专利名称：氨基化硅壳类纳米颗粒材料在核酸富集及纳米传感中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米生物学领域，尤其涉及纳米颗粒在生物医学领域的应用开发。
背景技术：
当代医学、生物学已深入到分子水平，对生物大分子或其片断进行高效的分离、富集、提取、转载等已经日益迫切地成为需要解决的技术问题，而利用纳米颗粒与生物大分子在尺寸上的对应完成上述生物/医学研究或实际操作，是一条重要的途径；但现有其他种类的纳米颗粒，或因理化性能不稳定而未被采用，或因制取困难、原料昂贵难以推广；而现有的二氧化硅纳米颗粒表面结构单一，在中性溶液中的动电位为负值，不具备所需的生化特性且难以修饰，在对生物活性分子及其片断进行分离、富集、提取、转载等操作中遇到困难，难以在分子生物/医学中得到推广应用。
针对现有技术的上述困境，本发明人采用了多种硅烷化试剂同步水解的工艺方法制备了一种氨基化硅壳类纳米颗粒材料，所述颗粒表面为二氧化硅网状分子壳层，分子壳层上交联有链端氨基，在中性溶液中的动电位值高于+10mv，等点电为pH9.6左右。
发明内容
为此，本发明的技术解决方案是氨基化硅壳类纳米颗粒材料在核酸富集及纳米传感中的应用；所述的应用是在氨基化硅壳类纳米颗粒材料的二氧化硅网状分子壳层内充实特殊生化、声、光、电、热、磁等性质的内核材料。
所述的应用是利用纳米颗粒在中性环境里的正值动电位从生物样品中分离、富集、提取、转载核酸。
所述的应用是使其表面的氨基直接或通过有机分子间接与生物大分子发生反应，使颗粒表面及生物大分子彼此进行修饰。
所述的应用是利用经修饰的纳米颗粒作为传感器，对单细胞的物化指数进行测量。
上述应用的优点在于所述的纳米颗粒，在酸性及中性介质中，未交联氨基的二氧化硅表面仍保持广泛的物化稳定性，而在其颗粒表面交联的氨基可发生质子化，有效地产生净正电，在pH中性的常温介质中，所述的氨基化硅壳纳米颗粒材料的动电位高达35mv，从而可轻易地与带负电荷的DNA、RNA等生物活性分子通过静电作用形成“纳米颗粒-DNA”、“纳米颗粒-RNA”等的复合物，与DNA、RNA等生物大分子的结合能力很强，并对结合的生物大分子有明显保护作用，为对DNA、RNA等进行分离、富集、提取、转载创造了条件；纳米颗粒表面的氨基具有反应活性，很容易直接、或通过具双功能团的化学交联剂间接与其他生物大分子活性基团反应，以实现彼此修饰，继而达到一定的生化操作或检测目的如构造生物纳米传感器等；纳米颗粒形成壳层结构，在壳层内部可充实以生化、声、光、电、热、磁等功能性的内核，而这些功能性内核在外部电磁场等的激发下，可实施特定功能如定向运动、激发单色光线、特定变化或反应等，从而高效地实现预期的生化操作或检测；本发明将纳米颗粒与分子生物/医学巧妙地结合，为分子生物/医学的突破性进展提供了全新的契机，具有广阔市场前景及社会效益。
现结合附图对本发明做出说明。
图1为本发明的氨基化硅壳纳米颗粒的结构示意图。
图2为本发明的纳米颗粒与其他纳米颗粒相比较的动电位与pH值的曲线图。
图3为DNaseI消化质粒DNA的凝胶电泳检测成像图。
图4为氨基化二氧化硅纳米颗粒-pIRGFP复合物转染的COS-7细胞在普通显微镜下的成像图。
图5为氨基化二氧化硅纳米颗粒-pIRGFP复合物转染的COS-7细胞在荧光显微镜下的成像图。
图6为氨基化二氧化硅纳米颗粒对荧光标记的DNA片断的富集实验的荧光光谱图。
