专利名称：：甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种针对多种甲氧基有机磷农药残留检测的广谱特异性多克隆抗体及其在蔬菜农残检测中的应用。
背景技术：
：有机磷农药具有杀虫谱广、活性高、残留量低等特点，在农业、林业、卫生业等领域得到了广泛应用，其在农产品中的残留给消费者的食用安全带来严重后果。目前，有机磷农药残留己成为我国食品安全中最突出的问题之一，亟需建立一种快速高效的检测方法。有机磷农药残留的分析方法主要是采用高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)，尽管这些方法具有可靠、高灵敏度的优点，但样品检测费用相对昂贵、前处理过程复杂、对仪器设备要求较高、需要消耗大量的有机溶剂，易对环境造成二次污染，并且不适合大批量样品的检测。免疫分析方法作为一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测方法已经逐步得到广泛认同。已建立的有机磷杀虫剂免疫检测方法主要是针对马拉硫磷、甲基对硫磷、倍硫磷等单药的检测，但是食品中总是多种农药同时存在。建立利用广谱特异性抗体检测多种农药残留的方法具有重要意义当样品中某类农药残留的总量低于其中某种农药的最大残留限量时，该样品即不需进一步采用气相色谱或液相色谱进行检测确认，由此可节省大量的成本和时间。农药广谱特异性抗体研究较少，目前仅有针对乙氧基有机磷农药、拟除虫菊酯类农药广谱特异性抗体制备的研究和报道，而采用磷酸酯作为半抗原，尤其是采用S-羧乙基O，O-二甲基硫代磷酸酯作为半抗原制备针对甲氧基有机磷农药的广谱特异性抗体尚未见报道。
发明内容本发明的目的在于针对目前大多农药残留免疫检测方法所存在的只适用于单一农药残留检测的问题，为节省农药残留检测时间以及检测成本，本发明提供了一种可同时检测多种甲氧基有机磷农药残留的广谱特异性多克隆抗体，并将其成功应用于蔬菜样品的检测中。本发明的目的是这样实现的一种甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体，其特征在于:，特异性多克隆抗体由下列方法获得以磷酸酯类为半抗原，通过与牛血清蛋白BSA偶联获得抗原，免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。在本发明中所述的磷酸酯为S-羧乙基O，O-二甲基硫代磷酸酯。在本发明中所述的的S-羧乙基O，O-二甲基硫代磷酸酯是这样合成的:4g45%的O,O-二甲基硫代磷酸钠水溶液中加入0.58g丙烯腈和18mL6%的氢氧化钾水溶液，混合液在油浴下回流4h;反应结束后冷却至室温，反应液过732型强离子树脂酸化；真空条件下挥干溶剂，残留过柱色谱进行分离后获得，人工合成的S-羧乙基O，O-二甲基硫代磷酸酯为黄色油状物，该物质通过薄层层析TLC，采用乙酸乙酯石油醚=1:2作为展开剂获得的Rf值为0.31。在本发明中所述的与牛血清蛋白BSA偶联制备抗原的具体方法为称取0.04~0.06mmol的半抗原和0.10~0.2mmol的N-羟基琥珀酰亚胺NHS,溶于0.30.5mL的DMF中；再称取0.05~0.15mmol环二己基碳酰亚胺DCC溶于0.3~0.5mL的DMF中；合并以上两种溶液，室温下至少搅拌反应3h后离心上述反应液，除去沉淀二环己基脲，获得上清液；称取3545mgBSA，溶于8~12mL的碳酸盐缓冲溶液中，获得反应液；将获得的反应液置于磁力搅拌器上，4'C下将获得的上清液滴加到反应液中，磁力搅拌过夜；反应结束后装入透析袋，4'C下超纯水中透析，透析结束后获得抗原，分装并保存于-18'C以下备用。在本发明中在制备抗原的优选方案为称取0.05mmol的半抗原和0.15mmol的N-羟基琥珀酰亚胺NHS,溶于0.4mL的DMF中；再称取0.1mmol环二己基碳酰亚胺DCC溶于0.4mL的DMF中；合并以上两种溶液，室温下搅拌反应4h后离心上述反应液，除去沉淀二环己基脲，获得4:清液；称取40mgBSA，溶于lOmL的碳酸盐缓冲溶液中，获得反应液；将获得的反应液置于磁力搅拌器上，4t下将获得的上清液滴加到反应液中，磁力搅拌过夜；反应结束后装入透析袋，4'C下超纯水中透析三天，期间每四小时换水一次，透析结束后获得抗原，分装并保存于-2(TC冰箱中备用。