可用于抑制chki的杂芳基脲衍生物的制作方法

专利名称：可用于抑制chki的杂芳基脲衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于抑制酶的化合物，该酶维持和修复遗传物质的完整性。更具体地，本发明涉及一系列芳基-和杂芳基-取代的脲化合物，制备这些化合物的方法以及它们例如在治疗病症和其它的以脱氧核糖核酸(DNA)复制、染色体分离或细胞分裂中的缺陷为特征的疾病中用作治疗剂的用途。

背景技术：
大量不同的疾病、病症和障碍(以下称为“适应症”)特征在于涉及异常增殖的细胞。用在此处时，“异常增殖的细胞”(或“异常的细胞增殖”)指脱离正常的、适当的或预料的进程的细胞增殖。例如，异常的细胞增殖包括其中DNA或其它细胞组分被损伤或缺陷时的不适当的细胞增殖。异常的细胞增殖还包括由不适当的高水平细胞分裂、不适当的低水平细胞死亡(例如，凋亡)或二者同时引起、介导或作为其结果的适应症。这类适应症可例如以细胞、细胞群或组织的单一或多重局部异常增殖为特征，包括癌症性(良性或恶性)和非病症性适应症。
根据定义，所有的癌症(良性和恶性)都涉及某种形式的异常细胞增殖。某些非癌症性适应症也涉及异常细胞增殖。涉及异常细胞增殖的非癌症性适应症的实例包括类风湿性关节炎、牛皮癣、白癜风、韦格内氏(Wegener′s)肉芽肿病以及全身性红斑狼疮。
一种治疗涉及异常增殖的细胞的适应症的方法包括使用DNA损伤剂。这些试剂被设计为通过中断诸如DNA代谢，DNA合成，DNA转录以及微管纺锤体形成的活细胞进程而杀死异常增殖的细胞。它们也可例如通过对DNA引入扰乱染色体结构完整性的损伤而起作用。DNA损伤剂以这种方式被设计和给予为试图对异常增殖的细胞诱导最大限度的损伤及随后的细胞死亡，而对正常的健康细胞仅有最小限度的损伤。
到目前为止，已经开发出大量不同的DNA损伤剂，包括化学疗法和放射疗法，其它的也正在开发过程中。遗憾的是，DNA损伤剂在治疗涉及异常细胞增殖的病症中的有效性还不能达到要求，尤其是在治疗癌症中。这类活性剂对异常增殖的细胞和健康细胞的选择性(有时称为治疗指数)通常是勉强够格的。
此外，所有细胞都具有感知和修复机制，其可以与DNA损伤剂以相反目的起作用。这类称为细胞周期检查点的感知机制帮助维持各种细胞复制阶段的次序并保证每一步都以高保真度完成(Hartwell等人，Science，246629-634，(1989)；Weinert等人，Genes Dev.，8652，(1994))。当细胞检测到DNA损伤时，包括检测到由DNA损伤剂有意诱导的DNA损伤时，某些信号通路活化细胞周期检查点，细胞复制周期暂时停止(“停滞”)。这种停滞使得异常增殖的细胞有时间修复它们的DNA，通常达到足以使受影响的细胞继续存活和增殖的程度。在异常增殖细胞情况下，这种修复是不所需的，因为其可能破坏足以诱导DNA损伤以杀死异常增殖细胞的努力。
例如，称为GEMZARTM的化疗剂(吉西他滨，或2’，2’-二氟-2’-脱氧胞苷)通过在合成过程中将其自身结合进DNA而损伤DNA。留下的未修复的受损DNA通常导致不能存活。但是，在许多靶向细胞中，细胞周期检查点检查不适当产生的(或损伤的)DNA。活化的细胞周期检查点触发细胞周期停滞一段时间，该段时间足以使得受损DNA被修复，这是异常增殖的细胞理论上抵抗诸如化疗剂的DNA损伤剂，辐射和其它疗法的细胞杀伤效果的一种方式。
其它DNA损伤剂引起肿瘤细胞在S期停滞。肿瘤细胞已被发现在化疗剂被施用时简单地通过停滞在S期而抵抗某些化疗剂，然后当药物一被去除时，DNA损伤就被修复，细胞周期停滞停止，细胞进行细胞周期的剩余部分(Shi等人，Cancer Res.611065-72，2001)。其它治疗剂引起细胞周期停滞在其它检查点，包括G1和G2。因此，预期抑制各种DNA损伤检查点有助于防止细胞修复治疗上诱导的DNA损伤，使靶向细胞对DNA损伤剂敏感。继而，这种致敏作用被预期能增加这些疗法的治疗指数。
遍及所有真核物种，细胞周期在结构和功能上在其基本过程和调节方式方面是相同的，有丝分裂(体细胞)细胞周期由以下四个阶段组成G1(间隙)期、S(合成)期、G2(间隙)期和M(有丝分裂)期。Gl、S和G2期统称为细胞周期的间期。在Gl期，细胞的生物合成活性以高速率进行。当DNA合成开始时S期开始，当细胞核的DNA含量被复制并形成两套相同的染色体时S期终止。
然后，细胞进入G2期，其持续到有丝分裂开始。在有丝分裂中，染色体配对并分离，两个新的细胞核形成并发生胞质分裂，其中细胞分裂为两子细胞，每一个接受含有两套染色体之一的核。胞质分裂使M期终止并标志着下一细胞周期的间期的开始。细胞周期事件进行的顺序为严格调节的，以至于一个细胞周期事件的起始依赖于之前的细胞周期的完成。这使得从一代体细胞至下一代在遗传物质的复制和分离中的保真度成为可能。
据报道，细胞周期检查点包括至少三种不同种类的多肽，它们相继对细胞周期信号或染色体机制中的缺陷作出反应(Carr，Science，271314-315，(1996))。第一类为检测或感知DNA损伤或细胞周期中异常的一族蛋白质。这些感受器包括共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(Atm)和共济失调-毛细血管扩张Rad相关蛋白(Atr)。第二类多肽放大和传递由检测器检测的信号，例如Rad53(Alen等人，Genes Dev.82416-2488，(1994))和Chkl。第三类多肽包括介导例如有丝分裂和凋亡的停滞的细胞应答的细胞周期效应子，例如p53。
目前对细胞周期检查点的功能的了解大多数源于对肿瘤衍生细胞系的研究，在很多情况下，肿瘤细胞已失去关键的细胞周期检查点(Hartwell等人，Science 266182128，1994)。据报道，细胞向肿瘤性状态的演变中的关键步骤是获得使细胞周期检查点途径失活的突变，如那些涉及p53的突变(Weinberg，Cell 81323-330，1995；Levine，Cell 883234331，1997)。失去这些细胞周期检查点导致肿瘤细胞不顾DNA损伤而复制。
具有完整细胞周期检查点的非肿瘤性组织通常避免了暂时的单一检查点通路中断。但是，肿瘤细胞在控制细胞周期进程的通路中具有缺陷，以至于对另外的检查点的扰乱使它们对DNA损伤剂尤其敏感，例如，含有p53突变的肿瘤细胞在G1 DNA损伤检查点和维持G2 DNA损伤检查点两方面(Bunz等人，Science，2821497 501，1998)有缺陷。靶向G2检查点或S期检查点起始的检查点的抑制剂预期可进一步削弱这些肿瘤细胞修复DNA损伤的能力，因此是增强放射和全身化疗的治疗指数的候选者(Gesner，Abstract at SRI ConferenceProtein Phosphorylation and DrugDiscovery World Summit，March 2003)。
在DNA损伤或DNA复制的任何障碍物存在下，检查点蛋白Atm和Atr发动导致细胞周期停滞的信号转导通路。Atm已被证实在应答电离辐射(IR)的DNA损伤检查点中起作用。Atr被引起双链DNA断裂、单链DNA断裂的物质和阻断DNA辐射的物质刺激。
Chkl为蛋白激酶，其位于DNA损伤检查点信号转导通路中Atm和/或Atr的下游(Sanchez等人，Science，2771497-1501，1997；U.S.专利No.6,218,109)。在哺乳动物细胞中，Chkl应答包括电离辐射(1R)、紫外(UV)光和羟基脲在内的引起DNA损伤的物质而磷酸化(Sanchez等人，同上；Lui等人，Genes Dev.，141448-59，2000)。哺乳动物细胞中活化Chkl的该磷酸化依赖于Atm(Chen等人，Oncogene，18249-56，1999)和Atr(Lui等人，同上)。此外，Chkl被证实磷酸化wee1(O′Connell等人，EMBO J.，16545-554，1997)和Pdsl(Sanchez等人，Science，2861166-1171，1999)，已知它们的基因产物在细胞周期调控中很重要。
这些研究证实哺乳动物Chkl在导致在S期停滞的Atm依赖的DNA损伤检查点中起作用。Chkl在S期哺乳动物细胞中的作用最近被阐明(Feiioo等人，J.Cell Biol.，154913-923，2001；Zhao等人，PNAS U.S.A.，9914795-800，2002；Xiao等人，J Biol Chem.，278(24)21767-21773，2003；Sorensen等人，Cancer Cell，3(3)247-58，2003)，强调了Chkl在监视DNA合成的完整性方面的作用。Chk1通过使调节cyclinA/cdk2活性的Cdc25A磷酸化而引起S期停滞(Xiao等人，supra and Sorenseneta.，前述)。Chkl还通过使Cdc25C磷酸化并失活而引起G2停滞，其中Cdc25C为双特异性磷酸酶，当细胞从G2进入有丝分裂时其通常使cyclin-B/cdc2(也称为Cdkl)去磷酸化(Fernery等人，Science，2771495-7，1997；Sanchez等人，supra；Matsuoka等人，Science，282893-1897，1998；和Blasina等人，Curr.Biol.，91-10，1999)。在两种情况下，对Cdk活性的调节诱导细胞周期停滞，以防止存在DNA损伤或未复制的DNA细胞进入有丝分裂。
其它种类的细胞周期检查点抑制剂在G1或G2/M期起作用。UCN-01，或7-羟基十字孢碱，起初作为非特异性激酶抑制剂被分离，主要作用于蛋白激酶C，但其最近被发现抑制Chkl的活性并解除G2细胞周期检查点(Shi等人，前述)。因为UCN-01为非选择性Chkl抑制剂，因此其在高剂量时对细胞有毒性。在低剂量时，它非特异性地抑制很多细胞激酶并且还抑制Gl检查点(Tenzer等人，Curr，Med Chem.Anti-Cancer Agents，335-46，2003)。
UCN-01已与其它癌症疗法联合使用，例如放射、抗癌剂喜树碱(Tenzer等人，前述)以及吉西他滨(Shi等人，前述)，取得有限的成功。此外，UCN-01也已被用于加强在成胶质细胞瘤细胞中替莫唑胺(TMZ)诱导的DNA错配修复(MMR)的效果(Hirose等人，Cancer Res.，615843-5849，2001)。在临床上，UCN-01并非如所期待的为有效的化疗剂，可能是由于治疗方案的失败和缺乏对具体关键分子靶标的鉴定而导致(Grant等人，Drug ResistanceUpdates，615-26，2003)。所以，Mack等人报道了UCN-01在培养的非小细胞肺病细胞系中对顺铂的细胞周期依赖性增强，但是未特异性地鉴定出UCN-01靶向的关键性细胞周期检查点。(Mack等人，Cancer ChemotherPharmacol.，51(4)337-348，2003)。
存在几种其它的用于使肿瘤细胞对影响细胞周期的化疗剂敏感的策略。例如，施用2-氨基嘌呤解除了多细胞周期检查点机制，例如含羞草碱诱导的G1停滞或羟基脲诱导的S期停滞，使细胞进入并经过有丝分裂(Andreassen等人，Proc Natl Acad Sci USA.，862272-2276，1992)。咖啡因，一种甲基黄嘌呤，已被用于增强诸如顺铂和电离辐射的DNA损伤剂的细胞毒性，其介导穿过G2检查点的发展，并由此诱导细胞死亡。(Bracey等人，Clin.Cancer Res.，31371-1381，1997)。但是，用来实现细胞周期解除的咖啡固的剂量超过了临床上可接受的水平，不是可行的治疗选择。另外，Chkl激酶的反义核酸已被用于增加对拓扑异构酶抑制剂BNPl350的敏感性(Yin等人，Biochem。Biophys.Res.Commun.，295435-44，2002)，但是也表现出通常与反义治疗和基因疗法相关的问题。
Chkl抑制剂已经公开，包括在美国专利申请No.10/087,715和美国临时专利申请60/583,080、60/585,292和60/602,968描述的芳基-和杂芳基取代的脲化合物；在美国专利公开No.2004/0014765、美国专利公开No.US2003/199511、美国专利公开No.2004/0014765和WO03/101444描述的双芳基脲化合物；在Fan等人，Cancer Res.551649-54，1995中描述的甲基黄嘌呤及相关化合物；在WO03/029241和WO03/028731中描述的脲基噻吩类；描述于WO 03/028724的N-吡咯并吡啶基酰胺类；描述于WO01/57206和美国专利No.6,211,164的反义Chkl寡核苷酸；描述于WO00/16781的Chkl受体拮抗剂；WO 03/037886杂芳族酰胺衍生物；描述于WO 03/029242的氨基噻吩类；描述于WO 03/004488的(吲唑基)苯并咪唑类；描述于美国专利No.20040092535和WO04/018418的苯并咪唑喹啉酮类；描述于WO 02/16326的杂环-羟基亚氨基-芴类；含有双歧藻属(scytoneman)骨架的衍生物，例如在美国专利No.6,495,586描述的scytonemin；描述于WO 01/53274的杂芳基苯甲酰胺类；描述于WO 01/53268的吲唑化合物；由Tenzer等人(前述)描述的吲哚咔唑类；描述于WO02/070515色烷衍生物；paullones(Schultz等人，J.Med.Chem.Vol2909-2919，1999)；描述于WO 99/17769的茚并吡唑类；Sedlacek等人于Int J.Oncol.，91143-1168，1996描述的黄酮类；丝氨酸苏氨酸激酶的肽环的肽衍生物(WO 98/53050)；羟吲哚类(WO03/051838)；描述于WO2004/063198的二氮杂并吲哚酮类(diazepinoindolones)；描述于WO2004/048343的嘧啶类；描述于WO2004/014876的脲化合物；和描述于WO2003/091255的吡咯咔唑类(pyrrolocarbazoles)、苯并呋喃并异吲哚类(benzofuroisoindoles)和氮杂环戊芴类(azacyclopentafluorenes)。
但是，在本领域仍亟需有效的和选择性的Chkl抑制剂，本发明致力于该需要以及其它需要。
发明概述 本发明涉及在生物化学和/或基于细胞的试验方面显示出出乎意料性能的检测点激酶Chkl的强效和选择性抑制剂。本发明的Chkl抑制剂可用于治疗涉及异常细胞增殖的适应症，以及可在涉及DNA损伤或DNA复制中缺陷的适应症的治疗中作为化学增敏和放射增敏剂。
因此，本发明的一个方面是提供结构式(I)化合物。这些化合物可用于抑制Chkl的方法中，该方法包括将有效量的结构式(I)的化合物给需要其的个体施用的步骤。
式(I)化合物的结构式为
其中R1为卤素、C1-3烷基、CN或CF3； R2为氢、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、卤素、或N(Rb)2，其中Rb独立地为氢或C1-3烷基； R3为6-或7-元饱和杂环，其中包含一个环状N-Ra基团或者第二个环状N-Ra基团、环氧或环硫，其中的Ra独立地为氢、C1-3烷基、CH2CN或CH2CH2CN，而且其中的R3任选被氧代(＝O)取代； R4为氢、C1-3烷基、OC1-3烷基、SC1-3烷基、N(Rb)2、NRbC(＝O)C1-3烷基、或5-或6-元饱和杂环，其中包含一个N-Ra基团和任选被1-3个C1-3烷基基团取代的环； 或R2和R4与和其连接的碳一起形成5-～7-元饱和碳环状环； R5为氢或卤素， 条件是R2和R4中至少一个不是氢，而且当R5为卤素时，R2或R4为氢， 或其可药用盐、前药或溶剂合物。
本发明的另一方面是提供结构式(II)化合物，这些化合物可用于抑制Chkl的方法中。

其中R1为卤素、C1-3烷基、CN或CF3； R2为氢、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、卤素、或N(Rb)2，其中Rb独立地为氢或C1-3烷基； R3为6-或7-元饱和杂环，其中包含一个环状N-Ra基团或者第二个环状N-Ra基团、环氧或环硫，其中的Ra独立地为氢、C1-3烷基或CH2CN，而且其中的R3任选被氧代(＝O)取代； R4为氢、C1-3烷基、OC1-3烷基或卤素； 或R2和R4与和其连接的碳一起形成5-～7-元饱和碳环状环； 条件是R2和R4中至少一个不是氢， 或其可药用盐、前药或溶剂合物。
本发明的另一方面是提供包含一种或多种结构式(I)或(II)化合物的药物组合物，以及该组合物用于治疗适应症的用途，其中体内或离体状态对Chk1的抑制作用有助于治疗或有益于研究或诊断。
本发明的另一方面是提供致敏由于适应症而接受化疗或放疗的个体中的细胞的方法，包括将结构式(I)或(II)化合物与化疗剂和放疗剂之一或两者联合给个体施用。通过该方法治疗的非限制性适应症为癌症。
本发明的另一方面是提供抑制或预防异常细胞增殖的方法。在一个实施方案中，该方法包括将含有异常增殖细胞的细胞群与至少一种一定量的Chk1活化剂接触一段时间，所述量和时间足以使异常增殖细胞间的细胞周期停滞基本同步化。在细胞群中获得细胞周期停滞的基本同步后，使细胞群与足以基本上解除细胞周期停滞的至少一种一定量的Chk1抑制剂接触一段时间。
本发明的另一方面是提供一种人类药用制成品，其包括 (a)包含结构式(I)或(II)化合物的药物组合物； (b)包装说明书，规定该组合物用于治疗包括异常细胞增殖在内的适应症，和 (c)容器。
本发明的另一方面是提供 (a)包含结构式(I)或(II)化合物的药物组合物； (b)包装说明书，规定该组合物适合在治疗与DNA损害或DNA复制有关的适应症中用作化学增敏剂或放射增敏剂； (c)容器。
以下的详细说明将会使本发明的方方面面变得显而易见。
发明详述 本发明化合物具有结构式(I)
其中R1为卤素、C1-3烷基、CN或CF3； R2为氢、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、卤素、或N(Rb)2，其中Rb独立地为氢或C1-3烷基； R3为6-或7-元饱和杂环，其包含一个环状N-Ra基团或者第二个环状N-Ra基团、环氧或环硫，其中的Ra独立地为氢、C1-3烷基、CH2CN或CH2CH2CN，而且其中的R3任选被氧代(＝O)取代； R4为氢、C1-3烷基、OC1-3烷基、SC1-3烷基、N(Rb)2、NRbC(＝O)C1-3烷基、或5-或6-元饱和杂环，其包含一个N-Ra基团和任选被1-3个C1-3烷基基团取代的环； 或R2和R4与和其连接的碳一起形成5-～7-元饱和碳环状环； R5为氢或卤素， 条件是R2和R4中至少一个不是氢，而且当R5为卤素时，R2或R4为氢， 或其可药用盐、前药或溶剂合物。
在一种优选实施方案中，所述化合物具有结构式(II)