如图1所示的氨基化硅壳类纳米颗粒材料，其颗粒表面为二氧化硅网状分子结构壳层2，在二氧化硅网状分子壳层2上交联有碳值为C3～C10的二元胺烷基；二氧化硅网状分子壳层2内含内核材料1包括二氧化硅、或特殊的生化、声、光、电、热、磁等功能性内核材料如染料、荧光物质、磁性物质、量子点、金属、药物等；进一步，壳层2上交联的链端氨基可以直接或间接地与生物大分子活性基团3(包括RNA、DNA、抗体、激素、生长因子、凝集素、酶分子等)反应，实现颗粒表面修饰；如图2所示动电位测量表明在pH中性的常温介质中，本发明的氨基化硅壳类纳米颗粒4(包括磁性的、荧光的等)表面的氨基可有效地产生净正电，且动电位高于35mv，仅当pH高于9.6左右的等电点时，氨基发生表观去质子化，动电位达到零值并趋向负值；相比较而言，四氧化三铁胶体纳米颗粒5、二氧化硅磁性纳米颗粒6、单纯的二氧化硅纳米颗粒7等的动电位早在pH远小于7的酸性环境中就已呈现负值，均比氨基化硅壳类纳米颗粒4的相关性能差很多。
具体实施例方式实施例一(制备方法)A)在环己烷/正己醇的油相中加入水与TritonX100并分散形成油包水微乳液，B)加生化、声、光、电、热、磁等功能性核材料入微乳液中，然后同时加正硅酸乙酯与N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基-三乙氧基硅烷入微乳液中，C)加催化剂氨水入微乳液中，反应24小时完成同步水解反应，生成如图1所示的氨基化硅壳纳米颗粒材料。
实施例二(纳米颗粒对荧光标记的DNA片断的富集)将氨基化的二氧化硅纳米颗粒与被荧光标记的非互补单链寡聚核苷酸片断(3′-CAT-AGT-GCT-CCG-GGA-TAC-GC-5′-TMAR)一起培育，通过荧光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测表明(参见图6的荧光光谱图)当纳米颗粒尚未投入时溶液中TMAR产生的荧光强度如曲线a所示出现最高强度；投入氨基化的二氧化硅纳米颗粒进入溶液中，荧光标记的DNA与投入的纳米颗粒作用并与溶液分离后，上清液中已没有荧光，说明DNA已全部结合在纳米颗粒表面，此时上清溶液中的荧光强度如曲线b所示强度趋于零值；改变离子强度或酸碱度等条件，纳米颗粒与DNA的结合又可以解离，解离后的TMAR回到溶液中产生的荧光强度如曲线c所示几乎恢复到初始的最高荧光强度。
实施例三(磁性纳米颗粒对动物组织总DNA的提取)在氨基化硅壳类纳米颗粒制备过程中，同步将磁性材料充实进入硅壳内，生成的氨基化硅壳磁性纳米颗粒具有超顺磁性，将这种纳米颗粒与裂解后的生物组织样品液(血液、骨髓、组织等)一起作用，带正电荷的磁性纳米颗粒与带负电荷的DNA或其片断以静电吸引方式形成“纳米颗粒-DNA”的复合物，在外部磁场的导向作用下，其提取程序和时间明显缩短；既不需要再对纳米颗粒进行修饰，也不需要常规方法中的酚-氯仿抽提；在琼脂糖凝胶电泳实验中，这种方法提取的总DNA与常规方法相比，DNA的特性不变。
实施例四(富集DNA的纳米颗粒作为新型非病毒性基因载体)将氨基化硅壳纳米颗粒与质粒DNA(绿色荧光蛋白表达载体pIRGFP)以一定质量比混合，琼脂糖凝胶电泳定性检测结果表明，随着质粒DNA量的增加，“纳米颗粒-质粒DNA”复合物的动电位逐渐减小，当加入DNA的量达到0.0972(w/w)为饱和，“纳米颗粒-质粒DNA”复合物达到等电点。