防止病毒与dlc8结合的新型抗病毒肽的制作方法

专利名称：：防止病毒与dlc8结合的新型抗病毒肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型抗病毒化合物开发以及它们在预防或治疗动物或人类中的病毒感染中的应用的
技术领域：
。
背景技术：
：病毒是需要整合特定细胞功能以便可以成功地进行它们在细胞内的复制循环的细胞内寄生虫。已经证明动力蛋白在不同病毒模型如狂犬病毒、人单纯疱疹病毒、I型或人免疫缺陷病毒中在不同的病毒感染步骤中具有相关作用。动力蛋白是微管动力蛋白，其干预与微管和内体途径联系的细胞内转运，并且是在其它功能中细胞内信号翻译的不同途径的调控子。病毒利用动力蛋白用于它们的内在化和细胞内转运，用于形成病毒工厂，在那里将产生新的病毒体，并且用于协调这些和其它过程必需的细胞信号传导。特别地，非洲猪瘟病毒(ASFV)的p54蛋白与一种细胞蛋白相互作用，该种细胞蛋白作为称为动力蛋白的微管动力复合体的一部分并且其功能主要与细胞内转运相关[1]。在酵母中利用双杂交系统(异源系统)，在病毒P54蛋白可能的相互作用蛋白的猪巨噬细胞cDNA文库中寻找相互作用蛋白，发现了该相互作用。编码p54的序列(E183L基因)包含在BA71V分离株的完整序列中，以登记号U18466存放在NCBI数据库中。对获得且鉴定为阳性的克隆进行测序，以发现它们包含8千道尔顿(kDa)的轻链动力蛋白的完整编码序列，所述8千道尔顿(kDa)的轻链动力蛋白称为DLC8，LC8，DLCl,DNLCl或PIN(神经元氧化氮合酶的抑制剂蛋白)。Susscrofa中编码DLC8的序列已经以AF436777存放在NCBI数据库中。使用另一种形式的技术，包括亲和层析，免疫沉淀和通过共聚焦显微镜的双成分共定位，确证了这些结果。这些结果仅证实ASFV的p54蛋白和DLC8之间的相互作用。DLC8是在进化上远系物种之间(从线虫动物到人)具有高度保守核苷酸氨基酸序列的蛋白[2，3]。细胞质动力蛋白是驱动遍及微管的不同负荷的分子发动蛋白家族。它们负责将小泡、内体和细胞器由细胞外部转运至内部、至核或核周区域。它们是大的多蛋白复合物，由一至三个具有球状头部和ATP酶活性的重链构成，其负责产生引起运动必需的能量。与这些重链结合的是不定数目的中间体链和轻链。后者负责与待转运的负荷直接相互作用。迄今为止，已经描述了7个轻链家族，其中我们可以找到DLC8。DLC8在体内倾向于成为二聚体，其允许在两个单体之间存在不同序列的两个相同的结合位置。关于该细胞蛋白，对于DLC8已经发现了两种类型的它们与之相互作用的该细胞蛋白的优先结合位点[12，13]。基序之一(Lys/Arg)XThrThHX为任何氨基酸)结合DLC8与一系列分子如动力蛋白的中间体链、促凋亡(proapoptotic)分子Bim、Kidl和Swallow转录因子和一些不同来源的病毒蛋白。这一结合位点位于两个DLC8分子的二聚体之间。第二个基序是Gly(Ile/Val)GlnValAsp，其结合DLC8与神经元氧化氮合酶(nNOS)或与神经元skafolding蛋白，如目前所述。为了鉴定病毒蛋白与动力蛋白结合所需要的氨基酸残基，在酵母系统中表达并检测P54蛋白的7个剪截的片段，以确定针对DLC8的结合区位于p54蛋白的羧基末端，由在Tyrl49和Thrl61之间的13个氨基酸组成(TyrThrThrThrValThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr)[1]。一些病毒在它们在宿主细胞内的感染周期的不同阶段使用轻链动力蛋白(DLC8)。通过称为pep-扫描的技术，合成了模拟不同病毒来源蛋白的线性序列的肽，印迹至滤纸上，并且用DLC8探测来确定哪种线性序列适于该相互作用[10]。下述出现的线性序列理论上适于DLC8结合。