其中R1为卤素、C1-3烷基、CN或CF3； R2为氢、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、卤素、或N(Rb)2，其中Rb独立地为氢或C1-3烷基； R3为6-或7-元饱和杂环，其包含一个环状N-Ra基团或者第二个环状N-Ra基团、环氧或环硫，其中的Ra独立地为氢、C1-3烷基或CH2CN，而且其中的R3任选被氧代(＝O)取代； R4为氢、C1-3烷基、OC1-3烷基或卤素； 或R2和R4与和其连接的碳一起形成5-～7-元饱和碳环状环； 条件是R2和R4中至少一个不是氢， 或其可药用盐、前药或溶剂合物。
在一种式(I)和(II)化合物的优选实施方案中，R1为氯、甲基、CN或CF3。在另一种优选实施方案中，R2为氢、甲基、乙基、氯、溴、二甲基氨基、氰基或甲氧基。在更优选实施方案中，R2不是氢。
在式(I)和(II)化合物的其它优选实施方案中，R4为甲基、氯、氟、甲氧基、异丙氧基、二甲基氨基、-SCH3、-NHC(＝O)CH(CH3)2、-NHC(＝O)-CH3、吡咯烷基或3，3-二甲基-吡咯烷基。在更优选的实施方案中，R4为甲基、氯或甲氧基。在另一种进一步优选的实施方案中，R2和R4与其连接的碳一起形成5-元或6-元饱和碳环状环。
在进一步优选的式(I)和(II)化合物的实施方案中，当R5为卤素时R4为氢。在优选实施方案中，R5为氟。在更优选的实施方案中，R5为氢。
在式(I)和(II)的一种实施方案中，当R1为氰基时，R2为氢且R4优选为氯或甲基。在另一种实施方案中，R5为氟、R4为氢且R2为甲基、氯或溴。
式(I)和(II)中R3基团的优选实例包括，但不限于

正如本文所用，术语″C1-3烷基″包括直链和支链的包含1-3个碳原子的烷基基团，即，甲基、乙基、正丙基和异丙基。
″卤素″在本文定义为氟、氯、溴和碘。
″氰基″定义为-CN。
″三氟甲基″定义为表示-CF3。
缩写″Me″为甲基，即-CH3。
活化细胞周期检测点的DNA损伤剂在本文统称为“检测点活化剂”。活化被称为″Chk1″(发音为″check-one″)的检测点的DNA损伤剂在本文称为“Chk1活化剂”。同样，这些检测点的抑制剂在本文分别称为“检测点抑制剂”和″Chk1抑制剂″。
正如本文所用，Chk1抑制剂是能够至少部分地解除Chk1蛋白的细胞周期检测点活性的任何化合物。当充分克服了细胞的检测点机制，使得细胞从其停止的细胞周期阶段进入细胞周期的下一阶段，或使得细胞直接进入细胞死亡时，则实现细胞周期检测点的解除。细胞周期检测点的解除使得细胞将损伤或缺陷带入后续细胞周期阶段，由此诱导或促进细胞死亡。包括细胞凋亡和有丝分裂灾难在内的任何机制都可引起细胞死亡。本发明化合物是Chk1抑制剂。
Chk1活化剂包括任何已知或之后发现的活性剂，其能够活化Chk1激酶活性，并由此诱导至少部分细胞周期停滞。Chk1活化剂包括能够使细胞周期停滞在细胞周期任何阶段的活性剂，该阶段在这里可称为活化剂的“靶阶段”。靶阶段包括有丝分裂之外的任何细胞周期，即G1、S和G2期。可用于本发明的Chk1活化剂包括DNA损伤剂，例如化疗剂和/或放射物。放射性Chk1活化剂包括但不限于电离辐射。电离辐射包括能够产生相互作用的离子对的电磁或粒子辐射。电离辐射包括x和γ射线，α和β粒子，中子和带电核子。辐射包括紫外线、可见光、红外光辐射、微波辐射及其组合。诸如实施例8所述的试验可用于确定活性剂是否是Chk1活化剂。
″抑制异常细胞增殖″指延缓或消除该异常增殖细胞的增殖的速率。该抑制作用导致复制速率的降低或细胞死亡率的增加，或二者皆有。细胞死亡可由包括细胞凋亡或有丝分裂灾难在内的任何机制引起。
″防止异常细胞增殖″指在异常细胞增殖发生之前对其抑制或抑制其复发。
″在体内″指在活体内。在本文中，活性剂可治疗性地用于患者体内，以延缓或消除异常复制细胞的增殖。该活性剂也可用作预防药物以防止异常细胞增殖的发生或复发或者与其有关的症状出现。
″离体″指活体外。离体细胞群的实例包括细胞培养和诸如取自人体或动物的液体或组织样品的生物样品。该样品可通过本领域公知的方法获得。示例性的生物液体样品包括血液、脑脊髓液、尿、唾液。示例性的组织样本包括肿瘤和其活组织切片。在本文中，本化合物可用于治疗和实验等大量应用中。
本文所用的术语″辐射增敏剂″指对人或其它动物以治疗有效量施用以增加细胞对电磁辐射的敏感度和/或改进可用电磁辐射治疗的疾病的治疗的化合物。
本文所用的术语″辐射″包括但不限于，波长在10-20-100m的辐射。
术语″容器″指适合贮存、运输、分配和/或搬运药物制品的贮器和密闭物。
术语″包装说明书″指伴随产品的信息，其中就如何施用本产品以及医师、药剂师和患者针对该产品作出决定需要的安全性和有效性数据作出说明。包装说明书通常被认作药物产品的“标签”。
本发明包括结构式(I)或(II)化合物的所有可能的立体异构体和几何异构体。本发明不仅包括外消旋化合物，还包括选光活性异构体。当结构式(I)或(II)化合物需要作为单一对映体时，其可由终产物的拆分获得，或从异构上的纯起始原料或使用手性助剂通过立体专一性合成获得，例如参见Z.Ma等人，TetrahedronAsymmetry，8(6)，883-888(1997)。终产物、中间体或者起始材料的拆分可通过本领域任何已知的方法完成。另外，在结构式(I)或(II)化合物可能存在互变异构体时，本发明旨在包括该化合物所有的互变异构形式。如此后阐述的，特定的立体异构体在与化疗或放疗治疗结合时可显示出不寻常的抑制Chk1的能力。
结构式(I)或(II)化合物的前药也可用作本发明方法中的化合物。已充分证实前药方法已成功地用于临时(例如生物可逆地)改变化合物的物理化学特性，其中化合物衍生为适于配制和/或施用的形式，继而在体内作为药物释放(参见H.Bundgaard，Ed.，″Design of Prodrugs，″Elsevier，Amsterdam，(1985)；R.B.Silverman，″The Organic Chemistry of DrugDesign and Drug Action，″Academic Press，San Diego，chapter 8，(1992)；K.M.Hillgren等人，Med.Res.Rev.，15，83(1995))。
本发明化合物可包含一个或多个官能团。如果需要或必要的话，官能团可以被修饰以提供前药。合适的前药包括例如酸衍生物，例如酰胺和酯。本领域技术人员也会认识到N-氧化物也可用作前药。
本发明化合物可以以盐的形式存在。在本发明方法中，优选本发明化合物的可药用盐。本文所用的术语″可药用盐″指结构式(I)或(II)化合物的盐或两性离子形式。式(I)或(II)化合物的盐可以在化合物最终分离和纯化中制备或者单独地通过化合物与具有合适阳离子的化合物反应制备。合适的药物可接受阳离子包括碱金属(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)阳离子。另外，包含碱性中心的结构式(I)或(II)化合物的可药用盐是与药物可接受酸形成的酸加成盐。可用于形成可药用盐的酸的实例包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，有机酸如草酸、马来酸、琥珀酸、丙二酸和柠檬酸。本发明化合物的盐的非限定实例包括，但不限于，盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、2-羟基乙磺酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐(digluconate)、磷酸甘油酯、半硫酸盐(hemisulfate)，庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、均三甲苯磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐、癸酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。另外，存在于本发明化合物中的可利用氨基可以用下述物质季铵化甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物，和二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯，癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物，以及苄基和苯乙基溴化物。根据前述，本文出现的关于本发明化合物的任何含义都旨在包括结构式(I)或(II)化合物及其可药用盐、溶剂合物或前药。
本发明化合物的非限定实例为












1-[5-甲基-2-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-372.4)
1-[5-氯-2-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-392.4)
1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[2-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯基]-脲(LRMS(ES，正)m/e-396.4)
1-[5-氯-2-R-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-391.3)
1-[5-溴-2-R-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-438.0)
1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-R-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-脲(LRMS(ES，正)m/e-383.0)
1-[5-氯-2-(4-甲基-[1，4]氧杂氮杂环庚烷(oxazepan)-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-406.0)
1-[5-氯-2-S-(5-氧代-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-392.2)
N-[2-氯-4-[3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-5-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-乙酰胺(LRMS(ES，正)m/e-435.0)
1-[5-氯-3-氟-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-396.3)
1-[5-甲氧基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-374.3)
1-[5-甲氧基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-358.3)
1-[4-氯-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-378.3)
1-[5-氯-4-氟-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-396.1)
1-[5-氰基-4-甲基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(LRMS(ES，正)m/e-383.3)
1-[5-氯-4-二甲基氨基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-421.2)
N-[2-氯-4-[3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-5-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-异丁酰胺 (LRMS(ES，正)m/e-463.2)
1-(5-甲基-吡嗪-2-基)-3-[6-(S-吗啉-2-基甲氧基)-茚满-5-基]-脲(LRMS(ES，正)m/e-384.3)
1-[5-氯-2-(4-氰基甲基-硫代吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-433.0)
1-{5-氯-2-[4-(2-氰基-乙基)-S-吗啉-2-基甲氧基]-苯基}-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-431.0)
1-[5-氯-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-4-吡咯烷-1-基-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 (LRMS(ES，正)m/e-447.2)


或其盐、溶剂合物(例如水合物)或其前药。
本发明化合物可在治疗上作为纯化学品施用，但是所述化合物优选以药物组合物或制剂形式施用。因此，本发明提供包含式(I)或(II)化合物及其药物可接受的稀释剂或载体的药物组合物。还提供一种制备药物组合物的方法，其中包括将式(I)或(II)与其药物可接受稀释剂或载体混合。
因此，本发明进一步提供药物制剂，其包含结构式(I)或(II)化合物及其可药用盐、前药或溶剂合物，连同一种或多种药物可接受的载体，以及任选的其它治疗性和/或预防性成分。载体为“可接受的”意味着与制剂的其它成分相容并对其接受者无害。
本发明化合物显示出出人意料的高效能。效能一般以达到特定效果需要的化合物浓度表示。效能越高，履行期望功能需要的化合物越少。体外效能一般用术语IC50值表示并且利用剂量-响应试验测量。IC50值可通过使灵敏的检测系统与一定浓度范围的所关心化合物接触，该浓度范围包括没有观察到或仅观察到最低限度作用时的浓度，观察到部分作用时的较高浓度至观察到最大作用时的饱和浓度。理论上，这种对抑制剂化合物的剂量效应作用的检测可以用将抑制度表示为浓度的函数的S曲线来描述。理论上，该曲线也经过使检测点酶活性足以降低至该检测点中酶活性最小值和最大值差值的50％的水平的点。该浓度定义为50％抑制的抑制浓度或IC50值。
IC50值可利用传统生物化学(非细胞)检测技术或本领域普通技术人员公知的基于细胞的检测技术确定。这种检测的实例在下述实施例1中给出。
优选地，IC50值通过进行至少两次相关检测获得，其中IC50值以获得的各值的平均值(算术平均或″平均″)表示。更优选地，所述检测重复3-10(或更多)次，IC50值以所获得值的平均值表示。最优选地，所述检测进行多次，足以利用本领域普通技术人员公知的统计方法产生统计上可靠的平均IC50值。
本发明化合物显示出出人意料的低IC50值，相当于出人意料高的体内效能。当依照下述实施例进行检测时，本发明化合物显示出的IC50值低于约200nM，在某些实施方案中低于约150nM，在其它实施方案中低于约100nM，，在有些实施方案中低于约50nM，在有些实施方案中低于约10nM，在有些实施方案中低于约5nM。在其它实施方案中，本发明化合物显示出的IC50值为约0.1nM-约5nM。
本发明化合物在其它蛋白激酶上显示出抑制Chk1的选择性。选择性在降低副作用和/或提高治疗指数方面是有利的。
″选择性″在这里定义为“倍选择性”。通常，正如本文所用，倍选择性为测试化合物对对比酶的IC50除以对比剂酶的IC50。具体地，本文使用的Chk1抑制剂的倍选择性为Chk1抑制剂(测试化合物)对Chk1(比较酶)的IC50除以对比剂酶的IC50。可作为对比测量本发明化合物的对比剂酶包括至少下列蛋白激酶Cdc2、Chk2、CTAK、EphA1、EphA2、Erk1、FGFR1、FGFR4、IR、JNK1、c-Kit、p38alpha、p38beta、p38delta、Ros、Rse、Rsk2、TrkA、TrkB、蛋白激酶A、蛋白激酶C、pp60v-src、蛋白激酶B/Akt-1、p38MapK、p70S6K、钙/钙调素依赖性激酶II和ab1酪氨酸激酶。
确定测试化合物对对比剂酶IC50值的检测在实施例2中描述，而且是本领域普通技术人员公知的。本发明化合物对上述测试蛋白激酶显示出至少20倍的选择性。在某些实施方案中，本发明Chk1抑制剂相对于上述测试蛋白激酶对Chk1的抑制显示出至少约50倍选择性，在其它实施方案中至少约75倍选择性，在其它实施方案中至少约100倍选择性。
本发明化合物在基于细胞的检测中显示出出人意料的高效能。为了测量Chk1抑制剂基于细胞的效能开发了一种检测，该检测能够测量在涉及异常增殖细胞的基于细胞的模型中提高DNA损伤剂抑制生长作用需要的Chk1抑制剂浓度。这种基于细胞的效能的测量在此用″ECTFS″值表示，其中″ECTFS″为Chk1抑制剂产生相对DNA损伤剂的抑制生长效果两倍的异常增殖细胞群敏感性的有效浓度。ECTFS按降DNA损伤剂抑制90％细胞生长需要的量减少一半的Chk1抑制剂浓度计算。本申请人发现本发明化合物显示出人意料低的ECTFS值，相当于出人意料高的基于细胞的效能。
另一个可以测量的参数是在LD50(化合物单独抑制50％细胞生长的量)下达到的倍数敏感性。这两个值，ECTFS和LD50下的倍数敏感性，使得可对Chk1抑制剂彼此之间的效能和毒性进行直接排序。
一种适合测量ECTFS值的检测方法在下式实施例3中描述。简单说来，该检测使用HT29人结肠癌细胞异常增殖细胞群，吉西他滨作为DNA损伤剂/Chk1活化剂，本发明化合物作为Chk1抑制剂。培养所述异常增殖细胞群并且允许其在合适的介质中生长。然后，用一定浓度范围的DNA损伤剂处理所述细胞。在预定时间后，除去DNA损伤剂，并且在一定时间内用一定浓度的Chk1抑制剂处理所述细胞。然后收获培养细胞板并且计算存活细胞的相对量。相对Chk1抑制剂单独作为参照使所获数据归一，然后以DNA损伤剂浓度相对相对细胞存活率(100％等于1.0)作对数/对数图。倍数敏感性由使用与不使用Chk1抑制剂达到90％生长抑制需要的DNA损伤剂量的差别推导而出，其中涉及所用的每个Chk1抑制剂浓度。然后将这些数据描绘于Chk1抑制剂浓度与倍数敏感性的图中，由其计算ECTFS。
ECTFS值优选通过进行至少两次检测获得，ECTFS值表达为所获得各值的平均值。更优选地，重复检测3-10(或更多)次，ECTFS值以所获值的平均值表示。最优选地，所述检测进行多次，足以利用本领域普通技术人员公知的统计方法产生统计上可靠的平均ECTFS值。
进行ECTFS检测的所有化合物显示出低于约1000nMECTFS值。与之相比，先前已知的类似结构化合物显示出约11,000nM的ECTFS值。在某些实施方案中，本发明化合物显示的ECTFS值小于约500nM，其它实施方案中小于约300nM，其它实施方案中小于约200nM，其它实施方案中小于约150nM，其它实施方案中小于约100nM，其它实施方案中小于约50nM，其它实施方案中小于约30nM，其它实施方案中小于约20nM或小于约10nM，或在其它实施方案中小于约5nM。