一种如上所述甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体的应用，其特征在于将所述多克隆抗体采用间接竞争性ELISA对甲氧基有机磷农药的残留进行检测，检测中使用的包被抗原为半抗原通过活性酯法或混合酸酐法与OVA的偶联物。在特异性多克隆抗体的应用中所述的对甲氧基有机磷农药的残留进行检测是指对蔬菜样品中甲氧基有机磷农药的残留进行检测。在特异性多克隆抗体的应用中对蔬菜样品中甲氧基有机磷农药的残留进行检测步骤是将蔬菜样品切碎，在1g切碎的蔬菜样品中加入2g甲醇，室温下振荡2h进行提取，提取液在5000ipm条件下离心10min。取上清液挥干，残留溶于lmL5X甲醇一PBS溶液中，然后将所述多克隆抗体采用间接竞争性ELISA进行检测。在特异性多克隆抗体的应用中包被抗原是通过活性酯法将半抗原与OVA偶联，合成方法是称取0.05mmol的半抗原和0.15mmol的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶于0.4mL的DMF中；再称取0.1mmol环二己基碳酰亚胺DCC溶于0.4mL的DMF中；合并以上两种溶液，室温下搅拌反应4h后离心上述反应液，除去沉淀二环己基脲，获得上清液；称取40mgOVA，溶于10mL的碳酸盐缓冲溶液中，获得反应液；将获得的反应液置于磁力搅拌器上，4。C下将获得的上清液滴加到反应液中，磁力搅拌过夜；反应结束后装入透析袋，4x:下超纯水中透析三天，期间每四小时换水一次，透析结束后获得包被抗原，分装并保存于-2(TC冰箱中备用。在特异性多克隆抗体的应用中被测的甲氧基有机磷农药残留是指马拉硫磷、或乐果、或稻丰散、或亚胺硫磷、或杀扑磷、或杀螟硫磷、或甲基对硫磷、或倍硫磷的农药残留。本发明的优点在于在比较分析多种有机磷类农药结构的基础上，根据其共同结构特点设计并自主合成了半抗原S-羧乙基O，O-二甲基硫代磷酸酯，所合成的半抗原具有多种甲氧基有机磷类农药的通用结构o,o-二甲基硫代磷酸酯，该半抗原与载体蛋白偶联后免疫动物，所获得的广谱特异性抗体对马拉硫磷、乐果、稻丰散、亚胺硫磷、杀扑磷、杀螟硫磷、甲基对硫磷、倍硫磷等多种甲氧基有机磷类农药均有选择性，可用于蔬菜及其他食品中多种甲氧基有机磷类农药的筛选检测，充分显示了免疫检测技术的快速、简便的特点。图1是半抗原的^NMR谱图；图2是半抗原的13CNMR谱图；图3是半抗原的MS谱图；图4是半抗原、抗原的紫外谱图；图5是抗原的红外谱图。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步的描述。实施例l.半抗原的合成4g45%的O,O-二甲基硫代磷酸钠水溶液中加入0.58g丙烯腈和18mL6%的氢氧化钾水溶液，混合液在油浴下回流4h。反应结束后冷却至室温，反应液过732型强离子树脂酸化。真空条件下挥干溶剂，残留过柱色谱进行分离，得到黄色油状物为目标产物。该物质通过薄层层析TLC，采用乙酸乙酯石油醚=1:2作为展开剂获得的Rf值为0.31。图1谱图解析为&NMR(DMSO-d6)S:2.18(t,J=6.3Hz,2H,CH2CO),2.31(t,J=6.6Hz,2H,SCH2)，3.35(d,J=14.1Hz，6H，CH30);图2谱图解析为13CNMR(DMSO-d6)5:37.99(CH2CO)，51.19(d，J=2.7Hz，SCH2)，57.45(d，J-30.9,CH30)，173.55(COOH);图3谱图解析为MSm/z:230[M],213[M-OH],182[M-Op-OCH3]，125[M-SCH2CH2COOH]。以上说明半抗原合成成功。实施例2抗原及包被抗原的合成抗原活性酯法称取0.05mmol(相当于10.8mg)半抗原和0.15mmol(相当于15.5mg)N-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶于0.4mL的DMF中，称取0.1mmol(相当于20.6mg)环二己基碳酰亚胺DCC溶于0.4mL的DMF中，合并以上两种溶液，室温下搅拌反应4h后离心上述反应液，除去沉淀二环己基脲，上清液；称取40mgBSA，溶于10mL的碳酸盐缓冲溶液中，为反应液；将反应液置于磁力搅拌器上，4'C下将上清液滴加到反应液中，磁力搅拌过夜。