这些通常包含Gln(Q)残基，在该序列中通常与T残基(Thr)相邻-非洲猪瘟病毒p54蛋白的TyrAlaSerGlnThr基序-呼吸道合胞病毒结合糖蛋白的TyrSerThrGlnThr基序_狂犬病毒的和Mokola病毒的、人单纯疱疹病毒解旋酶的、腺病毒蛋白酶的、或A.moorei昆虫痘病毒的P蛋白的LysSerThrGlnThr基序。-人乳头瘤病毒(papillovirus)E4蛋白的或痘苗病毒聚合酶的LysGlnThrGlnThr基序。-人疱疹病毒基因U19的LysGlnThrGlnThr基序-AMf2^^!^(humanCoxsackievirus)^tES&WArgValMetGlnLeu^寸。尽管已经发现一些线性病毒蛋白序列理论上能够结合DLC8，但是这不排除所有这些序列应该适于以蛋白天然形式相互作用或当分子在体内整合到发动蛋白复合物中时。此夕卜，没有表明那些病毒序列怎样暴露在病毒颗粒中，也没有表明它们事实上能够结合DLC8的推定结合位点，和/或这些病毒蛋白是否在感染过程中在动力蛋白可及的细胞区室如细胞溶胶中(而不是内质网或其它隔离的细胞器和结构中)合成的。此外，迄今为止尚未证明这些线性序列的任一种能够以任何方式阻断假定的蛋白与DLC8的结合，并且最终，没有保证阻断该位点将导致对感染的抑制。事实上，如上所述，每DLC8分子存在两个推定的结合位点，并且存在可以由任何给定的病毒交替利用的多个其它轻链和中间体链。总之，这些发现无一证明阻断该位点将中断该相互作用和妨碍病毒感染，并且没有保证上文提及的序列可以有效用作抗病毒化合物。此外，对于将要用作抗病毒剂候选物的任何肽，应该用某种办法充分达到细胞内环境，并且还必须确保在活细胞中零或非常低的毒性。当这些序列保持一级(线性)结构时，氨基酸序列可以被鉴定为参与病毒蛋白和DLC8之间的结合的事实不排除那些线性序列将抑制病毒蛋白和DLC8的相互作用，并且因此，包括那些氨基酸序列的肽可以作用为抗病毒化合物。应该分析两种相互作用表面(例如，通过它们的核磁共振谱)，以设计适于阻断所述蛋白-蛋白相互作用的肽序列。关于其的原因在于这样的事实，即，当在细胞中以更高复杂性结构折叠时，例如，结合到称为微管发动蛋白复合物的大分子复合物上，线性氨基酸序列可以隐藏参与结合DLC8或病毒蛋白的氨基酸残基，并且因此，那些二级结构折叠的肽将不表现出任何抗病毒活性。此外，在体外或在异源系统如酵母中参与结合的确定序列可能不暴露于病毒颗粒的情形中，和/或可能在隐蔽的细胞器或结构中合成，这使得其在哺乳动物细胞中对感染的细胞蛋白是不可及的。在所有这样的情形中，理论上能够阻断相互作用的肽将不表现出任何抗病毒活性。另一个原因在于，当溶解在细胞溶胶中时，线性肽具有形成聚集体的倾向，其又将隐蔽负责结合DLC8或病毒蛋白的氨基酸。那些聚集的肽将不表现出抗病毒特性。新型抗病毒肽的设计中的另一个重要方面涉及它们在未感染细胞中的毒性。商购的抗病毒物质应该防止和/或抑制病毒感染，但是优选地，不影响未感染细胞的细胞存活和细胞增殖。最后但不是最少的，本发明已经发现围绕该基序的氨基酸参与DLC8-病毒蛋白结合区，并且特别是它们的疏水性，它们的确在被认为是真正的抗病毒化合物的那些肽的结合抑制能力中起着重要作用。实现对病毒蛋白与DLC8结合的有效抑制的抗病毒肽必须充分溶解在细胞溶胶中，并且因此，在结合基序附近的氨基酸的疏水性和脯氨酸含量是至关重要的。因为所有这些原因，通过干预病毒利用细胞动力蛋白而产生阻断所述病毒感染的抗病毒策略是必需的，即，阻断其允许不同病毒来源蛋白充分利用动力蛋白的功能或结合位点。然而，尽管在那些病毒中存在的一些重叠部分氨基酸序列重复作为DLC8的结合基序，如KSTQT或GIQVD，但是检查相邻的残基以评估是否将有效发生病毒-DLC8相互作用也是重要的。针对它们消除与DLC8的相互作用的能力而评估在那些氨基酸上的特异性改变。利用病毒模型(非洲猪瘟病毒，ASFV)我们已经证明，对系统DLC8-动力蛋白的干预，能够阻断感染，其为新型抗病毒策略提供了主要的检测，这组成本发明的目的。