适于用在本发明中的化合物和药物组合物包括其中活性成分以有效量施用以获得其预期目的的那些。更具体地，“治疗有效量”指足以治疗患有适应症的个体的量或减轻该适应症的现有症状的量。确定治疗有效量完全在本领域技术人员能力范围之内，尤其是根据本文所提供的详细的公开。
除了Chk1抑制剂，本发明药物组合物还可配制为包括生物活性剂如细胞因子、淋巴激活素、生长因子、其它造血因子或其混合物，以便降低药物组合物单独施用时可能产生的或与其有关的不良副作用。或者，这样的生物活性剂可包含在本发明药物组合物内以促进所需的治疗效果。适用于本发明药物组合物的辅助生物活性剂包括但不限于M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNF、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血栓形成素、干细胞因子、促红细胞生成素、促血管生成素(包括Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、和/或人促血管生成素样多肽)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、骨形成蛋白-1(BMP-1)、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15、BMP受体IA、BMP受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体细胞诱导的中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2、内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、源于上皮细胞的嗜中性粒细胞吸引物、成纤维细胞生长因子(FGF)4、FGF 5、FGF 6、FGF 7、FGF 8、FGF 8b、FGF 8c、FGF 9、FGF 10、酸性FGF、碱性FGF、源于胶质细胞系的中性粒细胞因子受体1、源于胶质细胞系的中性粒细胞因子受体2、生长相关的蛋白质、生长相关的蛋白质、生长相关的蛋白质、生长相关的蛋白质、肝素结合的表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生长因子-3、神经生长因子-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板衍生的内皮细胞生长因子、血小板衍生的生长因子、血小板衍生的生长因子A链、血小板衍生的生长因子AA、血小板衍生的生长因子AB、血小板衍生的生长因子B链、血小板衍生的生长因子BB、血小板衍生的生长因子受体、血小板衍生的生长因子受体、pre-B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子(TGF)、TGF、TGF 1、TGF 1.2、TGF 2、TGF 3、TGF5、潜态TGF 1、TGF、结合蛋白I、TGF结合蛋白II、TGF结合蛋白III、I型肿瘤坏死因子受体、II型肿瘤坏死因子受体、尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化因子受体、血管内皮生长因子、以及其嵌合蛋白和生物学或免疫学活性片段。
结构式(I)和(II)化合物也可以与促进化合物在治疗应用方法中的有益性能(或减轻不期望性能)的辅助部分共轭或连接。这种共轭能够增强化合物向特定解剖位点或目标区域(例如肿瘤)输送，能够使化合物在靶细胞内维持治疗浓度，改变化合物的药动学和药效特性，和/或改进化合物的治疗指数或安全性。适合的辅助部分包括，例如氨基酸、寡肽或多肽，例如，抗体如单克隆抗体和其它工程化抗体；以及靶细胞或组织中受体的天然或合成配体。其它合适的辅助物包括改进生物分布和/或靶细胞对化合物的摄取的脂肪酸或脂质部分(参见，例如Bradley等人，Clin.Cancer Res.73229，2001)。
本发明制剂可以用治疗指定疾病的标准方式施用，例如通过口服、胃肠外、经粘膜(例如舌下或经口腔)、局部、经皮、直肠、吸入(例如经鼻或深肺吸入)施用。胃肠外施用包括，但不限于静脉、动脉、腹膜内、皮下、肌肉、鞘内和关节内施用。胃肠外施用也可以使用高压技术如POWDERJECTTM(Powderject Pharmaceuticals，Plc，Oxford，England)完成。
对于口服施用和口腔施用，组合物可以为以常规方式配制的片剂或锭剂形式。例如，片剂和胶囊可包含常规赋形剂，例如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(例如、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙或山梨醇)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、聚乙二醇或二氧化硅)、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可依照本领域公知的方法进行包衣。
或者，本发明化合物可被结合至诸如水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的口服液体制剂中。而且，含有这些化合物的制剂可以干燥产品存在，在使用之前以水或其它适合的载体重新配制。此类液体制剂可包含常规添加剂，例如，悬浮剂如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化的可食用脂肪；乳化剂如卵磷脂、单油酸山梨糖醇酐酯或阿拉伯树胶；非水载体(其可包括食用油)，如杏仁油、分馏椰子油、油性酯、丙二醇和乙二醇；以及防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和山梨酸。
该制剂也可配制为栓剂，例如，含有常规的栓剂基质，如椰子油或其它甘油酯。通常用于吸入的组合物可以溶液、悬浮液或乳剂的形式提供，其可作为干燥粉末施用或使用诸如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷的常规抛射剂以气溶胶形式施用。
局部和透皮制剂包含常规的水性或非水载体，例如滴眼液、霜剂、软膏、洗剂和糊剂，或者为含药的膏剂、贴剂或膜的形式。
此外，本发明组合物可配制为适于通过注射或连续输注施用。用于注射的制剂可为油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂形式，并可含有组方剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以为粉末形式，在使用前以合适的载体(例如，无菌无热源的水)重新配制。
本发明组合物还可配制为储库制剂。该长效作用制剂可经植入(例如皮下或肌肉)或通过肌肉注射施用。因此，本发明化合物可与合适的聚合材料(例如水溶性聚合物)或疏水材料(例如可接受的油中的乳液)、离子交换树脂或微溶的衍生物(例如微溶盐)一起配制。
对于兽医应用来说，式(I)或(II)化合物或其可药用盐、前药或溶剂合物可依据常规兽医实践作为合适的可接受制剂施用。兽医能容易地确定最适合特定动物的剂量方案和施用途径。可用本发明化合物和方法治疗的动物包括但不限于宠物、家畜、展示动物和动物园中的动物。
合成方法 本发明化合物可依照下述合成方案制备。首先，用于制备本文所述Chk1抑制剂的烷氧基芳基胺可通过不同的普通合成方案制备。例如，普通方案1概述了硝基苯酚与就地形成或制备并单独分离的活化醇反应，以提供硝基苯基醚产物。在标准条件下还原醚生成用于生产本发明化合物的芳基胺。
普通方案1
或者，卤代硝基苯与醇在强碱如氢化钠或二(三甲基硅烷基)氨基钾存在下反应也生成硝基芳基醚，正如普通方案2所述。这些醚然后按照普通方案1所述还原。
普通方案2
芳基胺转化为脲可通过多种合成方案之一实现。例如，正如普通方案3所示，芳基胺可以与氨基甲酸吡嗪酯反应生成脲。
普通方案3
或者，依照普通方案4所概述，热诱导的酰基叠氮分解产生了活泼的芳基异氰酸酯，后者然后可与芳基胺反应生成所需的脲。
普通方案4
正如普通方案5所述，另一种方法利用光气或光气等效物与两个芳基胺偶联以生成脲。
普通方案5
本文所述合成方案中使用的缩写为小时(h)，分钟(min)，磅/英寸2(psi)，饱和(sat′d)，水(H2O)，去离子(DI)，异丙醇(iPrOH)，碳载铂(Pt/C)，氮(N2)，氢(H2)，碳载钯(Pd/C)，氧化铂(Pt2O)，硫酸镁(MgSO4)，盐酸(HCl)，偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，二氯甲烷(CH2Cl2)，氯仿(CHCl3)，甲醇(MeOH)，氢氧化铵(NH4OH)，四氢呋喃(THF)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，乙酸(AcOH)，NaOH(NaOH)，EtOAc(EtOAc)，乙醇(EtOH)，二甲基亚砜(DMSO)，氘化二甲基亚砜(d6-DMSO)，碳酸钠(Na2CO3)，氘化氯仿(CDCl3)，碳酸氢钠(NaHCO3)，氢化钠(NaH)，TEA(TEA)，碳酸铯(CSsCO3)，二氧化碳(CO2)，氢氧化钯(Pd(OH)2)，硫酸(H2SO4)，硝酸(HNO3)，氯化钠(NaCl)，硫酸钠(Na2SO4)和二甲基甲酰胺(DMF)。
化合物的制备 下述本发明化合物利用上述普通方案制备。本发明的其它化合物可以通过审慎选择起始材料利用上述普通方案和下述特定合成方法制备。
化合物1
1-[5-氯-2-S-([1，4]氧杂氮杂环庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步骤12-氨基-5-甲基吡嗪。
将氨基-丙二腈对甲苯磺酸盐(20.0g，79mmol)和丙酮醛1-肟(6.88g，79mmol)在烧瓶中合并。加入iPrOH(140mL)，并且在室温下搅拌所获得的黄色浆体18小时，在此期间积聚黄色沉淀物。过滤该混合物，沉淀物用iPrOH(2×50mL)和DI H2O(20mL)洗涤，然后冻干以生成2-氨基-3-氰基-5-甲基吡嗪N-氧化物(10.7g)。
将该吡嗪N-氧化物悬浮于MeOH(22mL)和AcOH(5mL)中。向其中小心地加入5％Pt/C(1.6g)和Darco KB-B(8g)。使该混合物在60psi下吸收H218小时。该反应用25％NaOH(34mL)淬灭并且用N2吹扫30分钟。
混合物通过湿的硅藻土床过滤并且用MeOH(4×100mL)洗涤。滤液在真空下浓缩至1/4体积。用EtOAc(150mL)稀释滤液并且用5％NaOH(30mL)洗涤，然后用EtOAc(2×70mL)反萃取。合并有机层并且用饱和NaCl(20mL)洗涤，过滤，并且在真空下浓缩以生成橙色粘性固体(5.16g)。步骤2(5-甲基吡嗪-2-基)氨基甲酸苯酯。将2-氨基-5-甲基吡嗪(5.16g，47mmol)溶于CH2Cl2(52mL)，在N2下搅拌并且冷却到0℃。向其中加入吡啶(4.8mL，59mmol)，接着在15分钟内滴加氯甲酸苯酯(6.2mL，59mmol)，引起沉淀形成。将该混合物在0℃下搅拌1小时。然后，用0.25M HCl(40mL)和无水醚(50mL)使该反应淬灭，然后在0℃下搅拌30分钟。通过过滤分离沉淀物，用DI H2O(20mL)和醚(2×25mL)洗涤，并且在真空下干燥以生成白色松散粉末产物(7.4g)。
步骤3(S)-2-羟基甲基-[1，4]氧杂氮杂环庚烷-4-甲酸叔丁酯。向250mL的圆底烧瓶中加入(S)-(+)-苄基缩水甘油醚(1.31g，7.9mmol)、3-苄基氨基-丙-1-醇(1.3g，7.9mmol)和10mL EtOH。加热该混合物至40℃达15h。冷却该反应并且在真空下浓缩，获得的油状产物不经纯化直接使用。将二醇放入250mL圆底烧瓶并且溶于75mL无水吡啶。将该溶液冷却到0℃并且一次加入甲苯磺酰氯(5.27g，27.7mmol)。搅拌该混合物6小时，小心地将反应温度保持在0℃。该冷反应用50mL饱和NaHCO3水溶液淬灭。另外加入20mL水并且用EtOAc萃取三次，每次用100mL。合并的有机相在Na2SO4上干燥并且在真空下浓缩。然后以25-50％梯度变化的EtOAc和己烷为洗脱剂通过柱色谱对醇进行纯化。这样产生了1.39g黄色油状的甲苯磺酰醇。
将该醇溶于50mL DMF并且冷却到0℃。在搅拌的同时小心地向冷却的混合物中加入95重量％的NaH(0.29g，11.5mmol)。该反应在0℃下搅拌15分钟，然后使其缓慢地升高到室温并且搅拌6小时。小心地用50mL水使该反应淬灭并且用EtOAc萃取三次，每次用量50mL。合并的有机相在Na2SO4上干燥并且在真空下浓缩。粗产物吸收于EtOH并且放入Parr氢化设备中。另外向溶液中加入10重量％Pd/C(0.426g，0.30mmol)和2MHCl(2.1mL)。氢化在50psi下进行2天，此时通过LCMS分析判断反应进行。该溶液用饱和的NaHCO3水溶液中和并且用3∶1的CHCl3∶iPrOH混合物萃取。合并的有机相在真空下浓缩，粗产物用于下一步骤。
将粗氨基醇溶于100mL无水CH2Cl2。将TEA(1.59mL，11.5mmol)和双碳酸二叔丁酯(5.74g，5.74mmol)加入到该溶液中。该溶液在室温下搅拌18小时，然后用饱和NaHCO3水溶液淬灭并且用CH2Cl2萃取三次，每次用量50mL。合并的有机相用Na2SO4干燥并且在真空下浓缩。该产物通过以25-50％梯度变化的EtOAc/己烷为洗脱剂的柱色谱纯化。这样得到0.240g黄色油状的氧杂氮杂环庚醇。
步骤4(S)-2-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-[1，4]氧杂氮杂环庚-4-甲酸叔丁酯。将氧杂氮杂环庚醇(0.240g，1.03mmol)、TEA(0.21mL，1.545mmol)和10mL无水CH2Cl2加入50mL的圆底烧瓶中。将该溶液冷却到0℃并且滴入甲磺酰氯(0.10mL)。在0℃下搅拌该混合物1.5小时并且用水淬灭，冷却。分离各层，用20mL CH2Cl2萃取水层一次。合并的有机相用Na2SO4干燥并且在真空下浓缩。然后将粗甲磺酸酯溶于5mL无水DMF。向该溶液中加入Cs2CO3(0.671g，2.06mmol)和4-氯-2-硝基-苯酚(0.215g，1.24mmol)。然后加热该嫩黄色溶液至100℃过夜。将该反应冷却到室温，用50mL水淬灭，并且用EtOAc萃取三次，每次用量50mL。该产物通过使用10-35％梯度变化的EtOAc/己烷的闪蒸色谱纯化。该步骤获得0.120g嫩黄色油状的硝基苯基氧杂氮杂环庚烷。
步骤51-[5-氯-2-([1，4]氧杂氮杂环庚烷-2-(S)-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。在25mL圆底烧瓶中放入硝基苯基氧杂氮杂环庚烷(0.120g，0.31mmol)和溶于5mL MeOH的Pt2O(0.007g，0.03mmol)。与氦气球连接，利用吸气器抽空该烧瓶，并且用H2回填三次，然后在H2下搅拌2小时。将反应物通过硅藻土过滤，用MeOH洗涤硅藻土垫2次，每次用量20mL。该溶液在真空下浓缩。将粗苯胺溶于5mL无水DMF。向该溶液中加入TEA(0.005mL，0.34mmol)和(5-甲基吡嗪-2-基)氨基甲酸苯酯(0.07g，0.31mmol)。将混合物在室温下搅拌18小时。在真空下除去溶剂，将残留物再溶于10mL EtOAc并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤。有机物用Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。该灰/棕色残留物用3mL CH2Cl2覆盖并且向其中加入1mL浓的三氟乙酸。通过加酸将所有的固体溶解。反应在室温下搅拌4小时，并且在该时间下加入饱和NaHCO3水溶液直到溶液达到pH 8。该混合物用3∶1的CHCl3∶iPrOH混合物萃取三次，每次用量10mL。合并的有机物在Na2SO4上干燥并且在真空下浓缩。然后在EtOAc中将灰白色固体研磨成粉并且通过中等多孔过滤器过滤，用50mL EtOAc洗涤。在真空下彻底干燥该白色固体。该步骤获得0.020g白色细粉状的所需的脲。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.83(br s，1H)，8.39(dd，1H)，8.18(s，1H)8.04(br s，1H)，6.99(dd，1H)，6.82(d，1H)，4.25-3.98(m，2H)，3.90-3.76(m，1H)，3.38(d，1H)，3.13-3.06(m，2H)，3.00(dd，1H)，2.54(s，3H)，2.06-1.89(m，3H)。LCMS(ES，正)m/e 392.3(M+1)。
化合物2
1-[5-氯-2-(R-吗啉-3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲步骤13-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯。在氮气氛下，于15分钟内向冷却的(0℃浴)吗啉-3-R-4-二甲酸4-叔丁酯(1.00g，4.32mmol)于无水THF(40mL)的溶液中滴加硼烷(4.76mL于THF的1M溶液，4.76mmol)。搅拌1小时后，撤掉冰浴并且在环境温度下连续搅拌3小时。然后加入乙酸(14.3mL 1M水溶液，14.3mmol)。搅拌1小时后，通过加入过量的碳酸氢钠饱和水溶液中和该溶液。加入二氯甲烷(20mL)并且搅拌15分钟，然后分离各层。水层用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机层干燥(MgSO4)并且过滤。将滤后的溶液浓缩至白色固体(0.46g)。
步骤23-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-R-吗啉-4-甲酸叔丁酯。在氮气氛下于15分钟内向冷却(-78℃浴)且搅拌的3-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯(0.13g，0.60mmol)和5-氯-2-氟硝基苯(0.11g，0.66mmol)于无水THF(40mL)的溶液中滴加二(三甲基甲硅烷基)氨化钾(2.4mL于THF的0.5M溶液，1.2mmol)。在另外搅拌15分钟后，加入饱和氯化铵水溶液(10mL)并且撤除冷却浴，使溶液升温到环境温度。搅拌1小时后，加入水(15mL)和CH2Cl2(10mL)并且搅拌5分钟，分离各层。水层用CH2Cl2(2×10mL)萃取，将合并的有机层干燥(MgSO4)并过滤。过滤后的溶液浓缩为黄色油状物(0.26g)，后者通过以己烷/EtOAc(1∶1)为洗脱剂的柱色谱纯化，得到淡黄色油状物(0.195g)。