反应结束后，将反应液装入透析袋，4。C超纯水中透析三天，每四小时换水一次。透析结束后分装保存于-20'C冰箱中。混合酸酐法称取0.05mmol(相当于10.8mg)半抗原，溶于0.6mL二甲基甲酰胺DMF，加入13Kd三正丁胺，冷却至0。C后加入8^l氯甲酸异丁酯，搅拌60min，为上清液；称取40mgBSA，溶于8mL的PBS(pH=7.4)溶液中，为反应液；将反应液置于磁力搅拌器上，4-C下将上清液滴加到反应液中，磁力搅拌过夜。反应结束后，反应液处理同活性酯法。包被抗原包被抗原与抗原的合成方法相同，其区别仅在于包被抗原是半抗原与OVA的偶联物，抗原是半抗原与牛血清蛋白BSA的偶联物。合成效果半抗原与牛血清蛋白BSA的偶联物经透析纯化后，通过紫外-可见光谱扫描以及红外光谱扫描鉴定偶联是否成功。经紫外-可见光谱连续波长(200400nm)扫描，抗原的吸收谱图与相应的载体蛋白相比发生变化(见图4)。载体蛋白在278279nm之间有一波峰，抗原波峰消失，二者在236run处吸收峰有明显叠加现象。由此可初步判断半抗原与载体蛋白偶联成功。偶联物的红外光谱图与相应载体蛋白相比亦发生了明显的变化(见图5)。载体蛋白呈现蛋白质类共同的谱带，如3300cm"的氢键-NH-基团及在1600cm"附近的酰胺谱带I，1540cm"的酰胺谱带IT,但在2920cm"和2840cm'1处仅有微弱的-CH2-和-CH3伸展谱带，这与蛋白舾分子中疏水性较强的一些氨基酸侧链的非极性甲基和亚甲基团借助疏水键和范得华力自相粘附聚集包在分子内部维持蛋白质构型有关。偶联物与载体蛋白的谱带相似，但2920cnT1和2840cm"出现明显的-CH2-和-CH3强吸收带，半抗原分子中没有参加反应的-CH2-和-<:113基团在偶联物外侧对红外光谱表现出伸展振动的强烈效应。此外，偶联物1650cm—1处的吸收谱带明显增强，该处为C=0伸縮振动的强吸收带，应为半抗原与载体蛋白偶联后分子中酰胺键增加使然。由此佐证人工抗原偶联成功。由于包被抗原与抗原在合成的过程中的区别仅在于采用了不同的载体蛋白，将半抗原与OVA的偶联物经透析纯化后，通过紫外-可见光谱扫描以及红外光谱扫描鉴定，获得与图4、图5类似的紫外谱图和红外谱图。实施例3多克隆抗体制备根据实施例二方法制备的两种抗原各免疫3只新西兰大白兔，具体免疫方案如表1。表1制备广谱^降异性抗体动物免疫方案<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4间接ELISA检测效价1、包被％微孔板内每孔加入浓度为2ng/mL的包被液100pl(将实施例2中采用活性酯法或混合酸酐法合成的包被抗原溶于0.1M的碳酸盐缓冲液中形成包被液)，4'C过夜；2、封闭弃去包被液，96微孔板用PBST(含0.05%Tween-20的10mM磷酸盐缓冲液)洗涤三次，拍干，每孔加入200(il封闭液(1。/。OVA的磷酸盐缓冲液)，37'C温育lh;3、加样弃去封闭液，96微孔板用PBST洗涤三次,拍干，每孔加入100nl抗体血清稀释液(将实施例2中采用活性酯法或混合酸酐法合成的抗原免疫新西兰大白兔获得的抗体血清)，37。C温育2h;4、加酶标二抗96微孔板用PBST洗涤三次，拍干，每孔加入100酶标二抗稀释液(1:5000，酶标二抗溶于1%OVA的PBS缓冲液中)，37°C温育lh;5、加底物液96微孔板用PBST洗漆三次,每孔加入底物液(100nl的10mg/mLTMB，25^l的0.65%H202,溶于9.875mL的柠檬酸盐缓冲液，37。C温育15min;6、终止反应96微孔板每孔中加入50^12M硫酸溶液终止反应；7、读数，96微孔板置于酶标仪上，在450nm波长下测定各孔的光密度值。