我们已经比较了参与所述相互作用的一些蛋白的相互作用结构域及其侧翼序列，并且已经利用该信息来设计作用为蛋白对相互作用的主要拮抗剂的肽，所述蛋白对相互作用，但是同时，其被标记，以充分到达细胞内环境，且主要实现抗病毒化合物必须满足的所有要求，如先前所述在确定条件下对病毒蛋白-DLC8结合的特异性抑制，在细胞溶胶中的可及性和溶解性，不形成聚集体且不干预细胞存活性和增殖能力(无细胞毒性)。总之，本发明首次公开了作为抗病毒化合物应用的肽，其基于作为感染成功的必需步骤的病毒通过其结合动力蛋白DLC8的序列(全部或部分)而设计，并且那些肽表现出有效抑制易受影响的细胞中的病毒感染，且具有可证明的抗病毒作用。病毒-DCL8相互作用的抑制反映在对病毒致细胞病变作用的抑制和感染的细胞数目的急剧减少。此外，定量测量该化合物的抗病毒作用，以利用定量PCR关于每细胞病毒基因组拷贝数的减少(这反映在细胞中发现的以ng/μ1为单位的病毒复制的减少)而比较它们的相关功效，并且还测量因此引起的病毒生产和病毒蛋白合成的显著减少。本发明由基于多种ASFV分离株的p54序列产生的肽所示例，所述肽防止感染继续进展，成为抗病毒治疗的基础。附例图1.抗病毒肽设计。基于来自不同来源的不同病毒分离株中存在的病毒ASFV蛋白P54的序列分析比较，我们设计一组肽(表1)，其包括保守基序，且在实际存在于病毒蛋白中在不同病毒分离株之间具有变异的那些中选择最有利的侧翼序列。图2.活性肽的相互作用和中断的NMR动力学。A.用于NMR分析的15_N标记的DLC8的获得(obtention)和纯化。15N-标记的DLC8在不同滴定点的1H-15NHSQC谱；B，游离DLC8；C,游离DLC8(黑色光谱)和使用2eq未标记的p54(灰色光谱)；D，游离DLC8(黑色光谱)和使用5eq的肽PS19(SEQIDNO2)和2eq未标记的p54(灰色光谱)；E，游离DLC8(黑色光谱)使用5eq肽PS19和2eq未标记的p54(灰色光谱)和使用2eq未标记的p54(灰色光谱)。图3.肽向细胞中内在化的证明。萤光素标记的肽C0VA2(SEQIDNO:7)在非洲绿猴肾细胞株系细胞中的分布，所述非洲绿猴肾细胞株系细胞用不同浓度的连接富含精氨酸的分子转运体(C0VA2)的肽构建体温育1和3小时。在100μM肽浓度，FITC-标记的肽(C0VA2)在100%的细胞中内在化。图4.细胞病毒感染和通过本发明的肽COVAl(SEQIDNO6)的作用对所述感染的抑制的图解。1.“前一天晚上在5%DMEM中以9xl04/cm2的密度培养的非洲绿猴肾株系细胞。2.-在37°C1小时内以0-100μM的范围向DMEMSC中加入300μ1不同肽的溶液，用于肽的内在化。3.-1"细胞8471￥进行感染。4.-在37°C吸附2小时。5.-用IlmlDMEMSC洗涤2次消除残余的病毒。6.-在DMEM+肽中感染后6-18小时的感染过程。7.-检测被感染的细胞。图5.通过致细胞病变效应比较抗病毒和对照肽的抗病毒活性。通过常规显微镜方法(IOOx放大倍数)展示ASFV在下列条件下的致细胞病变效应的抑制在第1和2列中存在上升浓度的抗病毒肽(RS27-SEQIDNO3-和PS19-SEQIDNO:2_)，在第3和4列中为对照(RS28-SEQIDNO5-和SS20-SEQIDNO:4_)，且在第5列中不存在肽。图6.抗病毒肽治疗和通过免疫荧光检测感染的细胞数目。图6A显示在感染后6小时(6hpi)用增加浓度的标记有针对ASFVp30的抗体的抑制剂(C0VA2-SEQIDNO-J-)和对照(RS28)肽温育的感染细胞的百分数。B显示用5μM和50μMC0VA2和RS28肽温育的感染细胞的免疫荧光测定的代表性照片。图7.抗病毒肽治疗和病毒蛋白合成。用不同浓度的COVAl(SEQIDNO:6)肽分析早期(ρ30)和晚期(ρ72)蛋白合成1和3小时。