步骤33-(2-氨基-4-氯-苯氧基甲基)-R-吗啉-4-甲酸叔丁酯。在搅拌下将Pt2O(0.020g，0.088mmol)加入到3-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-R-吗啉-4-甲酸叔丁酯(0.17g，0.46mmol)于MeOH(4mL)的溶液中。抽空该烧瓶，然后用H2填充该烧瓶，重复三次。搅拌4小时后，通过硅藻土垫过滤该溶液，然后浓缩滤液以生成黄色油状产物。
步骤43-{4-氯-2-[3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-苯氧基甲基}-R-吗啉-4-甲酸叔丁酯。制备所述黄色油和(5-甲基-吡嗪-2-基)-氨基甲酸苯酯(0.13g，0.57mmol)于无水DMF(2mL)的溶液并且加入TEA(0.074mL，0.53mmol)。在搅拌24小时后，在减压下浓缩该反应，然后再溶于水(10mL)和EtOAc(10mL)。搅拌15分钟后，分离各层，水层用EtOAc(2×10mL)萃取，合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，然后干燥(Na2SO4)并过滤。浓缩过滤后的溶液，然后通过以EtOAc/CH2Cl2(1∶1)为洗脱剂的柱色谱纯化以产生黄色油状物(0.8g)。
步骤51-[5-氯-2-(R-吗啉-3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。向受到搅拌的3-{4-氯-2-[3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲基]-苯氧基甲基}-R-吗啉-4-甲酸叔丁酯(0.8g)于CH2Cl2(6mL)的溶液中加入三氟乙酸(3mL)。搅拌5小时后，用碳酸钾水溶液(1M)处理该溶液直至碱性，然后搅拌30分钟。进行层分离，水层用CH2Cl2(3×10mL)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并且过滤。浓缩过滤后的溶液，然后通过以MeOH/CH2Cl2(1∶9)为洗脱剂的柱色谱纯化以产生浅黄色固体(0.0523g)。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.22(s，1H)，9.96(br s，1H)，8.74(s，1H)，8.28(d，1H)，8.18(s，1H)，7.04(dd，2H)，3.94(m，3H)，3.71(br d，1H)，3.43(m，1H)，3.23(m，2H)，3.34(br m，2H)，2.66(br m，1H)，2.43(s，3H).LRMS(es，正)m/e 378.3(M+1)。
化合物3
1-[2-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步骤11，4-二甲基-2-(4-甲基-2-硝基-苯氧基甲基)-哌嗪。将4-甲基-2-硝基-苯酚(0.95g，6.20mmol)、(1，4-二甲基-哌嗪-2-基)-MeOH(0.98g，6.82mmol)和三苯基膦(1.79g，6.82mmol)在THF中合并，搅拌5分钟，然后用DIAD(1.38g，6.82mmol)处理。搅拌该反应过夜。在真空下浓缩产生橙色油状物，后者溶于EtOAc并且用2M的HCl水溶液萃取。合并水性洗液，用EtOAc洗涤，并且用固体NaOH处理直到呈碱性。所获得的水性混合物用EtOAc萃取，合并的有机萃取物用Na2SO4干燥，过滤并且在真空下浓缩以形成棕色油。闪蒸色谱处理(1％MeOH的CH2Cl2溶液)生成1.0g所需的芳基醚。
步骤22-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯基胺。将1，4-二甲基-2-(4-甲基-2-硝基-苯氧基甲基)-哌嗪(1.02g，3.65mmol)溶于MeOH(75mL)并且用饱和氯化铵水溶液处理直到混合物变混浊。加入锌(0.24g，3.65mmol)。将所获得的热反应混合物另外搅拌30分钟，此时LCMS显示已经开始消耗起始材料。用EtOAc和Na2CO3水溶液稀释反应并且分离各层。有机层用饱和NaCl溶液洗涤并且用无水Na2SO4干燥。过滤混合物并且在真空下浓缩以提供所需的苯胺。
步骤31-[2-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。将5-甲基-吡嗪-2-甲酸(691mg，5mmol)在甲苯(15mL)中搅拌并且先后用TEA(765mL，5.5mmol)和叠氮磷酸二苯酯(1.0mL，5.0mmol)处理。将所获得的溶液搅拌30分钟，然后直接使用。
5-甲基-吡嗪-2-羰基叠氮化物(1.0mmol)于甲苯的溶液在90℃下加热10分钟。将反应烧瓶从加热浴中移出，所获得的棕色溶液用2-(1，4-二甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-5-甲基-苯胺(0.25g，1.0mmol)处理。将烧瓶再放回加热浴中并且在40℃下加热4小时。使该混合物冷却，然后过滤以提供茶褐色粉末状的产物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ10.90(s，1，H)，8.4(s，1，H)，8.2(m，3，H)，6.8(m，2，H)，4.2(dd，1，H)，3.9(t，1，H)，3.1(d，1，H)，2.8(br d，1，H)，2.6(m，2，H)，2.5(s，3，H)，2.4(m，1，H)，2.4(s，3，H)，2.3(s，3，H)，2.25(m，1，H)，2.2(s，3，H)，2.1(m，1，H)。LRMS(esi，正)m/e 385.30(M+1)。
化合物4
1-[4，5-二氯-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步骤1(S)-2-羟基甲基-吗啉-4-甲酸叔丁酯。在500mL烧瓶中合并(S)-苄基缩水甘油醚(15g，91.4mmol)、MeOH(10mL)和50重量％NaOH(30mL，365mmol)。分次向该混合物中加入2-氨基乙基硫酸酯(25.8g，183mmol)。将该非均匀混合物加热到40℃，此时该溶液变均匀。在40℃下保持4小时。略微冷却反应并将附加的固体NaOH(14.6g，365mmol)与50mL甲苯一起加入。然后加热该双相溶液至65℃达12h。将反应冷却到室温，分离各层，水层用75mL甲苯萃取一次。合并的有机层用1M HCl洗涤三次，每次用量75mL。用NaOH水溶液将合并水层的pH调整为pH 12并且用EtOAc萃取四次，每次用量70mL。合并的有机相用Na2SO4干燥并且在真空下浓缩以产生10.084g不透明油状的所需吗啉。
将粗吗啉产物溶于CH2Cl2(100mL)并且加入TEA(12.1mL，87.5mmol)和加入双碳酸二叔丁酯(15.9g，73mmol)，同时伴随产生CO2气体。将反应在室温下搅拌18小时，然后用35mL饱和NaHCO3水溶液淬灭。加入另外50mL水并且分离各层。有机层用无水Na2SO4干燥，在真空下浓缩并且通过闪蒸色谱(20％EtOAc/己烷)纯化以产生所需的浅黄色油状的N-Boc-O-苄基吗啉(5.536g)。
将纯化过的双保护吗啉溶于50L无水EtOH并且加入Pd(OH)2(1.26g，20％wt，1.8mmol)。与氢气球连接，并且通过抽气器使烧瓶排空，并且用H2回填三次。在H2下搅拌反应30小时。混合物通过硅藻土过滤，并且用EtOH彻底洗涤硅藻土垫。过滤后的溶液在真空下浓缩以产生所需的灰白色固体的N-boc-吗啉醇(3.918g)。
步骤24，5-二氯-2-硝基-苯酚。在A 250mL圆底烧瓶中装入溶于50mL CH2Cl2的3，4-二氯苯酚(3.053g，18.7mmol)并且在冰浴中冷却到0℃。在搅拌下溶液中加入浓H2SO4(1.56mL，28.1mmol)。溶液变混浊。向该混合物中滴入浓HNO3(1.2mL，18.7mmol)并且小心地使温度保持在5℃之下。将反应在0℃下搅拌30分钟，然后用冰浴冷却，并且用150mL H2O淬灭。分离各层，水层用35mL CH2Cl2萃取一次。合并的有机相用无水Na2SO4干燥，在真空下浓缩并且利用闪蒸色谱纯化(10％EtOAc/己烷作为洗脱剂)以产生所需的嫩黄色固体硝基苯酚(1.793g)。
步骤31-[4，5-二氯-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。依照制备化合物1的步骤4和5，利用4，5-二氯-2-硝基-苯酚和(S)-2-苄氧基甲基-吗啉-4-甲酸叔丁酯制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.42(s，1H)，10.29(s，1H)，8.93(s，1H)，8.42(s，1H)，8.21(s，1H)，7.32(s，1H)，4.18-3.41(m，5H)，3.03-2.66(m，4H)，2.38(s，3H)LRMS(ES，正)m/e412.2(M+1)。
化合物5
1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-脲 步骤15-溴-吡嗪-2-基胺。将吡嗪-2-基胺(6.66g，70mmol)于CH2Cl2(200mL)的溶液冷却到0℃，用N-溴琥珀酰胺(12.5g，70mmol)处理并且使其升温到室温。将获得的反应混合物搅拌过夜，然后用另外的CH2Cl2(200mL)稀释并且用10％Na2CO3水溶液洗涤。分离各层，有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，然后用无水MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残留物吸收于EtOAc(50mL)，通过加入己烷(300mL)沉淀产物。沉淀物在减压下干燥以生成5.57g茶褐色固体。
步骤25-氨基-吡嗪-2-腈。将5-溴-吡嗪-2-基胺与碘化亚铜(I)(1.3g，6.9mmol)、氰化钾(0.44g，6.8mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(0.95g，0.83mmol)和18-冠-6(0.058g，0.22mmol)合并于DMF(15mL)中。将获得的混合物搅拌40分钟，然后在回流(155℃)下加热2小时。将反应冷却到室温，然后静置过夜。通过过滤分离沉淀物并且在真空下浓缩滤液至干。橙色残留物吸收于EtOAc和己烷中，并且形成初始沉淀物，然后通过过滤分离。通过过滤收集静置过程中在母液中形成的其它沉淀物。合并固体以生成0.10g的鲜橙色固体。
步骤32-{2-[3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲基]-4-甲基-苯氧基甲基}-吗啉-4-甲酸叔丁酯。2-(2-氨基-4-甲基-苯氧基甲基)-吗啉-4-甲酸叔丁酯(0.087g，0.270mmol)由2-氨基-4-甲基-苯酚依照化合物3制备方法的步骤1和2，利用2-羟基甲基-吗啉-4-甲酸叔丁酯(依照化合物2制备方法的步骤1利用相应的酸制备)和4-甲基-2-硝基-苯酚制备。与三光气(0.029g，0.10mmol)、甲苯(2mL)和Hunig′s碱(0.15mL，0.86mmol)合并，并且在室温下搅拌25分钟。然后通过套管将该悬浮液转移到含有5-氨基-吡嗪-2-腈(0.032g，0.27mmol)和双(三甲基硅烷基)氨基锂于THF(1mL)的冷却(-78℃)溶液中，所述冷却的溶液已经在-78℃搅拌30分钟。将反应升温，然后在室温下搅拌16小时。形成的沉淀物通过过滤收集以产生所需的产物(0.043g)。
步骤41-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-脲。2-{2-[3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲基]-4-甲基-苯氧基甲基}-吗啉-4-甲酸叔丁酯(0.043g，0.0918mmol)于THF(2mL)的浆体用溶于二烷(4M，0.11mL)的HCl处理并且搅拌20小时。另外加入溶于二烷(4M，0.25mL)的HCl并且加热该反应至50℃达18h。冷却该反应并浓缩。将获得的固体悬浮于醚，过滤悬浮液并且空气干燥以得到作为HCl盐的所需产物(0.042g)。
步骤51-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-脲。将1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-脲盐酸盐(0.0104g，0.129mmol)于MeOH(1mL)的溶液冷却到0℃并且先后用甲醛水溶液(0.12mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(0.06g，0.292mmol)处理。搅拌反应12小时，然后在真空下浓缩。残留物进行硅胶色谱(溶于CH2Cl2的2％MeOH)处理以得到白色固体产物(0.014g)。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.90(s，1，H)，10(br s，1，H)，8.9(s，1，H)，8.8(s，1，H)，8(s，1，H)，6.9(m，1，H)，6.8(m，1，H)，3.9(m，4，H)，3.6(t，1，H)，2.9(d，1，H)，2.7(d，1，H)，2.2(s，3，H)，2.1(s，3，H)，2(t，1，H)，1.8(t，1，H)。LRMS(esi，正)m/e 383.40(M+1)。
化合物6
1-[5-氯-2-([1，4]氧杂氮杂环庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步骤13-苄基-2-氯甲基-[1，3]氧杂氮杂环庚烷。将3-苄基氨基-丙-1-醇(14g，88.0mmol)和表氯醇(81.4g，880mmol)溶液加热到40℃。在搅拌3小时后冷却反应，并且通过真空下的蒸发除去过量表氯醇。缓慢地加入硫酸(10mL)，然后将反应烧瓶放入在150℃下预热的油浴中。连续搅拌1小时，然后使反应区冷却到室温并且通过加冰淬灭。用10％Na2CO3水溶液将混合物调整到碱性pH并且用EtOAc(3×300mL)萃取。合并的有机层用无水MgSO4干燥，过滤并且在减压下干燥。获得的残留物通过闪蒸色谱(70∶28∶2己烷/CH2Cl2/2M NH4OH aq)纯化以得到5g浅黄色的油状物。
步骤22-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-[1，3]氧杂氮杂环庚烷-3-甲酸叔丁酯。在搅拌下向4-溴-2-硝基-苯酚(1.39g，8.0mmol)于DMSO(30mL)的溶液中先后加入碳酸钾(2.76g，20.0mmol)和3-苄基-2-氯甲基-[1，3]氧杂氮杂环庚烷。将反应在60℃下搅拌12小时，然后冷却到室温并且用EtOAc(200mL)和10％Na2CO3水溶液(200mL)稀释。分离各层，有机层用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥并且在真空下浓缩。粗产物通过闪蒸色谱(70∶30己烷/EtOAc)纯化以提供480mg淡橙色油状物。
所述油状物吸收于CH2Cl2(5mL)并且在冰浴中冷却。加入氯甲酸α氯乙酯(0.18mL，1.65mmol)。搅拌反应2小时，然后加入2N HCl水溶液。连续搅拌10分钟，然后浓缩混合物至干。所获得的残留物吸收于MeOH并且回流2小时。在减压下浓缩反应，用2N HCl(75mL)水溶液吸收残留物并且用EtOAc(2×50mL)洗涤。通过加入固体NaOH将水层的pH调整为pH11。获得的碱性溶液用EtOAc(2×50mL)萃取，合并的有机层用盐水洗涤并且用MgSO4干燥。过滤并在真空下浓缩以提供240mg淡黄色油状产物。
所述油状物溶于CH2Cl2(3mL)，然后用TEA(0.116mL，0.831mmol)和双碳酸二叔丁酯(0.181g，0.831mmol)处理。将反应在室温下搅拌1小时，然后用附加的CH2Cl2(100mL)稀释并且用10％Na2CO3水溶液(100mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。利用闪蒸色谱(7∶3己烷/EtOAc)纯化以提供252mg白色泡沫状产物。
步骤32-(2-氨基-4-氯-苯氧基甲基)-[1，3]氧杂氮环庚烷-3-甲酸叔丁酯。依照化合物3制备方法的步骤2由2-(4-氯-2-硝基-苯氧基甲基)-[1，3]-氧杂氮杂环庚烷-3-甲酸叔丁酯(0.252g，0.65mmol)制备，生成150mg透明油状的产物。
步骤41-[5-氯-2-([1，4]氧杂氮杂环庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。根据化合物2制备方法的步骤4和化合物5制备方法的步骤4由2-(2-氨基-4-溴-苯氧基甲基)-[1，3]氧杂氮杂环庚烷-3-甲酸叔丁酯制备，生成0.175g产物。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.65(br s，1，H)，8.3(s，1，H)，8.25(s，1，H)，6.98(dd，1，H)，6.8(d，1，H)，4.08(m，3，H)，3.8(m，1，H)，3.35(s，1，H)，3.25(d，1，H)，3(m，3，H)，2.5(s，3，H)，1.98(m，2，H)。LRMS(esi，正)m/e 391.90(M+1)。
化合物7
1-[5-甲基-2-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 步骤13-羟基甲基-4-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯。哌嗪-2-甲酸(20g，154mmol)于200mL 1∶1 H2O/二烷中的浆体在冰浴中冷却并且用固体NaOH(11g)处理，通过滴液漏斗加入溶于二烷的双碳酸二叔丁酯(21.6g，99mmole)溶液。在此反应期间根据需要将反应的pH调整为pH＞10。将所获得的混合物搅拌3小时，然后用水稀释直到均匀并且用浓HCl酸化直到pH在2和3之间。用醚洗涤该溶液并且用NaOH调节pH直到pH为6.5-7。使该溶液静置数天，并且通过过滤收集形成的沉淀以提供白色固体状的哌嗪-1，3-二甲酸1-叔丁酯(9.7g)。
哌嗪-1，3-二甲酸1-叔丁酯(4.62g，20.0mmol)于CH3OH(100mL)的浆体用甲醛水溶液(40mmol)和甲酸(70mmol)处理，然后在65℃下加热数小时。在通过HPLC确认完成后，冷却反应并且在真空下浓缩。