实施例5,ELISA检測抑制率1、包被96微孔板内每孔加入浓度为2ug/mL的包被液100(将实施例2中采用活性酯法或混合酸酐法合成的包被抗原溶于0.1M的碳酸盐缓冲液中形成包被液)，4'C过夜；2、封闭弃去包被液，96微孔板用PBST(含0.05%Tween-20的lOmM磷酸盐缓冲液)洗涤三次，拍干，每孔加入200^封闭液(1。/。OVA的磷酸盐缓冲液)，37'C温育lh;3、加样弃去封闭液，96微孔板用PBST洗涤三次，拍干，每孔加入100pl稀释液(其中包括50pl将实施例2中采用活性酯法或混合酸酐法合成的抗原免疫新西兰大白兔获得的血清稀释液和50nl样品稀释液混合)，37。C温育2h;4、加酶标二抗96微孔板用PBST洗涤三次,拍干，每孔加入100nl酶标二抗稀释液(l:5000，酶标二抗溶于l%OVA的PBS缓冲液中)，37°C温育lh;5、加底物液9《微孔板用PBST洗涤三次,每孔加入底物液(lOOpl的10mg/mLTMB，25|il的0.65%H202,溶于9.875mL的柠檬酸盐缓冲液，37。C温育15min;6、终止反应96微孔板每孔中加入50pl2M硫酸溶液终止反应；7、读数，96微孔板置于酶标仪上，在450nm波长下测定各孔的光密度值。实施例6.抗体选择以及交叉反应率抗体亲和性以抗体的效价来表示，效价越高则亲和性越强。利用非竞争ELISA程序将六种抗血清用两种包被原分别进行检测，确定抗体效价及最佳包被原-抗体组合，结果见表2。由表2可以看出，混合酸酑法合成抗原免疫动物的效果与活性酯法相比较差，可能由于混合酸酐法制备的抗原不能使抗原决定簇充分暴露，从而获得的抗体亲和力较低。活性酯法抗原产生的抗体中Ab05号抗体效价最高，为256000，选择该抗体进行下一步研究。该抗体对混合酸酐法制备的包被原识别能力相对较弱，故确定采用活性酯法制备的包被原进行下一步实验。表2抗体效价测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在表2中效价测定时两种包被抗原浓度均为2pg/mL;效价以大于阴性血清吸光度值2.1倍计(P/N^2.1);a—半抗原与载体蛋白偶联方法为混合酸酐法；b—半抗原与载体蛋白偶联方法为活性酯法。利用最佳抗体一包被原组合(Ab05,包被原nb)分析不同有机磷农药对该抗体-包被原结合反应的抑制作用。首先以马拉硫磷为对象，建立标准曲线。标准曲线符合四参数logistic函数，公式为y={(A-D)/[1+(x/C)AB]}+D,A代表对照样的最大吸光值，B代表曲线拐点的斜率，C代表抑制率为50%时待分析物的浓度，D代表无限小浓度时的最小吸光值。选取9种常见有机磷杀虫剂，包括乐果、稻丰散、亚胺硫磷、杀扑磷、杀螟硫磷、甲基对硫磷、倍硫磷、，对硫磷、毒死蜱，将药剂抑制率对药剂浓度进行分析，得出标准曲线及IC50值，并计算马拉硫磷的IC50与各药剂IC50的百分比值，即交叉反应率。多种有机磷农药的标准曲线、l50值及交叉反应率见表3。表3多种有机磷农药抑制方程及交叉反应率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从表3可以看出，所得抗体对多种有机磷农药产生了识别反应。抗体Ab05对马拉硫磷、乐果有较强的亲和力，对稻丰散、亚胺硫磷、杀扑磷、杀螟硫磷、甲基对硫磷、倍硫磷等多种有机磷杀虫剂均产生了识别作用。本方法对马拉硫磷、乐果、稻丰散、亚胺硫磷、杀扑磷的亲和力高，而对杀螟硫磷、甲基对硫磷、倍硫磷的亲和力较弱(IC5()>200(ig/L)。对二者结构进行比较，二者都有(CH30)2P^S基团存在，但前者含磷硫单键基团，而后者在相同位置为磷氧单键基团，这说明磷硫单键基团在抗原激活免疫系统产生抗体过程中具有重要影响。抗体对对硫磷、毒死蜱几乎没有识别作用(IC5o>1000pg/L)，这说明(CH30)2P-S基团在抗原激活免疫系统产生抗体过程中起了决定性作用。实施例7.回收率蔬菜样品购于当地超市，切碎。马拉硫磷以最终浓度为50、100、200ng/g添加于样品中，放置六小时。样品前处理过程为1g样品中加入2g甲醇，室温下振荡2h进行提取，提取液在5000rpm条件下离心10min。取上清液挥干，残留溶于lmL5X甲醇一PBS溶液中，ELISA进行检测。回收率见表4。