Α，表示ρ30和ρ72蛋白的代表性蛋白质印迹凝胶，和B表示通过密度计量学对ρ30和ρ72蛋白的定量。图8.抗病毒肽治疗和通过定量PCR定量ASF病毒DNA。与对照肽RS28相比较，在用增加浓度的抑制剂肽(C0VA1,PEPl-SEQIDNO:9_和PEP3-SEQIDNO:8_)处理后对感染后16小时(16hpi)的ASFVDNA复制的影响。该图中还显示包含其它DLC8结合序列的肽(PEP1和PEP3)，表明COVAl序列从较低的肽浓度就是有效的。图9.抗病毒肽在病毒生产中的作用。与对照肽RS28(白色长方形)相比较，对在感染后36小时(36hpi)用增加浓度的抑制剂肽COVAl(黑色长方形)后恢复的细胞内(A)和细胞外(B)病毒滴度的作用。图10.化合物不存在细胞毒性。在以不同浓度的抗病毒(COVAl)和对照肽(RS28)温育36小时后没有监测到非洲绿猴肾细胞株系细胞的增殖指数。图11.在肽内在化后细胞结构的保留。用不同浓度的C0VA2肽处理非洲绿猴肾细胞株系细胞1和3小时的代表性共聚焦显微镜照片。照片显示未处理的细胞中的保守微管细胞骨架结构(微管蛋白)(左列)，和在用增加浓度的标记有FITC的肽处理的细胞中的保守微管细胞骨架结构(微管蛋白)(右列)。图12.在有丝分裂过程中形态保留和纺锤体形成。用对照㈧和抑制剂肽COVAl(B)处理的非洲绿猴肾细胞株系细胞的代表性共聚焦显微镜照片。在对照(A)和(B)肽处理的细胞中，在细胞分裂的不同阶段中形成有丝分裂纺锤体的微管蛋白纤维。细胞存活力和增殖能力不受肽处理的影响。图13.萤光素标记的C0VA2肽的细胞分布模式。肽结合DLC8的一个货物位点，并且荧光肽与DLC8精确地共定位在其动力区室中，诸如细胞凸出物(cellprojections)(A)，细胞质运输位点(A)和有丝分裂后子代细胞的细胞质(B)，在那里DLC8在细胞分裂后行使重新配置细胞器的功能。发明描述基于在来自不同来源的不同病毒分离株中存在的病毒ASFV蛋白p54的序列分析比较，我们设计一组肽(表1)，其包括在大部分病毒分离株中是保守的共有序列和最便利的侧翼序列，在侧翼序列中，在不同病毒分离株之间蛋白存在变异(图1)。考虑长度、疏水性和脯氨酸含量。脯氨酸可以在溶液和聚集体中进行顺式/反式异构化。一旦我们已经选择了一组肽，我们就合成我们通过它们的氨基酸组成预测是可溶的和稳定的那些，并且用将它们递送至细胞的序列标记它们，然后我们通过下述方法继续检测那些肽。核磁共振(NMR)技术允许深入分析不同蛋白之间的相互作用表面。在本发明中，通过NMR分析了ASFV蛋白p54和动力蛋白轻链(DLC8)之间的相互作用。这一分析已经提供了可以详细了解所述相互作用的数据，认为两种蛋白和两种相互作用表面的三维结构允许精炼最适肽序列，以覆盖参与相互作用的残基。获得DLC8的NMR谱，并且评估在存在增加浓度的病毒P54的条件下，这些光谱怎样被修正(化学迁移)，这指示两种蛋白之间的高亲和性相互作用。因为它们参与相互作用，所以可以确定由在所述光谱上消失的DLCSS基组成的蛋白活性中心。这些残基如下Trp54，Lys9，Ser88，Asn61，Asn23，Asn33，Gly59，Ser86,Arg60,Glul5，和Tyr75。然后我们能够选择可以结合并且覆盖包含在相互作用表面中的肽，然后检测哪些能够通过阻断这一高亲和性相互作用而防止任意浓度的病毒蛋白P54的任何进一步的结合。本发明证明所述病毒蛋白与细胞动力蛋白正确的相互作用对于感染是至关重要的，感染必须包括病毒由膜到核周区域(在与微管组织中心或MTOC相对应的区域，在那里在健康细胞中发生DLC8的最大聚集)的细胞内转运，并且在感染ASFV的情形中，其是病毒工厂所在的位置，并且在那里合成待装配的病毒蛋白且产生新的病毒体。