用THF吸收残留物并且在冰浴中冷却，然后用氢化铝锂于THF(19.0mmol)的溶液处理。1小时后，使反应升温到室温并且再搅拌30分钟。然后在冰浴中冷却反应并且先用H2O(0.75mL)和15％NaOH水溶液(0.75mL)，然后用H2O(3×0.75mL)淬灭。通过过滤除去盐并且在真空下浓缩滤液以提供粗产物。通过硅胶色谱(2.5％MeOH的CH2Cl2溶液)产生黄色油状产物(0.70g)。
步骤21-[5-甲基-2-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲。依照化合物3制备方法和化合物5制备方法步骤4利用3-羟基甲基-4-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.24(br s，1，H)，10.1(s，1，H)，9.7(br s，1，H)，9.42(s，1，H)，9.12(s，1，H)，8.2(s，1，H)，8.08(s，1，H)，6.91(d，1，H)，6.82(d，1，H)，4.6(d，1，H)，4.4(m，1，H)，4.1(m，1，H)，3.6(m，6，H)，3(s，3，H)，2.4(s，3，H)，2.2(s，3，H)。LRMS(csi，正)m/e 371.40(M+1)。
化合物8
1-(5-氰基-吡嗪-2-基)-3-[5-甲基-2-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-脲 依照化合物5制备方法的步骤1-4，使用4-甲基-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)，δ8.80(s，1，H)，8.7(s，1，H)，7.9(s，1，H)，6.8(m，2，H)，4.2(m，4，H)，3.8(m，1，H)，3.6(m，1，H)，3.5(m，1，H)，3.2(m，2，H)，2.3(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 369.30(M+1)。
化合物9
1-[5-氯-4-甲基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1制备方法的步骤4和5利用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯制备，依照化合物4制备方法的步骤1使用4-氯-5-甲基-2-硝基-苯酚制备，依照化合物4制备方法的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.32(s，1H)，10.21(s，1H)，8.75(s，1H)，8.29-8.10(m，2H)，7.06(d，1H)，7.18(d，1H)，4.12-3.42(m，5H)，3.29-2.63(m，4H)，2.48(s，3H)，2.25(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 392.2(M+1)。
化合物10
1-[5-氯-4-甲基-2-(R-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1制备方法的步骤4和5使用2-羟基甲基-R-吗啉-4-甲酸制备，由(R)-苄基缩水甘油醚酸叔丁酯和由4-氯-5-甲基-2-硝基-苯酚使用化合物4步骤1制备，依照化合物4步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.32(s，1H)，10.21(s，1H)，8.75(s，1H)，8.29-8.10(m，2H)，7.06(d，1H)，7.18(d，1H)，4.12-3.42(m，5H)，3.29-2.63(m，4H)，2.48(s，3H)，2.25(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 392.3(M+1)。
化合物11
1-[4，5-二氯-2-(R-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤4和5使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和4，5-二氯-2-硝基-苯酚制备，依照化合物4的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.42(s，1H)，10.29(s，1H)，8.93(s，1H)，8.42(s，1H)，8.21(s，1H)，7.32(s，1H)，4.18-3.41(m，5H)，3.03-2.66(m，4H)，2.38(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 412.2(M+1)。
化合物12
1-[4，5-二甲基-2-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤4和5使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和4，5-二甲基-2-硝基-苯酚制备，依照化合物4的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.02(s，1H)，9.89(br s，1H)，8.85(br s，1H)，8.27(s，1H)，8.91(s，1H)，6.84(s，1H)，4.18-3.97(m，3H)，3.69(t，1H)，3.43-3.26(m，2H)，2.97(t，2H)，2.33(s，3H)，2.18(s，2H)，2.12(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e372.3(M+1)。
化合物13
1-[4-氯-5-甲基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤4和5使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和5-氯-4-甲基-2-硝基-苯酚制备，依照化合物4的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.26(s，1H)，8.82(s，1H)，8.19(s，1H)，8.17(s，1H)，7.10(s，1H)，4.21-3.96(m，2H)，3.90-3.86(m，2H)，3.54(dt，1H)，2.98(d，1H)，2.84(t，2H)，2.36(s，3H)，2.21(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 392.1(M+1)。
化合物14
1-[5-氰基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤4和5使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和4-羟基-3-硝基-苄腈制备，依照化合物4的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.43(br s，1H)，10.30(s，1H)，8.62(br s，1H)，8.53(s，1H)，8.21(s，1H)，7.48(d，1H)，7.33(d，1H)，4.20-4.11(m，2H)，3.94-3.73(m，2H)，3.51(dt，1H)，3.00(d，1H)，2.77-2.61(m，2H)。LRMS(ES，正)m/e 369.2(M+1)。
化合物15
1-[5-氯-4-乙基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤4和5使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和4-氯-5-乙基-2-硝基-苯酚制备，依照化合物4的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.33(s，1H)，10.19(s，1H)，8.66(s，1H)，8.33-8.01(m，3H)，7.05(d，1H)，4.29-3.39(m，5H)，3.29-2.91(m，2H)，2.89-2.70(m，2H)，2.58(q，2H)，2.49(s，3H)，1.17(t，3H)。LRMS(ES，正)m/e 406.1(M+1)。
化合物16
1-[5-氯-4-甲氧基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤4和5使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和4-氯-5-甲氧基-2-硝基-苯酚制备，依照化合物4的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.11(s，1H)，10.05(br s，1H)，8.64(s，1H)，8.19(s，2H)，6.91(s，1H)，4.29(s，2H)，4.16(m，1H)，4.09(d，1H)，3.87(s，3H)，3.75(t，1H)，3.44-3.17(m，2H)，3.01(t，2H)，2.39(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 408.0(M+1)。
化合物17
1-[5-二甲基氨基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤4和5使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和4-二甲基氨基-2-硝基-苯酚制备，依照化合物4的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.11(s，1H)，10.05(br s，1H)，8.69(s，1H)，8.19(s，1H)，7.75(s，1H)，6.90(d，1H)，6.34(dd，1H)，4.05-3.81(m，4H)，3.56(t，1H)，3.14(d，1H)，2.93(d，1H)，2.80(s，6H)，2.76-2.63(m，2H)，2.41(s，3H)。LRMS(ES，正)m/e 387.4(M+1)。
化合物18
1-[5-溴-4-甲基-2-S-(吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-溴-5-甲基-2-硝基-苯酚制备，利用化合物4的步骤2制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.31(br s，1H)，10.19(s，1H)，8.63(s，1H)，8.41(s，1H)，8.20(s，1H)，7.07(s，1H)，4.13-3.94(m，3H)，3.87-3.74(m，2H)，δ3.52(td，1H)，3.00(d，1H)，2.69(t，2H)，2.42(s，1H)，2.25(s，1H)。LRMS(ES，正)m/e 438.2.0(M+1)。
化合物19
1-[5-甲基-2-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物3的方法使用由相应的酸依照化合物2的步骤1制备的2-羟基甲基-吗啉-4-甲酸叔丁酯制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)，8.90(s，1，H)，8.6(s，1，H)，7.9(s，1，H)，6.9(m，2，H)，4.2(m，4，H)，3.8(t，1，H)，3.7(s，2，H)，3.5(d，1，H)，3.2(m，1，H)，2.6(s，3，H)，2.3(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 358.20(M+1)。
化合物20
1-[5-氯-2-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物3的方法使用由相应的酸依照化合物2的步骤1制备的4-氯-2-硝基-苯酚和2-羟基甲基-吗啉-4-甲酸叔丁酯制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)，δ8.70(s，1，H)，8.5(s，1，H)，8.4(s，1，H)，7.05(m，1，H)，4.2(m，4，H)，3.8(t，1，H)，3.5(d，1，H)，3.2(m，2，H)，2.6(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 378.50(M+1)。
化合物21
1-[5-氯-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-氯-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.35(s，1，H)，9.4(br s，1，H)，8.55(br s，1，H)，8.25(m，2，H)，7.22(m，2，H)，4.2(m，3，H)，4(d，1，H)，3.8(t，1，H)，3.4(d，1，H)，3.2(d，1，H)，2.8(m，1，H)，2.45(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 378.30(M+1)。
化合物22
1-[5-甲基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用(R)-苄基缩水甘油醚和4-甲基-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.20(s，1，H)，10.1(br s，1，H)，9.89(br s，1，H)，9.5(br s，1，H)，8.7(s，1，H)，8.3(s，1，H)，7.98(s，1，H)，6.9(m，1，H)，6.8(m，1，H)，4(m，3，H)，3.42(m，2，H)，3.19(m，2，H)，3(m，2，H)，2.43(s，3，H)，2.25(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 358.30(M+1)。
化合物23
1-[5-氯-2-(R-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用(R)-苄基缩水甘油醚和4-氯-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.45(s，1，H)，9.6(br s，1，H)，9.3(brs，1，H)，8.7(br s，1，H)，8.3(s，1，H)，7.19(m，2，)，4.2(m，2，H)，4(d，1，H)，3.84(t，1，H)，3.41(d，1，H)，3.21(d，1，H)，3.02(m，2，H)，2.5(s，3，H)。
LRMS(esi，正)m/e 378.30(M+1)。
化合物24
1-[5-氯-2-R-([1，4]氧杂氮杂环庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的方法使用(R)-2-羟基甲基-[1，4]氧杂氮杂-4-甲酸叔丁酯制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.83(br s，1H)，8.39(dd，1H)，8.18(s，1H)，8.04(br s，1H)，6.99(dd，1H)，6.82(d，1H)，4.25-3.98(m，2H)，3.90-3.76(m，1H)，3.38(d，1H)，3.13-3.06(m，2H)，3.00(dd，1H)，2.54(s，3H)，2.06-1.89(m，3H)。LRMS(ES，正)m/e 392.3(M+1)。
化合物25
1-[5-氯-2-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物7的方法使用4-氯-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.35(br s，1，H)，10.2(s，1，H)，9.84(br s，1，H)，9.6(s，1，H)，8.31(s，1，H)，8.21(s，1，H)，7.08(m，2，H)，4.58(d，1，H)，4.42(d，1，H)，3.7(m，6，H)，3(s，3，H)，2.44(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 391.40(M+1)。
化合物26
1-[5-氯-2-S-(1-甲基-哌嗪-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物7的方法使用S-哌嗪-2-甲酸和4-氯-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.80(s，1，H)，8.28(d，2，H)，6.99(s，2，H)，4.17(m，3，H)，3.1(d，1，H)，2.92(d，2，H)，2.84(t，1，H)，2.5(s，3，H)，2.45(m，2，H)，2.42(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 391.30(M+1)。
化合物27
1-[5-氯-4-甲基-2-S-([1，4]-氧杂氮杂环庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的方法使用依照化合物4的步骤2制备的4-氯-5-甲基-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.2(s，1H)，8.62(s，1H)，8.27(s，1H)，8.24(s，1H)，7.32(m，1H)，7.18(s，1H)，4.09-3.91(m，3H)，3.90-3.79(m，1H)，3.77-3.62(m，1H)，3.14(d，1H)，2.85(m，1H)，2.73(s，2H)，2.39(s，3H)，2.27(s，1H)，1.82-1.67(m，2H)。LRMS(ES，正)m/e 406.2(M+1)。
化合物28
1-[5-溴-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-溴-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ10.30(s，1，H)，8.63(br s，1，H)，8.43(s，1，H)，8.22(s，1，H)，7.15(m，1，H)，7.05(d，1，H)，4.08(m，3，H)，3.82(m，2，H)，3.47(t，1，H)，3.17(s，2，H)，3(d，1，H)，3.07(s，3，H)，2.68(m，2，H)。LRMS(esi，正)m/e423.90(M+1)。