由表4可以看出，马拉硫磷的回收率在81.3—88.4%之间，获得了较好的效果。_表4马拉硫磷在蔬菜样品中的添加回收率_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>其他有机磷农药如乐果、稻丰散、亚胺硫磷、杀扑磷在蔬菜中的添加回收率见表5。甲氧基有机磷农药在蔬菜样品中添加量为100、200ng/g。计算回收率时，实际回收率通过相对回收率与交叉反应率的比值得到。由结果可以看出，该方法可应用于甲氧基有机磷农药残留的筛选中。表5甲氧基有机磷农药在蔬菜样品中的添加回收〗农药添加量实测值相对回收率(％)Mean±S.D.(%)实际回收率(％)乐果10098.6107.8跳898.6107.8100.8102.4±楊98.3±4.61200226.8210.6217.2113.4105.3108.6109.1±4.07104.7±3.91以上各实施例不是对本发明的具体限制，具体实施时，也可以采用磷酸酯类的S-羧甲基O，O-二甲基硫代磷酸酯、或S-乙酰基-4-氨基苯-0，O-二甲基二硫代磷酸酯等为半抗原，在我们前期筛选试验中，虽然采用它们进行相同的试验最终获得抗体效价不如S-羧乙基O,O-二甲基硫代磷酸酯，但是也能获得可以检测多种甲氧基有机磷农药残留的广谱特异性多克隆抗体，也能实现本发明提出的将这些多克隆抗体应用于蔬菜样品检测的目的。'稻丰散100200亚胺硫磷10032.025.826.655.864.261.028.1±3.3782.4±9.8830.2±2.1288.6±6.二17.7±1.7094.1±9.0420032.416.216.3±2.2586.7±11.9728.214.137.218.6杀扑磷1009.89.812.1±2.7777.1±17.6415.215.211.411.413.0±1.7682.8±11.21力J力32291523337:力11T石4-CJ2232o46111o46R仏义权利要求1、一种甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体，其特征在于特异性多克隆抗体由下列方法获得以磷酸酯类为半抗原，通过与牛血清蛋白BSA偶联获得抗原，免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。2、根据权利要求1所述的甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体，其特征在于所述的磷酸酯为S-羧乙基O，O-二甲基硫代磷酸酯；将半抗原通过活性酯法或混合酸酐法与牛血清蛋白BSA偶联获得抗原。3、根据权利要求2所述的甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体，其特征在于所述的的S-羧乙基O，O-二甲基硫代磷酸酯是这样合成的4g45%的O，O-二甲基硫代磷酸钠水溶液中加入0.58g丙烯腈和18mL6%的氢氧化钾水溶液，混合液在油浴下回流4h;反应结束后冷却至室温，反应液过732型强离子树脂酸化；真空条件下挥干溶剂，残留过柱色谱进行分离后获得，人工合成的S-羧乙基O，O-二甲基硫代磷酸酯为黄色油状物，该物质通过薄层层析TLC，采用乙酸乙酯石油醚=1:2作为展开剂获得的Rf值为0.31。4、根据权利要求2所述的甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体，其特征在于所述的活性酯法是称取0.04-0.06mmol的半抗原和0.10-0.2mmol的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶于0.30.5mL的DMF中；再称取0.050.15mmol环二己基碳酰亚胺DCC溶于0.3~O.5mL的DMF中；合并以上两种溶液，室温下至少搅拌反应3h后离心上述反应液，除去沉淀二环己基脲，获得上清液；称取3545mgBSA，溶于8~12mL的碳酸盐缓冲溶液中，获得反应液；将获得的反应液置于磁力搅拌器上，4。C下将获得的上清液滴加到反应液中，磁力搅拌过夜；反应结束后装入透析袋，4'C下超纯水中透析，透析结束后获得抗原，分装并保存于-18"C以下备用。