近来，利用上述NMR进行的研究以使在我们实验室中可以证明提前向DLC8中加入包括在p54中存在的相互作用序列TyrThrThrThrvalThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr(SEQIDNO13)的肽来防止p54与DLC8结合是可能的。本发明的优选实施方案由通过利用病毒蛋白序列，或其部分，来阻碍病毒在感染过程中对动力蛋白的使用从而阻碍感染组成，在某些情形中，通过病毒蛋白-动力蛋白键合的抗病毒肽拮抗剂来饱和细胞蛋白的结合位点而进行。在所述肽内，本发明已经在使用肽序列对任何来源的细胞的处理中证明它们干预病毒蛋白与轻链动力蛋白的作用，例如，包含14个氨基酸的那些=TyrThrThrThrvalThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr(SEQIDNO13)，其包括在所述序列和在不同动物病毒的序列类似物或该肽的功能类似物中的保守氨基酸改变。发现关键基序(维持p54-DLC8，ThrAlaSerGlnThr-SEQIDN0:14_之间的相互作用的氨基酸序列)的侧翼序列的疏水性改变肽结合DLC8的能力。肽序列的设计必须考虑所述肽应该在位于DLC8三维结构所示的疏水峡谷中的特定位点结合DLC8。考虑到预期结合DLC8的理论序列的事实，S卩，在体外它们中的一些结合，另一些不能结合DLCSjB上述所解释，本发明利用NMR继续进一步精炼所述肽序列，并且选择了一组抑制剂肽。我们证明P54-DLC8相互作用是高亲和性相互作用，如由它们的NMR相互作用动力学所定义的那样。然而，我们能够加入某些肽而阻断该高亲和性相互作用，这首次表明可以用给定的肽序列(表1)干预键合而阻断P54-DLC8相互作用。所选择的最佳肽序列能够阻断所述相互作用，而另一些用作对照肽，所述对照肽不改变NMR分析的P54和DLC8之间的相互作用动力学。本发明的方法近似法还包括用任意来源的包括任意前述序列或在所述序列中具有保守氨基酸改变的肽序列的任何治疗。它们包括那些序列的所有保守转化和目前目的为将这些肽转运至细胞内部的所有已知的机制，例如与易位至细胞内部的序列连接的任意月太(氛基己酸(aminocaproicacid)或氛基己块酸(aminohexinoicacid)添力口,等)；月旨质体或作用为将所述肽内在化在细胞中的任何其它媒介物，如载体，特别是病毒载体如腺病毒或反转录病毒，质粒，等等，优选与标记序列连接的那些载体。用肽治疗的目的是将它们与下列各项预温育，而饱和使用与动力蛋白连接的转运体的动力蛋白结合基序动力蛋白轻链，DLC8蛋白，或其中包含的任何氨基酸序列，或包含基序(Lys/Arg)XThrGlnThr或Gly(IleAal)GlnValAsp)的任意肽，或衍生于其具有氨基酸的保守改变的序列。保守改变定义为不改变蛋白的负荷、拓扑结构或形成的那些。类似地，本发明包括与其它肽序列、肽转运体等连接的或与脂质体或其它媒介物一起提供的任一种前述肽，以使所述肽在细胞中内在化，和通常，在对于任何来源的细胞目前已知的转运系统中内在化。发明详述因此，本发明的目的是选自来自不同病毒分离株的P54序列的肽的抗病毒组合物，其能够与病毒蛋白竞争结合DLC8。特别地，那些肽必须有效防止所述蛋白和病毒与DLC8在体外和体内的结合，并且因此，以抑制病毒感染。在那些肽中，可以选择与参与病毒蛋白-DLC8相互作用的序列有关的肽，不管是由病毒蛋白序列分离的还是DLC8序列本身。衍生于其的任何肽，特别是具有保守氨基酸取代，也将包括在本发明中[14:Tayl0r，W.R.]。所选的肽，除了抑制病毒_蛋白与DLC8的相互作用之外，在与针对其寻找抗病毒保护的细胞温育时必须不表现出毒性。此外，参与病毒蛋白与DLC8结合的大部分分离的肽，或由病毒蛋白或由动力蛋白轻链(DLC8)分离的，表现出聚集且形成二聚体的倾向。当那发生时，它们的结合能力是低得多的，并且可以甚至消失。二聚体形成和/或聚集可以通过考虑疏水性、总长和脯氨酸含量而改变那些肽序列中的一些氨基酸而便利地避免。