化合物29
1-[5-溴-2-R-(R-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用(R)-苄基缩水甘油醚和4-溴-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ10.30(br s，1，H)，8.65(br s，1，H)，8.43(s，1，H)，8.25(s，1，H)，7.18(dd，1，H)，7.03(d，1，H)，4.03(m，2，H)，3.82(m，2，H)，3.52(t，2，H)，3.19(d，1，H)，3(d，1，H)，2.76(m，2，H)，2.43(s，3，H)。LRMS(esi，正)m/e 443.90(M+1)。
化合物30
1-[5-溴-2-S-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-溴-2-硝基-苯酚和化合物2的步骤4以及化合物5的步骤4和5制备。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ11.43(br s，1，H)，9.02(s，1，H)，8.6(s，1，H)，8.33(s，1，H)，8.2(s，1，H)，7.12(d，1，H)，6.76(d，1，H)，4(m，3，H)，3.8(t，1，H)，3.02(d，1，H)，2.73(d，1，H)，2.51(s，3，H)，2.3(t，1，H)，2.22(s，3，H)，2.08(t，1，H)。
化合物31
1-[5-溴-2-([1，4]氧杂氮杂环庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物6的方法使用依照化合物4步骤2制备的4-溴-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.72(br s，1，H)，8.48(s，1，H)，8.45(s，1，H)，7.11(d，1，H)，6.75(d，1，H)，4.02(m，3，H)，3.8(m，1，H)，3.21(d，1，H)，2.97(m，2，H)，2.51(s，3，H)，1.92(br m，2，H)。LRMS(esi，正)m/e436.00(M+1)。
化合物32
1-[5-溴-2-(4-甲基-[1，4]氧杂氮杂环庚烷-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物4的方法使用4-溴-2-硝基-苯酚和化合物5的步骤5制备。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.25(s，1，H)，8.23(s，1，H)，7.1(d，1，H)，6.72(d，1，H)，4.19(m，1，H)，4(m，1，H)，3.95(m，2，H)，3.42(br s，1，H)，3.02(d，1，H)，2.84(m，1，H)，2.62(t，1，H)，2.5(s，3，H)，2.4(s，3，H)，2(m，2，H)。LRMS(esi，正)m/e 451.90(M+1)。
化合物33
1-[5-氯-2-S-(4-氰基甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 将1-[5-氯-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲(0.189g，0.5mmol)悬浮于DMF(2mL)。加入碳酸钾(0.104g，0.75mmol)和溴乙腈(0.035mL，0.5mmol)并且加热该混合物至80℃达8h。使反应混合物冷却到室温并且通过加入H2O(10mL)淬灭。通过过滤收集形成的固体并且从MeOH重结晶以提供白色粉末状的产物(0.072g)。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.46(br s，1H)，10.26(br s，1H)，8.63(br s，1H)，8.31(d，1H)，8.17(s，1H)，7.10(d，1H)，7.03(dd，1H)，4.14(dd，1H)，4.09(dd，1H)，3.96-4.01(m，1H)，3.91-3.95(m，1H)。3.81(d，1H)，3.72(d，1H)，3.64(td，1H)，2.95(br d，1H)，2.72(br d，1H)，2.43(s，3H)，2.32(td，1H)，2.18(t，1H)。LRMS(esi，正)m/e 417(M+1)。
化合物34
1-[5-氯-2-(硫代吗啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物2的步骤2(使用依照化合物2的步骤1由硫代吗啉-2，4-二甲酸4-叔丁酯获得的2-羟基甲基-硫代吗啉-4-甲酸叔丁酯)、化合物3的步骤2以及化合物2的步骤4和5制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.48(br s，1H)，10.27(br s，1H)，8.62(br s，1H)，8.31(d，1H)，8.21(s，1H)，7.12(d，1H)，7.03(dd，1H)，4.36(t，1H)，4.12(dd，1H)，3.24(dd，1H)，3.10-3.17(m，1H)，2.99(dd，1H)，2.94-2.98(m，1H)，2.89(ddd，1H)，2.71(ddd，1H)，2.46-2.48(m，1H)，2.44(s，3H)。LRMS(esi，正)m/e 394(M+1)。
化合物35
1-(5-甲基-吡嗪-2-基)-3-[3-S-(吗啉2-基甲氧基)-5，6，7，8-四氢-萘-2-基]-脲 依照化合物3的步骤1(使用依照化合物2的步骤1由S-吗啉-2，4-二甲酸4-叔丁酯制备的(S)-2-羟基甲基-吗啉-4-甲酸叔丁酯和依照化合物4的步骤2制备的3-硝基-5，6，7，8-四氢-萘-2-醇)和化合物1的步骤5制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.09(br，1，H)，10.05(s，1，H)，8.60(br s，1，H)，8.17(s，1，H)，7.86(s，1，H)，6.68(s，1，H)，3.97(m，1，H)，3.89(m，1，H)，3.78(m，2，H)，3.31(t，1，H)，2.98(d，1，H)，2.63(m，6，H)，2.44(m，1，H)，2.41(s，3，H)，1.68(m，4，H)。
化合物36
1-[5-氯-2-S-(吗啉3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物2的方法使用吗啉-3-S-4-二甲酸4-叔丁酯制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.22(s，1，H)，9.96(br，1，H)，8.74(s，1，H)，8.29(d，1，H)，8.18(s，1，H)，7.04(m，2，H)，3.94(m，3，H)3.70(br d，1，H)，3.42(m，1，H)，3.23(m，2，H)，2.83(br s，2，H)，2.43(s，3，H)。
化合物37
1-[5-甲基-2-R-(吗啉3-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物2的方法使用4-甲基-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.08(br s，1，H)，9.76(br，1，H)，8.17(s，1，H)，8.03(d，1，H)，6.90(d，1，H)，6.80(d，1，H)，3.88(m，3，H)，3.70(br d，2，H)，3.41(m，1，H)，3.20(m，2，H)，2.82(m，2，H)，2.43(s，3，H)，2.24(s，3，H)。
化合物38
1-[5-氯-2-S-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-三氟甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤2-5使用依照Miesel美国专利No.4,293,552的方法制备的5-三氟甲基-吡嗪-2-基胺和(S)-2-羟基甲基-吗啉-4-甲酸叔丁酯制备。1H-NMR(d6-DMSO)δ10.85(bs，1H)，9.97(bs，1H)，9.11(bs，1H)，8.98(bs，1H)，8.73(bs，1H)，8.22(bs，1H)，7.08(bs，1H)，4.19-3.73(m，6H)，3.32-2.98(m，4H)。LRMS(esi，正)m/e 432(M+1)。
化合物39
1-[4-氯-5-甲基-2-S-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物5的步骤1-4使用依照化合物4的步骤2由3-氯-4-甲基-苯酚制备的5-氯-4-甲基-2-硝基-苯酚制备。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ10.39(br s，1H)，9.05(br s，1H)，8.74(s，1H)，8.68(s，1H)，8.18(s，1H)，6.91(s，1H)，4.04(m，4H)，3.78(m，1H)，3.19(d，1H)，2.97(m，2H)，2.78(m，1H)，2.36(s，3H)。LCMS(esi，正)m/z 403.16(M+1)。
化合物40
1-[5-氯-4-甲氧基-2-(S-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤2(使用依照化合物5的步骤1和2制备的5-氨基-吡嗪-2-腈)和化合物1的步骤4和5(使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和依照化合物4的步骤2制备的4-氯-5-甲氧基-2-硝基-苯酚)制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.82(s，1H)，9.93(s，1H)，8.95(s，1H)，8.81(s，1H)，8.14(s，1H)，6.93(s，1H)，4.25(s，2H)，4.13-3.98(m，2H)，3.83(s，3H)，3.61(t，1H)，3.41-3.19(m，2H)，3.17-2.91(m，2H)。LRMS(ES，正)m/e419.1(M+1)。
化合物41
1-[5-氯-2-S-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物1的步骤2(使用依照化合物5的步骤1和2制备的5-氨基-吡嗪-2-腈)和化合物1的步骤4和5(使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和4-氯-2-硝基-苯酚)制备。1H-NMR(d6-DMSO)δ10.97(bs，1H)，10.02(bs，1H)，9.05(bs，1H)，8.95(s，1H)，8.85(s，1H)，8.2(s，1H)，7.10(m，1H)，3.96-4.24(m，4H)，3.68-3.78(m，2H)，3.3(m，2H)，3.0(m，2H)。LRMS(esi，正)m/e 388(M+1)。
化合物42
1-[5-氯-2-S-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲 步骤11-[5-氯-2-(吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲。依照化合物1的步骤2(使用依照化合物5的步骤1和2制备的5-氨基-吡嗪-2-腈)和化合物1的步骤4和5(使用2-羟基甲基-S-吗啉-4-甲酸叔丁酯和4-氯-2-硝基-苯酚)制备以提供0.27g产物。
步骤2将1-[5-氯-2-(吗啉2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-氰基-吡嗪-2-基)-脲(0.276g，0.73mmol)悬浮于DMF(5mL)并且用碳酸钾(0.15g，1.1mmol)和甲基碘(0.046mL，0.73mmol)处理。混合物逐渐均匀，并且在在室温下搅拌4小时。通过加水(20mL)使反应淬灭并且用3∶1 CHCl3∶iPrOH混合物萃取(3×25mL)。合并的有机层在减压下浓缩，残留物用EtOAc研磨。过滤后提供0.214g白色固体状的产物。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ11.01(s，1H)，10.16(s，1H)，8.86(d，2H)，8.27(d，1H)，8.17(s，1H)，7.18(m，2H)，4.25-4.06(m，2H)，3.95(m，1H)，3.83(d，1H)，3.61(t，1H)，2.89(d，1H)，2.65(d，1H)，2.18(s，3H)，2.02(td，1H)，1.83(t，1H)。LRMS(ES，正)m/e 403.0(M+1)。
化合物43
1-[5-氯-2-(S-4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲 依照化合物42的步骤2使用1-[5-氯-2-(S-4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯基]-3-(5-甲基-吡嗪-2-基)-脲制备。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ10.54(br s，1H)，10.24(s，1H)，8.73(s，1H)，8.30(s，1H)，8.27(s，1H)，7.12-6.93(m，2H)，4.17-3.81(m，4H)，3.59(t，1H)，3.91(d，1H)，2.64(d，1H)，2.43(s，3H)，2.18(s，3H)，2.03(td，1H)，1.82(t，1H)。LRMS(ES，正)m/e 392.1(M+1)。
治疗方法 本发明化合物可用于治疗涉及异常细胞增殖的病症，例如，本发明化合物可用于强化用在癌症和其它细胞增殖适应症治疗中的放射和/或化疗剂的效果，其中这些细胞增殖适应症涉及真核细胞，包括人和其它动物中的细胞。通常，本发明化合物抑制异常增殖的细胞，包括癌症性的和非癌症性。例如，本发明化合物可用于增强对通常以注入氨甲蝶呤、吉西他滨或5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗代谢物进行治疗的肿瘤的治疗。
本发明化合物的使用可导致异常增殖细胞的部分或完全消退，即这类细胞从细胞群中部分或完全消失。例如，当异常增殖的细胞群为肿瘤细胞时，本发明化合物可用于延缓肿瘤细胞生长的速率，降低肿瘤的大小或数量，和/或诱导部分或完全的肿瘤消退。
当还没有异常细胞增殖被确认或没有异常细胞增殖正在进行，但怀疑或预料会有异常细胞增殖时，本发明化合物可分别在在体内或离体使用。本发明化合物还可以在异常细胞增殖之前已被治疗时使用，以预防或抑制其复发。
本发明一种方法包括给需要其的个体施用治疗有效量的本发明Chk1抑制剂与化疗剂的联合。或者，本发明的方法包括给需要其的个体施用治疗有效量的至少一种本发明Chk1抑制剂与抗体的联合，其中所述抗体具有抑制癌症细胞增殖的活性，例如赫赛汀(herceptin)。
因此，癌症对通过本发明Chk1抑制剂与化疗剂或抗体的联合施用的增强治疗敏感。可通过本发明治疗的癌症包括以实体瘤为特征的癌和恶性肉瘤，以及骨髓或淋巴系统的癌症，包括白血病、淋巴瘤，以及通常缺乏肿瘤实体但是分布在血管淋巴腺系统的癌症。这些癌症包括，例如结肠直肠癌、头颈部癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、外阴癌、白血病、淋巴癌、黑素瘤、肾细胞癌、卵巢癌、脑瘤、骨肉瘤以及肺癌。
因此，本发明化合物适用于由Chk1活性介导的癌症。更具体地，Chk1活性与包括下述(但不限于)癌的形式有关成人和儿童肿瘤，实体瘤/恶性肿瘤的生长物，粘液瘤和圆形细胞癌，局部晚期肿瘤，转移性癌，人软组织肉瘤，包括尤文氏(Ewing′s)肉瘤，癌的转移，包括淋巴性转移，鳞状细胞癌，尤其是头颈癌、食道鳞片细胞癌，口腔癌，血细胞恶性肿瘤，包括多发性骨髓癌，白血病，包括急性淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病以及毛细胞白血病，渗出性淋巴瘤(基于体腔的淋巴瘤)，胸腺淋巴瘤肺癌(包括小细胞癌，皮肤T细胞淋巴癌，霍奇金氏(Hodgkin′s)淋巴癌，非霍奇金氏淋巴癌，肾上腺皮质瘤，产生ACTH的肿瘤，非小细胞癌、乳癌(包括小细胞和导管癌)，胃肠癌(包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、结肠直肠瘤形成相关的息肉)，胰腺癌，肝癌，泌尿道癌(包括膀胱癌，例如原发性表面膀胱癌、膀胱的侵入性转移细胞癌，肌肉侵入性膀胱癌)，前列腺癌，女性生殖道恶性肿瘤(包括卵巢癌、原发性腹膜上皮赘生物、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、女阴癌、子宫癌以及在卵泡中的实体瘤)，男性生殖道恶性肿瘤(包括睾丸癌和阴茎癌)，肾癌(包括肾细胞癌)，脑癌(包括内发性脑肿瘤、成神经细胞瘤、星形细胞脑肿瘤、神经胶质瘤、侵入中枢神经系统的转移性瘤细胞)，骨癌(包括骨瘤以及骨肉瘤)，皮肤癌(包括恶性黑色素瘤、人皮肤角化细胞进行性肿瘤以及扁平细胞瘤)，甲状腺癌，成视网膜细胞癌，成神经细胞瘤，腹膜渗漏，恶性肿瘤性胸腔积液，间皮瘤，肾母细胞(Wilms′s)瘤，胆囊癌，滋养层赘生物，血管外皮瘤以及卡波西氏(Kaposi′s)肉瘤。
本发明化合物还可用于辐射敏化细胞。可用电磁辐射治疗的疾病包括但不限于，肿瘤性疾病、良性和恶性肿瘤以及癌细胞。辐射治疗采用电磁辐射，例如γ辐射(10-20-10-13m)，X-射线辐射(10-12-10-9m)，紫外光(10nm-400nm)，可见光(400nm-700nm)，红外辐射(700nm-1.0mm)和微波辐射(1mm-30cm)。
目前，某些癌症治疗方案采用电磁辐射例如X-射线辐射活化的辐射增敏剂。X-射线辐射增敏剂的实例包括但不限于下列物质甲硝哒唑、迷索硝唑、去甲基迷索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑(nimorazole)、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FUdR)、羟基脲、顺铂以及治疗上有效的类似物及其衍生物。
癌的光动力疗法(PDT)使用可见光的辐射活化剂。光动力辐射致敏剂的实例包括但不限于下列物质血卟啉衍生物、PHOTOFRIN、苯并卟啉衍生物、NPe6、本卟啉锡(SnET2)、pheoborbide-a、细菌叶绿素-a、萘酞菁、酞菁、酞菁锌以及治疗上有效的类似物和其衍生物。
