三氟甲基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基羰基、C1-4烷基羰基氧基和C1-4烷基氧基羰基；R1选自氢、氟、叠氮基、氨基、羟基、C1-3烷氧基、巯基和C1-3烷硫基；R2和R3独立地选自氢、甲基、C1-16烷基羰基、C2-18烯基羰基、C1-10烷基氧基羰基、C3-6环烷基羰基和C3-6环烷基氧基羰基；R4是氢、卤素、甲基、叠氮基或氨基；R5和R6各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-4烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6环烷基氨基、二(C3-6环烷基)氨基、苄基氨基、二苄基氨基或C4-6杂环烷基，其中烷基、环烷基、苄基和杂环烷基是未取代的或被1～5个独立选自卤素、羟基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基团取代；R7是氢、C1-5烷基、苯基或苄基；其中烷基是未取代的或被一个选自羟基、甲氧基、氨基、羧基、氨基甲酰基、胍基、巯基、甲硫基、1H-咪唑基和1H-吲哚-3-基的取代基取代；其中苯基和苄基是未取代的或被1～2个独立选自卤素、羟基和甲氧基的取代基取代；R8是氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、苯基或苄基；其中烷基和环烷基是未取代的或被1～3个独立选自卤素、羟基、羧基、C1-4烷氧基的取代基取代；其中苯基和苄基是未取代的或被1～3个独立选自卤素、羟基、氰基、C1-4烷氧基和三氟甲基的取代基取代；R9选自氢、氟、氰基、C1-3烷基、NHCONH2、CONR10R10、CSNR10R10、COOR10、C(＝NH)NH2、羟基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基和二(C1-4烷基)氨基；每个R10独立表示氢或C1-6烷基；和R11是氢或甲基。
2.根据权利要求1的化合物，其中Y是N，R1是氢或氟，且R2和R3是氢。
3.根据权利要求2的化合物，其中R4是氢。
4.根据权利要求1的化合物，其中Y是CR9，R1是氢或氟，且R2和R3是氢。
5.根据权利要求4的化合物，其中R9是氢或氟。
6.根据权利要求5的化合物，其中R4是氢。
7.根据权利要求1的化合物，其中Ar是未取代的苯基。
8.根据权利要求1的化合物，其中R11是氢，R7选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、异丁基、2-甲基-1-丙基、羟基甲基、巯基甲基、羧基甲基、氨基甲酰基甲基、1-羟基乙基、2-羧基乙基、2-氨基甲酰基乙基、2-甲硫基乙基、4-氨基-1-丁基、3-氨基-1-丙基、3-胍基-1-丙基、1H-咪唑-4-基甲基、苯基、4-羟基苄基和1H-吲哚-3-基甲基。
9.根据权利要求8的化合物，其中R7是甲基或苄基。
10.根据权利要求1的化合物，其中R8是C1-6烷基、环己基、苯基或苄基。
11.根据权利要求10的化合物，其中R8是甲基。
12.根据权利要求1的化合物，其中Ar是未取代的苯基，R7是甲基或苄基，R8是甲基，R11是氢。
13.根据权利要求12的化合物，其选自 和 或其药学上可接受的盐。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
15.权利要求1的化合物在哺乳动物中治疗丙型肝炎病毒感染中的用途。
16.权利要求1的化合物在制造用于在哺乳动物中治疗丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供RNA依赖性RNA病毒聚合酶的抑制剂的前体——核苷氨基磷酸芳基酯。这些化合物是RNA依赖性RNA病毒复制抑制剂的前体，其用于治疗RNA依赖性RNA病毒感染。它们特别可用作丙型肝炎病毒(HCV)NS5B聚合酶的抑制剂的前体、HCV复制的抑制剂的前体、和/或治疗丙型肝炎感染。本发明还描述了包含单独或与其它抗RNA依赖性RNA病毒感染(特别是HCV感染)的活性剂联合的所述核苷氨基磷酸芳基酯的药物组合物。还公开了使用本发明的核苷氨基磷酸芳基酯抑制RNA依赖性RNA聚合酶、抑制RNA依赖性RNA病毒复制，和/或治疗RNA依赖性RNA病毒感染的方法。
文档编号C07H19/00GK1972696SQ200580021151
公开日2007年5月30日 申请日期2005年6月20日 优先权日2004年6月24日
发明者M·麦科斯, D·B·奥尔森 申请人:默克公司