本发明还研究了那些改变，并且已经选择了一个肽家族，其通过与DLC8高亲和性竞争结合而阻碍病毒结合DLC8，不表现出聚集或二聚体形成，且在必须防止或治疗病毒感染的细胞中具有低毒性。另外，所选择的肽具有Arg尾，例如，8个Arg，以促进那些肽进入必须防止或治疗病毒感染的细胞内部。所选的肽家族(PS19，COVAl，C0VA2,PEPl和PEP3)，它们均衍生于与负责与DLC8结合的P54相关的序列部分。本发明的肽家族由SEQIDNO14表示，并且包括通过在SEQIDNO:14的至少一个氨基酸的保守取代而衍生于其的任何其它的肽。由于它们对细胞的无毒作用，由SEQIDNO1表示的肽亚族特别令人感兴趣。本发明的抗病毒组合物，其包括SEQIDNO14或SEQIDNO:1表示的家族的至少一种肽，可以另外包括任何其它活性化合物和/或药用赋形剂、载体或稀释剂。其中可以用本发明的抗病毒组合物治疗的病毒感染为ASFV，人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus)，腺病毒，昆虫痘病毒A.moorei，痘苗病毒，呼吸道合胞病毒，人柯萨奇病毒，狂犬病毒，人单纯疱疹病毒，Mokola病毒或AIDS病毒。本发明的另一个目的在于抗病毒化合物的选择和其功效评估的方法，特征在于其包括a)用能够结合DLC8的化合物预先温育或预先混合用表达所述肽序列的载体转染的细胞培养物，所述化合物用适当的细胞内递送序列标记或与已知的递送方法如脂质体等组合；b)将病毒与在步骤a)预先温育或混合的细胞培养物接触；c)在一定时间后检测并定量细胞内病毒感染的水平；d)将所述病毒感染水平与在没有与能够结合DLC8的化合物预先温育或预先混合的感染该病毒的细胞培养物中达到的病毒感染水平进行比较。本发明的另一个方面在于抗病毒化合物的选择和其功效评估的方法，特征在于其包括a)将病毒与包括能够结合DLC8的序列、其部分序列或通过保守置换序列中或其部分序列中的至少一个氨基酸产生的能够结合DLC8的类似序列的化合物预先温育或预先混合；b)将细胞培养物与步骤a)中预先温育或预先混合的病毒接触；c)在一定时间后检测并定量细胞内病毒感染的水平d)将所述病毒感染水平与在没有用步骤a)的化合物预先温育或预先混合的感染该病毒的细胞培养物中达到的病毒感染水平进行比较。此外，本发明的另一个目的涉及对细胞内与动力蛋白转运系统相关的病毒途径的研究。本发明还涵盖特征在于将能够结合DLC8的一组肽标记的研究方法，其可以例如，通过直接荧光显微镜检测。可以选择下列各项作为在细胞研究中可用的任何标志标记萤光素、罗丹明或其它荧光和非荧光标记如生物素，血细胞凝集素，c-myc，等等...优选用作标记，其用于利用二抗的检测，等等。最后，本发明还涉及通过测量轻链动力蛋白(DLC8)光谱变化而评估对配体与DLC8结合的抑制的方法。下述实施例是实施本申请中包含的相关发明的优选实施方案，并且在不限制范围的目的前提下提供，仅是为了允许本领域技术人员在无需过多的努力的条件下再现那些相关的方法。实施例通过防止p54和8kDa的细胞动力蛋白轻链(DLC8)之间的相互作用的肽而抑制非洲猪瘟病毒(ASFV)感染。1.1.材料1.1.1所用的细胞系和培养基在该实施例中，使用非洲绿猴肾细胞系作为模型。在该建立的细胞系中进行肽的感染和内在化检测，所述细胞下在培养物中非整倍体和不确定生长。其来源于成年非洲绿猴肾脏(Cercopithecus)，且其获自欧洲细胞培养物收藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures)(ECACC)，保藏号为84113001。它们的形态学是成纤维细胞类型的，并且其总是以少于20个步骤使用，在使用它们之前将它们冷冻且整分保存在液氮中。