辐射增敏剂可与治疗有效量的一种或多种除Chk1抑制剂之外的化合物联合施用，这些化合物包括但不限于，促进辐射致敏剂结合靶细胞的化合物、控制治疗剂、营养物和/或氧流向靶细胞的化合物、与或不与另外辐射剂一起作用与肿瘤的化疗剂，或其它用于治疗癌症或其它疾病的治疗上有效的化合物。可与辐射致敏剂联合使用的其它治疗剂或方法的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、氧、卡波金、红细胞输血、全氟化碳(例如FLUOSOLW-DA)、2，3-DPG、BW12C、钙离子通道阻断剂、己酮可可碱、抑制血管生成化合物、肼苯哒嗪以及L-BSO。
可与本发明化合物联合用于治疗癌症的化疗剂包括但不限于烷化剂、抗代谢物、激素及其拮抗剂、放射性同位素、抗体以及天然产物及其组合。例如，本发明抑制剂化合物可与抗生素类如阿霉素和其它蒽环类似物，氮芥类如环磷酰胺，嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶，顺铂、羟基脲、紫杉醇及其天然与合成衍生物等一起使用。作为另一实例，对于混合瘤，例如其中肿瘤包括依赖促性腺激素和不依赖促性腺激素细胞的乳腺癌，所述化合物可与亮丙瑞林或戈舍瑞林(LH-RH的合成肽类似物)联合施用。其它抗瘤方案包括使抑制剂化合物与另一治疗方式一起使用，后者为例如手术或辐射，以下称之为“辅助抗瘤方式”。可用于本发明的其它化疗剂包括激素及其拮抗剂、放射性同位素、抗体、天然产物及其组合。可用在采用本发明化合物的方法的治疗剂的实例列于下表。
尤其可用于与辐射增敏剂联合使用的化疗剂实例包括，例如喜树碱、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、干扰素(α、β、γ)、依立替康、羟基脲、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤、2-氯腺嘌呤核苷、氟达拉滨、氮胞苷、吉西他滨、培美曲塞、白介素2、依立替康、多烯紫杉醇、紫杉醇、托泊替康以及治疗上有效的类似物及其衍生物。
根据本发明，本发明化合物可用于单独与吉西他滨或者进一步与紫杉醇一起联合使用。本发明化合物还可以与仅与培美曲塞或加上顺铂、卡铂或其它铂类联合使用。本发明Chk1抑制剂还可与吉西他滨和培美曲塞联合施用。
与吉西他滨联合施用的本发明Chk1抑制剂可用于治疗，例如胰腺癌、子宫的平滑肌肉瘤、骨肉瘤、转移性的非小细胞肺癌、四肢和躯干软组织肉瘤、肾细胞癌、腺癌以及何杰金氏病。与培美曲塞联合施用的本发明的Chk1抑制剂可用于间皮瘤的治疗。
本发明化合物还可加强药物在治疗以异常细胞增殖为特征的炎症性疾病、病症或障碍中的有效性。可以用本发明化合物治疗的炎症性疾病的实例包括但不限于风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、白癜风、维格内氏肉芽肿病、全身型幼年类风湿性关节炎(JCA)，以及全身性红斑狼疮(SLE)。对关节炎、维格内氏肉芽肿病以及全身性红斑狼疮的治疗经常涉及利用免疫抑制疗法，例如电离辐射、氨甲喋呤以及环磷酰胺。这样的治疗通常直接地或间接地诱导DNA损伤。在损坏的免疫细胞内对Chk1活性的抑制致使细胞对这些标准治疗的控制更敏感。牛皮癣和白癜风通常以紫外辐射(UV)和补骨脂素联合进行治疗。本发明化合物增强UV和补骨脂素杀死作用，增强这种治疗方案的治疗指数。通常，当与免疫抑制药物联合使用时，本发明化合物强化了对炎性疾病细胞的控制。
本发明化合物还可用于治疗以异常增殖细胞为特征的其它非癌性病症。这些病症包括但不限于动脉粥样硬化、再狭窄、血管炎、肾炎、视网膜病、肾病、增殖性皮肤障碍、牛皮癣、瘢痕疙瘩性伤痕、光化性角化病、多形糜烂性红斑、骨质疏松症、包括表皮向下生长在内的过渡增殖性眼部疾病、增殖性玻璃体视网膜病(PVR)、糖尿病性视网膜病、血管增殖性疾病、鱼鳞病或乳头状瘤。
一种优选的以本发明Chk1抑制剂施用的方法描述在Keegan等人于2004年9月17日提交的PCT申请PCT/US2004/30806中，该申请基于2003年9月7日提交的美国临时申请No.60/503,925，本文引用其全部公开内容作为参考。这种抑制异常细胞增殖的方法涉及按时施用Chk1活化剂(例如化疗剂)和本发明Chk1抑制剂。在这种方法中，至少一种Chk1活化剂以足以诱导增殖细胞中基本上同步的细胞周期停滞的剂量和时长施用。当完成基本上的阶段同步时，以至少一种Chk1抑制剂施用以消除细胞周期停滞并诱导治疗性细胞死亡。该方法可与任何Chk1活化剂一起使用，并且在治疗或预防癌症性和非癌症性的异常细胞增殖中得到应用。
异常增殖细胞群可与一种或多于一种的本发明Chk1抑制剂接触。如果使用多种Chk1抑制剂，则可以采用相同或不同方法与这些Chk1抑制剂接触(例如同时或连续、持续相同或不同时间，或利用相同或不同剂型施用)，具体由熟练技术人员，例如主治医师(在人类患者的情况下)或化验员(在体内或离体方法的情况下)决定。
异常增殖细胞群还可以与一种或多种Chk1活化剂接触。如果使用多种Chk1活化剂，这些Chk1活化剂可以采用相同或不同的方法与细胞接触，一般与上面关于Chk1抑制剂所述相同。
本发明化合物还可应用于离体细胞群。例如，本发明化合物可离体使用以获得涉及Chk1抑制剂对给定的适应症、细胞类型、患者施用的时间表和/或剂量和/或其它参数的信息。这些信息能够用于试验目的或在临床上以确定体内治疗的方案。本发明适合的其它离体用途对本领域技术人员是显而易见的。
正如本领域技术人员所认识到的，附加的活性或辅助剂可用于本文所述方法。本发明技术人员还认识到，这里所涉及的治疗延及预防、以及对已经形成的疾病或症状的治疗。
本发明化合物用于治疗的量根据待治疗的病症的性质和患者的年龄和状况而变化，并且最终由医师和兽医确定。但是，对于成人治疗来说，通常施用量在0.001mg/kg至约100mg/kg每天的范围内。所需的剂量可以单一剂量施用，或在适当的间隔以多剂量施用，例如每天二、三、四或更多次的亚剂量施用。实际上，医生确定适合个体患者的给药方案，并且该剂量随具体患者的年龄、体重和反应而变。上述剂量为示例性的一般情况，但是特殊情况也可存在，其中使用更高或更低剂量，并且这样的情况都处于本发明范围之内。
细胞群与本发明Chk1抑制剂的接触可以任何剂量进行足够的时间，以实现基本上解除细胞周期检查点。通常，但是非必须，这样的时间包括高达约72小时至约96小时，具体取决于多种因素。在某些实施方案中，期望或必需在多至约几个星期或以上的时间内施用Chk1抑制剂，具体由主治医师或技术人员的决定。因而，本发明的Chk1抑制剂通常可以施用多至约1小时，多至约2小时，多至约3小时，多至约4小时，多至约6小时，多至约12小时，多至约18小时，多至约24小时，多至约48小时或多至约72小时。本领域技术人员应理解此处表述的范围仅仅是示例性的，并且在所述范围之内和之外的范围和子范围也在本发明的范围之内。
本发明Chk1抑制剂可以剂量的倍数施用。例如，Chk1抑制剂可以下述剂量施用每隔四天将四倍的剂量作为一次剂量递送一天(q4d×4)；每隔三天将四倍的剂量作为一次剂量递送一天(q3d×4)；每隔五天将四倍的剂量作为一次剂量递送一天(qd×5)；每周一次的剂量，持续三周(qwk3)；五次日剂量，休息两天，另一五次日剂量(5/2/5)；或合乎情况而决定的任何剂量方案。
实施例 实施例1 确定Chk1抑制剂IC50值 人Chk1的cDNA已被鉴定和克隆，如之前在1998年9月4日提交的第WO 99/11795号国际申请公布中所述。FLAG标签被同框插入全长Chk1的氨基末端。5′引物含有EcoRI位点、Kozak序列，并且还编码用于利用M2抗体(Sigma，St.Louis，MO)亲合纯化的FLAG标签。3′引物包含SalI位点。PCR扩增链段作为EcoRI-SalI片断被克隆进pCI-Neo(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后作为EcoRI-NotI片断亚克隆进pFastBacI(Gibco-BRL，Bethesda，MD)。如Gibco-BRL Bac-to-Bac手册中所述进行重组杆状病毒的制备，并将其用于感染生长在CCM3培养基(HyClone Laboratories，Logan，UT)中的Sf-9细胞，以便表达加有FLAG-标签的Chk1蛋白。
从经杆状病毒感染的SF9细胞的冷冻纯化加有FLAG-标签的Chk1。将冷冻的细胞块与等体积的2X溶胞缓冲液混合，该缓冲液含有100mMTris-HCl pH 7.5、200mM NaCl、50mM B-甘油磷酸酯、25mM NaF、4mM MgCl2、0.5mM EGTA、0.2％TWEEN-20、2mM钒酸钠、2mM DTT以及蛋白酶抑制剂混合物(Complete mini，Boehringer Mannheim 2000catalog#1836170)。然后，细胞以杜恩斯匀浆器的自由杵匀浆20次，并以48,400x离心1小时。将M2亲合柱以10柱体积的溶液预洗涤，先用50mM甘氨酸(pH 3.5)，接着用20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，轮流三次，以Tris NaCl洗涤结束。随后，以25柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1％TWEEN-20、1mM EGTA、1mM EDTA和1X完全小型蛋白酶片洗涤柱子。然后在4℃下在4小时内将澄清的溶胞产物分批地结合到M2亲合树脂。接着将树脂和溶胞产物的混合物倒入柱子，并收集流出物。将树脂以10柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl和3mM N-辛基糖苷洗涤。接着以6柱体积的含有0.5mg/mL FLAG肽(Sigma，2000 Catalog#F-3290)的冷20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、3mM N-辛基糖苷从柱子中洗脱加有FLAG-标签的Chk1。收集三个组分并分析是否存在加有FLAG-标签的Chk1。
测定Chk1激酶活性，其中包括100ng纯化的FLAG-Chk1(150pmol ATP/min)、20μm Cdc25C肽(H-leu-tyr-arg-ser-pro-ser-met-pro-glu-asn-leu-asn-arg-arg-arg-arg-OH)(SEQ ID NO1)、4μm ATP、2μCi[32P]γ-ATP、20mM Hepes pH 7.2、5mM MgCl2、0.1％NP40和1mMDTT。反应由加入含有ATP的反应混合物起始，在室温下进行10分钟。通过加入磷酸(150mM的终浓度)终止反应，并将反应物转移到磷酸纤维素圆盘。磷酸纤维素圆盘用150mM磷酸洗涤5次并风干。添加闪烁液并在Wallac闪烁计数器中对圆盘计数。该测定在宽浓度范围的Chk1抑制剂化合物存在下温育并且计算化合物的IC50值。置于该测定的所有本发明化合物在测定中都显示出小于约200nM的IC50值。
实施例2 选择性 以Chk1为对比酶和下述蛋白激酶为比较(comparator)酶测试本发明Chk1抑制剂的选择性Cdc2、Chk2、CTAK、EphA1、EphA2、Erk1、FGFR1、FGFR4、IR、JNK1、c-Kit、p38α、p38β、p38δ、Ros、Rse、Rsk2、TrkA、TrkB、蛋白激酶A、蛋白激酶C、pp60v-src、蛋白激酶B/Akt-1、p38MapK、p70S6K、钙钙调素依赖性激酶II和ab1酪氨酸激酶。
依照上述测量化合物相对Chk1的IC50值。利用SelectSmartTM(MDSPharma Servies，Bothell，Washington，USA)专利技术平台测量所述化合物相对比较酶的IC50值，该平台或者具有改进的ELISA方法或者具有荧光极化。测试的所有抑制剂显示出选择性都是受测比较酶的至少20倍。
或者，测定所有这些激酶的IC50的程序已经在文献中描述，包括美国专利公开No.2002-016521A1和1995年1月23日提交的PCT/US95/00912，两者都通过引用并入本文。
实施例3 确定Chk1抑制剂的ECTFS值的基于细胞的检测 本发明Chk1抑制剂的基于细胞的效能通过测定本发明化合物致敏HT29人癌细胞系对吉西他滨的能力进行评估。平均ECTFS值由下述的多次实验推导。因而，通过本文所述的方法合成本发明Chk1抑制剂。将化合物以10mM的原液浓度溶于100％二甲基亚砜(DMSO)并且在-70℃下储存。HT29细胞由ATCC获得并且保持在由包含10％胎牛血清(FCS)的RPMI、青霉素/链霉素、谷氨酸盐和其它辅助材料组成的生长培养基中。吉西他滨盐酸盐由Qventas获得并且以50mM的浓度溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)并且储存在-20℃。3H-胸(腺嘧啶脱氧核苷)由Perkin-Elmer获得。
将HT29细胞以每孔1.3×103的密度接种在96孔培养板(Corning)上并且使其贴壁过夜。第二天，吉西他滨先稀释125倍，接着在1.2ml TiterTubesTM(BioRad)中于生长培养基中稀释5倍。最终的稀释系列浓度为11、20、4、0.8、0.16、0.032、6.4×10-3、1.28×10-4和5.12×10-5nM。然后将稀释的吉西他滨加入细胞2小时。然后洗出吉西他滨并且将本发明Chk1抑制剂加入细胞24小时。在首先于生长培养基中稀释1000倍后，10μM(DMSO原液)本发明Chk1抑制剂连续在1.2ml Titer TubesTM中稀释3倍，达到最终稀释系列2.5、0.83、0.28、0.09和0.03μM。72小时之后，每孔中细胞用1μMCi3H-胸腺嘧啶脱氧核苷标记12小时，然后在-70℃下冷冻。然后解冻所述板并且用Cell MateTM板收获器(Perkin Elmer)收获到96孔滤板(Millipore)上。然后加入30μL MicroscintTM 20(Perkin Elmer)并且在Top Count plate reader(Perkin Elmer)上为该板计数。将数据归一为单独用本发明Chk1抑制剂处理的细胞，然后以吉西他滨浓度(μM)相对细胞生长(100％等于1.0)为作对数/对数图。对于所用各个Chk1抑制剂浓度，推导在90％生长抑制下的提高的倍数敏感性，然后以Chk1抑制剂浓度相对倍数敏感性作图。然后计算ECTFS值。
接受该检测的本发明Chk1抑制剂的ECTFS测量值小于约1000nM。
实施例4 本发明Chk1抑制剂增强癌症治疗对细胞的杀死 为了证明本发明化合物对Chk1的抑制作用使靶细胞对DNA损伤剂的杀死作用敏感，可将细胞在本发明的Chk1抑制剂存在下孵育并暴露于辐射或化学DNA-损伤剂。在37℃下，在含有5％CO2的加湿保温箱中，将以细胞plated at a density of 1000-2000每孔的密度接种在96孔微孔板中的细胞生长在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RMPI 164018小时，测试的孔包括感兴趣的任何细胞或细胞系，例如HeLa、ACHN、786-0、HCT116、HCT15、SW620、HT29、Colo205、SK-MEL-5、SK-MEL-28、A549、H322、OVCAR-3、SK-OV-3、MDA-MB-231、MCF-7、PC-3、HL-60、K562、Bx-PC3、Mia-PaCa2、H810、H226、H2126和MOLT4。指定的所有细胞系指下列人细胞系 HeLa宫颈腺癌 ACHN肾腺癌 786-0 肾腺癌 HCT116 结肠癌 SW620 结肠癌，淋巴结转移 HT-29 结肠直肠腺癌 Colo205结肠腺癌 SK-MEL-5 黑素瘤 SK-MEL-28 恶性黑素瘤 A549 肺癌 H322 支气管肺泡癌 OVCAR-3卵巢腺癌 SK-OV-3卵巢腺癌 MDA-MB-231 乳腺癌 MCF-7 乳腺癌 PC-3 前列腺癌，从转移瘤至骨 HL-60 急性早幼粒细胞性白血病 K562 慢性髓细胞性白血病 MOLT4 急性成淋巴细胞性白血病；T淋 巴母细胞 细胞仅以含有化疗药物的培养基或以含有化疗药物和Chk1抑制剂的培养基处理。在通过测定3H-胸(腺嘧啶脱氧核)苷的摄取以测量生长之前，将细胞孵育约5天。化疗药物包括依托泊苷、阿霉素、顺铂、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)。将细胞的生长抑制至未处理的对照细胞的90％所需要的药物浓度定义为GI90。
本发明化合物可以其它的包括氨甲喋呤、羟基脲、2-氯腺嘌呤核苷、氟达拉滨、氮胞苷以及吉西他滨在内的抗代谢药物进行测试，以评估其增强这些活性剂杀死作用的能力。通过评估与吉西他滨联合增强杀死HT29结肠直肠癌，可将本发明化合物相互比较。
此外，可测试本发明Chk1抑制剂增强通过辐射杀死的能力。
实施例5 测量动物模型中的Chkl抑制剂活性的灵敏性测定 开发了下面的灵敏性测定，以测量啮鼠类动物肿瘤模型中的Chkl抑制剂活性。具体地，除了别的以外，可以使用该测定，以测量Chkl抑制剂阻断肿瘤模型中的Chkl功能的能力，并允许评价促进Chk1抑制剂向分子靶的接近的条件。
使用定量免疫荧光测定，其通过监控丝氨酸10上的组蛋白H3磷酸化(H3-P)(有丝分裂-特异性的事件)来测量有丝分裂指数，测量选择性的Chkl抑制剂取消化疗-诱导的检查点的能力(Ajiro等，J BiolChem.，27113197-201，1996；Goto等，J Biol Chem.，27425543-9，1999)。测定方案如下。切离来自用或未用Chkl活化剂(在本研究中，化疗剂)和/或Chkl抑制剂处理的啮齿类动物的肿瘤，并用石蜡包埋。将肿瘤切成6微米厚的切片，并封固到玻璃载玻片上。通过连续用二甲苯、100％乙醇、95％EtOH、70％EtOH和去离子H2O处理3分钟，从载玻片除去石蜡。然后，在10mM柠檬酸钠中将载玻片加热到95℃进行10分钟，随后为20分钟冷却步骤。用封闭缓冲液(溶于含有0.05％Triton X-100的磷酸缓冲盐水(PBST)中的20％正常人血清和2％牛血清白蛋白)封闭载玻片30分针。在封闭缓冲液中1∶200稀释抗磷酸组蛋白(antipbospho histone)H3抗体(Upstate Biotech，目录号06-570)，并与载玻片一起温育1小时。在PBST中洗涤载玻片3次、5分钟。加入第二抗体驴抗兔罗丹明(Jackson，目录号711-295-152)30分钟。然后，在PBST中洗涤载玻片2次，加入75μM溶于PBS中的0.1μM/ml DAPI(Sigma)，并允许染色30分钟。然后，在PBST中洗涤载玻片另外2次，并用Vectashield(Vector，目录号HJ400)封固。使用荧光显微镜术观察载玻片。使用Metamorph软件(Universal Imaging Corporation，Version 4.6)，定量用H3-P抗体染色的细胞相对于总(DAPI染色的)细胞的百分比。