5、根据权利要求4所述的甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体，其特征在于所述的活性酯法的优选方案是称取0.05mmol的半抗原和0.15mmol的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶于0.4mL的DMF中；再称取0.1mmol环二己基碳酰亚胺DCC溶于0.4mL的DMF中；合并以上两种溶液，室温下搅拌反应4h后离心上述反应液，除去沉淀二环己基脲，获得上清液；称取40mgBSA，溶于10mL的碳酸盐缓冲溶液中，获得反应液；将获得的反应液置于磁力搅拌器上，4'C下将获得的上清液滴加到反应液中，磁力搅拌过夜；反应结束后装入透析袋，4t:下超纯水中透析三天，期间每四小时换水一次，透析结束后获得抗原，分装并保存于-2(TC冰箱中备用。6、一种如权利要求1或2所述甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体的应用，其特征在于将所述多克隆抗体采用间接竞争性ELISA对甲氧基有机磷农药的残留进行检测，检测中使用的包被抗原为半抗原通过活性酯法或混合酸酑法与OVA的偶联物。7、根据权利要求6所述的甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体的应用，其特征在于所述的对甲氧基有机磷农药的残留进行检测是指对蔬菜样品中甲氧基有机磷农药的残留进行检测。8、根据权利要求6所述的甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体的应用，其特征在于对蔬菜样品中甲氧基有机磷农药的残留进行检测步骤是将蔬菜样品切碎，在lg切碎的蔬菜样品中加入2g甲醇，室温下振荡2h进行提取，提取液在5000rpm条件下离心10min，取上清液挥干，残留溶于lmL5%甲醇一PBS溶液中，然后将所述多克隆抗体采用间接竞争性ELISA进行检测。9、根据权利要求6所述的甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体的应用，其特征在于包被抗原是通过活性酯法将半抗原与OVA偶联，合成方法是称取0.05mmol的半抗原和0.15mmol的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶于0.4mL的DMF中再称取0.1mmol环二己基碳酰亚胺DCC溶于0.4mL的DMF中；合并以上两种溶液，室温下搅拌反应4h后离心上述反应液，除去沉淀二环己基脲，获得上清液；称取40mgOVA，溶于10mL的碳酸盐缓冲溶液中，获得反应液；将获得的反应液置于磁力搅拌器上，4'C下将获得的上清液滴加到反应液中，磁力搅拌过夜；反应结束后装入透析袋，4。C下超纯水中透析三天，期间每四小时换水一次，透析结束后获得包被抗原，分装并保存于-20'C冰箱中备用。10、根据权利要求6所述的甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体的应用，其特征在于被测的甲氧基有机磷农药残留是指马拉硫磷、或乐果、或稻丰散、或亚胺硫磷、或杀扑磷、或杀螟硫磷、或甲基对硫磷、或倍硫磷的农药残留。全文摘要本发明涉及一种甲氧基有机磷农药广谱特异性多克隆抗体及其应用，其特征在于特异性抗体由下列方法获得以磷酸酯类为半抗原，通过与牛血清蛋白BSA偶联制备抗原，免疫新西兰大白兔制备成多克隆抗体。将所述多克隆抗体采用间接竞争性ELISA对甲氧基有机磷农药的残留进行检测，检测中使用的包被抗原为半抗原通过活性酯法或混合酸酐法与OVA的偶联物。本发明的优点在于制备的广谱特异性抗体可同时对蔬菜等食品中多种甲氧基有机磷农药进行检测，大大节省了样品检测的时间和成本，充分显示了免疫检测技术的快速、低成本的特点。文档编号C07K16/44GK101333257SQ200810020908公开日2008年12月31日申请日期2008年8月7日优先权日2008年8月7日发明者余向阳,媛刘,刘贤金,颖梁申请人:江苏省农业科学院