然后在质粒DNA的标准样(参见图3中其的凝胶带(1))中，及“纳米颗粒-质粒DNA”复合物(参见图3中的凝胶带(3))中均加入等量的DNaseI，37℃时水浴消化1小时后，再进行凝胶电泳检测，结果发现，DNA的标准样中已无DNA(即图3中的凝胶带(2)完全消失)；而“纳米颗粒-质粒DNA”复合物在点样孔中依然有DNA存在(见图3中的凝胶带(4))，比较凝胶带(3)、(4)可见，“纳米颗粒-DNA”复合物的形成对DNA有明显保护作用，消化后的浓度比未经消化的复合物样品中只是稍低；由此进一步发展成非病毒性基因转染方法如用复合物将质粒DNA带入到美洲绿猴肾细胞(COS-7细胞系)内，转染后的细胞置于普通及荧光显微镜下，得到氨基化二氧化硅纳米颗粒-pIRGFP复合物转染的COS-7细胞在普通及荧光显微镜下的成像图4、5。成像图4、5表明纳米颗粒能有效转移pIRGFP质粒进入COS-7细胞，并能产生高水平GFP表达，转染率达60-70％。
实施例五(颗粒表面氨基间接反应修饰生化分子基团)在氨基化硅壳荧光纳米颗粒表面，使氨基与戊二醛(2％)室温反应1小时，将戊二醛连结在纳米颗粒表面，以固定某些生物大分子如葡萄糖氧化酶、链霉亲和素等。
实施例六(颗粒表面氨基直接反应修饰生化分子基团)在以联吡啶钌配合物Ru(BPY)3为内核的氨基化硅壳荧光纳米颗粒表面，可用异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明等进行直接修饰。
实施例七(荧光内核的纳米颗粒表面直接修饰用于pH传感器)在以联吡啶钌配合物Ru(BPY)3为内核的氨基化硅壳荧光纳米颗粒表面，用对pH敏感的荧光试剂异硫氰酸荧光素(FITC)直接进行修饰，使其对pH有明显的响应，从而用作为pH纳米传感器，通过细胞的内吞作用实现单细胞内pH的测量。
权利要求
1.氨基化硅壳类纳米颗粒材料在核酸富集及纳米传感中的应用；
2.如权利要求1所述的氨基化硅壳类纳米颗粒材料在核酸富集及纳米传感中的应用，其特征在于所述的应用是在氨基化硅壳类纳米颗粒材料的二氧化硅网状分子壳层内充实特殊生化、声、光、电、热、磁等性质的内核材料。
3.如权利要求1或2所述的氨基化硅壳类纳米颗粒材料在核酸富集及纳米传感中的应用，其特征在于所述的应用是利用纳米颗粒在中性环境里的正值动电位从生物样品中分离、富集、提取、转载核酸。
4.如权利要求1或2所述的氨基化硅壳类纳米颗粒材料在核酸富集及纳米传感中的应用，其特征在于所述的应用是使其表面的氨基直接或通过有机分子间接与生物大分子发生反应，使颗粒表面及生物大分子彼此进行修饰。
5.如权利要求4所述的氨基化硅壳类纳米颗粒材料在核酸富集及纳米传感中的应用，其特征在于所述的应用是利用经修饰的纳米颗粒作为传感器，对单细胞的物化指数进行测量。
全文摘要
氨基化硅壳类纳米颗粒材料在核酸富集及纳米传感中的应用包括:在氨基化硅壳类纳米颗粒材料的二氧化硅网状分子壳层内充实特殊生化、声、光、电、热、磁等性质的内核材料;利用纳米颗粒在中性环境里的正值动电位从生物样品中分离、富集、提取、转载核酸;使其表面的氨基直接或通过有机分子间接与生物大分子发生反应,使颗粒表面及生物大分子彼此进行修饰;利用经修饰的纳米颗粒作为传感器,对单细胞的物化指数进行测量。本应用发明将纳米颗粒与分子生物/医学巧妙地结合,为分子生物/医学的突破性进展提供了全新的契机,具有广阔市场前景及社会效益。
文档编号C07H21/00GK1385439SQ02114158
公开日2002年12月18日 申请日期2002年5月28日 优先权日2002年5月28日
发明者王柯敏, 何晓晓, 李杜, 谭蔚泓 申请人:湖南大学