实施例6 选择性的Chkl抑制剂取消DNA损伤-诱导的G2和S期检查点 以前的研究证实，选择性的Chkl抑制剂基本上取消DNA损伤-诱导的G2/M和S期检查点。在前者中，DNA损伤由电离辐射(IR)诱导，它的靶期是G2期。在后者中，DNA损伤由化疗剂诱导，它的靶期是S期。见公开的美国专利申请公开号2003/0069284和其中引用的文献。
简而言之，通过有丝分裂指数实验，测定IR-诱导的G2 DNA损伤检查点的Chkl抑制剂取消。用800拉德辐照大约1×106HeLa细胞，并在37℃温育7小时。因为这些细胞在功能上是p53阴性的，所以它们排他地停滞在G2。然后，加入洛可达唑至0.5μg/mL的浓度，并在37℃温育15小时(洛可达唑的加入被设计用于捕捉穿过有丝分裂中的G2停滞的细胞，从而阻止它们进一步进入Gl，并允许定量M期细胞)。加入选择性的Chkl抑制剂8小时，通过离心收获细胞，用PBS洗涤一次，然后重新悬浮于2.5mL 75mM KCl中，并再次离心。然后将细胞固定在3mL新制备的冷醋酸∶MeOH(1∶3)中，并在冰上温育20分钟。沉淀细胞，吸出固定溶液，并将细胞重新悬浮于0.5mL PBS中。通过将100μL固定的细胞移液到玻璃显微镜载玻片上，并用1mL固定溶液冲洗样品，制备有丝分裂展开样。然后，使载玻片风干，用Whghts染科(Sigma，St.Louis，MO)染色1分钟，然后在水中洗涤一次，并在50％MeOH中洗涤一次。浓缩的染色体的存在和核被膜的缺乏，指示着有丝分裂的细胞。在有辐照存在下，Chkl抑制剂导致有丝分裂细胞数目的增加，从而证实IR-诱导的G2停滞的取消。该检查点取消会导致细胞周期蛋白B/cdc2的活性的增强，这是细胞进入有丝分裂所必需的。用IR、随后用Chk1抑制剂处理的细胞，因而携带受损的DNA进入有丝分裂。这些实验证实了下述假设，即Chkl参与IR-诱导的G2。
实施例7 在有Chkl活化剂存在下，异种移植肿瘤模型中的肿瘤细胞摄取Chkl抑制剂 在异种移植肿瘤模型中，将HT29结肠癌肿瘤移入裸鼠的胁腹，并允许生长至200mm3。然后在第1天和第4天，间隔3天，用载体、300mg/kgChkl抑制剂、20mg/kg吉西他滨或共同施用300mg/kg Chkl抑制剂和20mg/kg吉西他滨处理小鼠2次。与单独的吉西他滨相比，共同施用Chkl抑制剂和吉西他滨处理携带肿瘤的小鼠导致肿瘤的4天生长延迟。
为了评价Chkl抑制剂向肿瘤组织中的扩散，测量Chkl抑制剂的血浆和组织水平。使用Alzet泵，在连续送递系统中，经24小时时间段，将500mg/kg Chkl抑制剂施用给携带HT29肿瘤的小鼠。取血浆样品，然后收集肿瘤、肾、肝、脾和肺。在1、2、4、8和24小时的时间点收集。提取组织，并定量Chk1抑制剂的水平。该实验证实，Chkl抑制剂穿入正常和肿瘤组织，在肿瘤组织中达到约15μM的水平，且在脾组织中在8小时达到约20μM的峰值。因而，Chkl抑制剂能容易地被增殖细胞摄取，且可以与Chkl激活化疗剂一起，用作治疗增殖性疾病的疗法。
实施例8 用Chkl抑制剂和吉西他滨治疗的肿瘤的剂量反应 为了确定吉西他滨治疗后的Chkl抑制剂的有效剂量和剂量依赖性的检查点取消是否与抗肿瘤活性有关，进行了剂量反应实验。
将HT29肿瘤细胞移入裸鼠，并允许肿瘤发展10天。肿瘤在开始时大约100mm3。用MTD(160mg/kg)的吉西他滨、然后用50mg/kg、200mg/kg或400mg/kg的Chkl抑制剂治疗动物。如基于细胞的测定所确定的，在该实验中的吉西他滨预处理时间是32小时，所述测定指示该时间点对于这类肿瘤是最佳的。在每个治疗方案中的肿瘤体积的分析表明，用所述疗法治疗携带HT29肿瘤的小鼠，会比单独的吉西他滨更强地减慢肿瘤生长，200mg/kg或400mg/kgChkl抑制剂+吉西他滨再次显示了Chkl抑制剂的剂量依赖性效应。
实施例9 确定试剂是否是Chkl活化剂的测定 为了确定试剂是否是Chkl活化剂，可以使用Chk1上的特定磷酸化位点的磷酸特异性的抗体，测量Chkl的磷酸化状态。已经表明，在用电离辐射、紫外线辐射、羟基脲、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、替莫唑胺和吉西他滨处理细胞后，丝氨酸317和345会被磷酸化。Liu等，Genes Dev.141448-59，2000；Zhao等，Mol.Cll Biol.214129-4139，2001；Lopez-Giroma等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9811289-11294，200l；Guo等，Genes Dev.142745-2756，2000；Gatei等，J.Biol.Chem.27814806-14811，2003；Ng等，J Biol Chem.279(10)-.8808-19，2004；Wang等，Natl Acad Sci USA.100(26)15387-92，2003；Stojic等，GenesDev.18(11)1331-44，2004。这些丝氨酸位点会被上游检查点激酶Atm和Atr磷酸化。Liu等，Genes Dev.141448-59，2000；Zhao等Mol.CellBiol.214129-39，2001)。
通过肿瘤细胞的蛋白印迹或免疫组织化学，可以监控候选Chkl活化剂引起的这些位点的磷酸化。例如，可以使用下面的方案来证实，吉西他滨导致丝氨酸345和317处的Chkl激活。用20μM吉西他滨处理HT29细胞2小时。从细胞生长培养基中洗掉吉西他滨，并将细胞培养另外的22小时。制备蛋自裂解物，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将蛋白转移到PVDF膜上，并用对磷酸化的丝氨酸317或345(Cell Signalling)特异性的抗血清(Cell Signalling)探测。蛋白印迹表明，用吉西他滨处理HT29结肠癌细胞，导致丝氨酸317和345的磷酸化。
实施例10 监控Chkl抑制剂引起的Chkl活性的测定 已经发现，Chkl在丝氨酸296处的磷酸化由吉西他滨处理肿瘤细胞刺激，且在该位点的磷酸化由Chkl抑制剂抑制。在该位点的磷酸化不受到渥曼青霉素的抑制，后者抑制Atm和Atr。因此，丝氨酸296的磷酸化不同于丝氨酸317和345的磷酸化。另外，已经发现，在纯化的Chkl制剂中，该位点被磷酸化，从而表明纯化的酶能磷酸化它自身或其它Chkl分子的丝氨酸296。综上所述，这些数据表明丝氨酸296处的磷酸化由Chkl自身进行。因此，该方法可以用于监控Chkl活化剂引起的肿瘤中的Chkl活性。而且，该方法可以用于测量Chkl抑制剂对Chkl激活的抑制。
因而，用20μM吉西他滨处理HT29细胞2小时。从细胞生长培养基中洗掉吉西他滨，并将细胞培养另外的22小时。制备蛋白裂解物，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用对磷酸化的丝氨酸296(Cell Signalling)特异性的抗血清(CellSignalling)探测。蛋白印迹表明，用吉西他滨处理HT29结肠癌细胞，导致丝氨酸296的磷酸化。而且，用选择性的Chkl抑制剂处理HT29细胞15分钟，没有表现出丝氨酸296磷酸化。这些数据表明丝氨酸296磷酸化由Chkl激酶进行。
实施例11 动物肿瘤模型 为了测试本发明Chk1抑制剂在小鼠中增强通过DNA损伤剂杀死肿瘤的能力，建立了采用结肠肿瘤细胞系的异种移植肿瘤模型。5-氟尿嘧啶(5-FU)或吉西他滨可用作DNA损伤剂。HT29和Colo205(人结肠癌)以及H460和Calu-6(非小细胞癌)细胞可用于在6-8周龄雌性胸腺Balb/c(nu/nu)小鼠中培植异种移植肿瘤。小鼠饲养在无病原体的层流室中，自由摄取无菌食品和水。在5％CO2加湿环境中，细胞系在补充有10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1.5mM L-谷氨酸的RPMI1640培养基中生长至亚融合状态。在CMF-PBS中制备单细胞混悬液，并且细胞浓度调节为1×108细胞/mL。在小鼠右侧或右腿皮下(s.c.)总计接种1×107细胞(100μL)。
当肿瘤达到75-100cm3(通常接种后7-11天)，将小鼠随机(5-15小鼠/群)分为四个处理组使用。肿瘤以游标卡尺测量，肿瘤体积使用凭经验推导的以下公式估算肿瘤体积(cm3)＝肿瘤长度(cm)×肿瘤宽度(cm)×肿瘤厚度(cm)/3.3。治疗包括i)以160mg/kg腹膜内(i.p)注射吉西他滨100μL。在以吉西他滨治疗的小鼠中观察到肿瘤生长的延缓。预料对小鼠以160mg/kg吉西他滨联合口服Chk1抑制剂的治疗可减少肿瘤体积并延长寿命。在实验期间，每隔一天监测肿瘤大小。
显然，在不脱离本发明精神和范围的条件下，可对以上描述的本发明作出许多修改和变化。因此，本发明仅为所附的权利要求书所限定。
权利要求
1.具有下述结构式的化合物或其可药用盐、前药或溶剂合物，
其中R1为卤素、C1-3烷基、CN和CF3；
R2为氢、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、卤素、或N(Rb)2，其中Rb独立地为氢或C1-3烷基；
R3为6-或7-元饱和杂环，其中包含一个环状N-Ra基团和第二个环状N-Ra基团、环氧或环硫，其中的Ra独立地为氢、C1-3烷基、CH2CN或CH2CH2CN，而且其中的R3任选被氧代(＝O)取代；
R4为氢、C1-3烷基、OC1-3烷基、SC1-3烷基、N(Rb)2、NRbC(＝O)C1-3烷基、或5-或6-元饱和杂环，其中包含一个N-Ra基团和任选被1-3个C1-3烷基基团取代的环；
或R2和R4与和其连接的碳一起形成5-至7-元饱和碳环状环；
R5为氢或卤素，
条件是R2和R4中至少一个不是氢，而且当R5为卤素时，R2或R4为氢。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1为氯、甲基、CN或CF3。
3.如权利要求1所述的化合物，其中R2为氢、甲基、乙基、氯、溴、二甲基氨基、氰基或甲氧基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中R2不是氢。
5.如权利要求1所述的化合物，其中R4为氢、甲基、氯、甲氧基、氟、二甲基氨基、-SCH3、异丙氧基、-NHC(＝O)CH(CH3)2、-NHC(＝O)CH3、
或
6.如权利要求1所述的化合物，其中R4为甲基、氯或甲氧基。
7.如权利要求1所述的化合物，其中R5为卤素。
8.如权利要求7所述的化合物，其中R5为氟。
9.如权利要求7所述的化合物，其中R2或R4为氢。
10.如权利要求9所述的化合物，其中R4为氢。
11.如权利要求1所述的化合物，其中R2和R4一起形成5元或6元饱和杂环。
12.如权利要求1所述的化合物，其中R3选自下述基团
和
13.一种具有下述结构式的化合物或其可药用盐、前药或溶剂合物
其中R1为卤素、C1-3烷基、CN或CF3；
R2为氢、C1-3烷基、CN、OC1-3烷基、卤素、或N(Rb)2其中Rb独立地为氢或C1-3烷基；
R3为6-或7-元饱和杂环，其中包含一个环状N-Ra基团或者第二个环状N-Ra基团、环氧或环硫，其中的Ra独立地为氢、C1-3烷基或CH2CN，而且其中的R3任选被氧代(＝O)取代；
R4为氢、C1-3烷基、OC1-3烷基或卤素；
或R2和R4与和其连接的碳一起形成5-至7-元饱和碳环状环；
条件是R2和R4中至少一个不是氢。
14.如权利要求13所述的化合物，其中R1为氯、甲基、CN或CF3。
15.如权利要求13所述的化合物，其中R2为甲基、乙基、氯、溴、氰基、二甲基氨基或甲氧基。
16.如权利要求13所述的化合物，其中R4为甲基、氯或甲氧基。
17.如权利要求13所述的化合物，其中R2和R4与和其连接的碳一起形成6元饱和杂环。
18.如权利要求13所述的化合物，其中R3选自下述基团
19.如权利要求1所述的具有下述结构的化合物及其混合物，或其盐、溶剂合物或前药，

20.如权利要求13所述的具有下述结构的化合物及其混合物，或其盐、溶剂合物或前药，
21.如权利要求13所述的化合物，其中R1为甲基或氰基；R2为甲基、氰基、氯或溴；R3为
22.如权利要求21所述的化合物，其中R4为氢。
23.如权利要求21所述的化合物，其中R4为甲基或乙基。
24.如权利要求21所述的化合物，其中R4为氯。
25.具有下述结构的化合物及其混合物，或其盐、溶剂合物或前药，
26.抑制细胞中检查点激酶1的方法，包括使所述细胞与有效量的权利要求1或权利要求13化合物接触的步骤。
27.使因医学适应症而接受化疗或放疗治疗的个体的细胞敏化的方法，包括给所述个体施用与化疗剂、放疗剂或其混合物联合的治疗有效量的权利要求1或权利要求13化合物。
28.如权利要求27所述的方法，进一步包括给所述的个体施用细胞因子、淋巴因子、生长因子、其它造血因子或其混合物。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述化疗剂选自烷化剂、抗代谢物、激素或其拮抗剂、放射性同位素、抗体及其混合物。
30.如权利要求27所述的方法，其中放疗剂选自γ辐射、X-射线辐射，紫外光、可见光、红外辐射和微波辐射。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述的病症选自结肠直肠癌、头颈部癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、外阴癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肾细胞癌、卵巢癌、脑癌、骨肉瘤以及肺癌的癌症。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述病症选自粘液瘤和圆形细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性癌、尤文氏肉瘤、转移癌、淋巴性转移、鳞状细胞癌、食道鳞状细胞癌、口腔癌、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病、渗出性淋巴瘤(基于体腔的淋巴瘤)、胸腺淋巴瘤肺癌、小细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肾上腺皮质癌、产生ACTH的肿瘤、非小细胞癌、乳腺癌、小细胞癌、导管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、结肠直肠瘤形成相关的息肉、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、原发性表面膀胱肿瘤、膀胱的侵入性转移细胞癌、肌肉侵入性膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性腹膜上皮赘生物、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌以及在卵泡中的实体瘤、睾丸癌、阴茎癌、肾细胞癌、内发性脑肿瘤、成神经细胞瘤、星形细胞脑肿瘤、神经胶质瘤、侵入中枢神经系统的转移性瘤细胞、骨瘤以及骨肉瘤、恶性黑色素瘤、人皮肤角化细胞进行性肿瘤、扁平细胞癌、甲状腺癌、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、腹膜渗漏、恶性肿瘤性胸腔积液、间皮瘤、肾母细胞瘤、胆囊癌、滋养层赘生物、血管外皮瘤以及卡波西氏肉瘤的癌症。
33.如权利要求27所述的方法，其中所述治疗为对选自类风湿性关节炎、牛皮癣、白癜风、韦格内氏肉芽肿病以及全身性红斑狼疮的炎症施用。
34.如权利要求27所述的方法，其中权利要求1所述的化合物对Chk1的抑制相对于蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src抑制Chk1具有至少20倍的选择性。
35.如权利要求27所述的方法，其中权利要求1所述的化合物对Chk1的抑制相对于蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src抑制Chk1具有至少75倍的选择性。
36.如权利要求27所述的方法，其中权利要求1所述的化合物对Chk1的抑制相对于蛋白激酶A、蛋白激酶C、cdc2和pp60v-src抑制Chk1具有至少100倍的选择性。
37.一种抑制异常细胞增殖的方法，包括让含有异常增殖细胞的细胞群与Chk1活化剂接触以使所述异常增殖细胞之间的细胞周期停滞基本同步，并且随后让所述细胞群与权利要求1或权利要求13的化合物接触以使所述细胞周期停滞基本解除。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述Chk1活化剂包括至少一种化疗剂。
39.如权利要求37所述的方法，其中Chk1活化剂包括离子化或紫外辐射。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述离子辐射与辐射增敏剂、光敏剂或其混合物联合施用。
41.如权利要求37所述的方法，其中所述异常增殖细胞是非癌性细胞。
42.权利要求1或13所述化合物用于制造抑制检查点激酶1的药物的用途。
43.权利要求1或13所述化合物用于制造使个体中细胞敏化的药物的方法，所述个体因医学适应症而接受化疗或放疗治疗。
44.权利要求1或13所述化合物用于制造抑制包含异常增殖细胞的细胞群中的异常细胞增殖的药物的用途。
45.权利要求1或13所述化合物用于制造在细胞内病症的治愈性或预防性治疗的药物的用途，其中所述病症中检查点激酶1的抑制具有治疗益处。
46.人类药物用途的制品，其包含
(a)包含权利要求1或13化合物的药物组合物；
(b)包装说明书，规定该组合物用于治疗包括异常细胞增殖在内的适应症，和
(c)容器。
47.人类药物用途制品，其包含
(a)包含权利要求1或13化合物的药物组合物；
(b)包装说明书，规定该组合物在治疗与DNA损伤或DNA复制有关的适应症中可用作化学增敏剂或辐射增敏剂；
(c)容器。
全文摘要
本发明公开了一种可用于与DNA损伤和DNA复制有关的疾病和病症的治疗的取代的脲化合物。本发明还公开了制备这些化合物的方法以及它们例如在治疗癌症和其它的以DNA复制、染色体分离或细胞分裂中的缺陷为特征的疾病中用作治疗剂的用途。
文档编号C07D403/12GK101151259SQ200680010150
公开日2008年3月26日 申请日期2006年3月29日 优先权日2005年3月29日
发明者F·迪亚兹, F·S·法鲁兹, R·霍尔库姆, E·A·凯西奇, H·C·奥伊, A·鲁道夫, F·斯塔彭贝克, E·托尔塞特, J·J·瓜迪诺, K·L·费舍尔, A·W·库克 申请人:艾科斯有限公司