该细胞系使用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Lonza)进行培养，所述培养基补充了5%在56°C灭活30分钟的胎牛血清(BFS，Lonza)，4mM谷氨酰胺(Invitrogen)，200IU/ml青霉素和IOOmM链霉素(Invitrogen)。细胞的培养条件为37°C和5%CO2的氛围。常规地，这些细胞一周两次以16进行传代培养，生长在Easy-T-Flasks培养瓶中，用Nunclon(Nunc)包被75cm2。取决于特定的检测需要，以一些形式补充DMEM培养基。因此，当其以不含抗生素、谷氨酰胺或SBF进行使用时，我们称为DMEMSC。当加入SBF百分数时，我们称为2%DMEM，以该百分数维持其它添加剂处于前段提及的浓度。对于琼脂糖平板，使用Dulbecco2X(Gibco)培养基。1.1.2.所用的病毒分离株在感染抑制检测中所用的非洲猪瘟病毒分离株为BA71V，其适合在非洲绿猴肾细胞系中生长[4]。病毒储液以100μ1的整分试样在-80°C保存在补充了15%胎牛血清的DMEM培养基中。在使用它们时，将所需要的整分试样在37°C在水浴中迅速解冻，并且置于冰上。1.1.3.所用的替代材料·Iml容量低温管(Nalgene)以在液氮中保存整分的病毒分离株和保存非洲绿猴肾细胞系。·最大容量为1000，200和20μ1的微量移液管(Gilson)。·1000,200和20μ1容量的具有滤器和不含RNA酶的微量移液管头(Arc)，以避免可能的污染。·不含RNA酶的1.5ml容量管(Eppendorf)。·4，6，12和24孔的多孔细胞培养板(Nunc)。·直径ianrn的盖玻片(GeverLabs)。·常规三角载玻片(GeverLabs)。·用于蛋白的硝基纤维素膜，9x7cm(GE卫生保健(GEHealthcare)).·Whatman纸，9x7cm。1.1.4.所用的抗体和色原·抗-p30单克隆抗体其在Dr.JoseAngelMartinezEscribano实验室中产生，特异性识别和检测ASFV的早期蛋白p30。·抗-DLC8多克隆抗体，在用与10个组氨酸残基结合的DLC8蛋白免疫的兔中获得，与10个组氨酸残基结合的DLC8蛋白在大肠杆菌(E.coli)异源系统中表达，并且后来纯化。其在我们实验室中产生。抗-α微管蛋白单克隆抗体(西格玛(Sigma))。抗-p72单克隆抗体(抗-p73)由Ingenasa市售，特异性识别和检测ASFV的结构晚期蛋白，主要是P72或p73。与Alexa594荧光团(分子探针(MolecularProbes))缀合的小鼠抗IgG抗体。与Alexa488荧光团(分子探针(MolecularProbes))缀合的小鼠抗IgG抗体。·与HRP过氧化物酶(GE卫生保健(GEHealthcare))缀合的小鼠抗IgG抗体。·与HRP过氧化物酶(GE卫生保健(GEHealthcare))缀合的兔抗IgG抗体。1.1.5.其它试剂·TritonX_100(西格玛(Sigma))·吐温20.(西格玛(Sigma))·磷酸盐缓冲液(PBS)*BSA，牛血清白蛋白(西格玛(Sigma))·ECL化学发光试剂(GE卫生保健(GEHealthcare))·不含RNA酶的水(Ambion)·RNAseZAP溶液(Ambion)，以消除工作表面和材料的RNA酶活性·ProLong，封固试剂(mountingreagent)，以保存荧光)·Hoechst3332(西格玛(Sigma))，作为核酸的插入生色剂·β-巯基乙醇，SDS,Tris碱(西格玛(Sigma))‘NP-40(Fluka)·NaCl(Duchefa^.itMM(Duchefabiochemicals))·超纯低熔点琼脂糖(Invitrogen)1.1.6.所用的肽设计不同的肽，其包含前述ASFVP54蛋白中的DLC8结合基序，设计不相关序列的另一系列肽用作阴性对照(RS27和SS20肽)。所有这些记述在表1中。在一些肽中，包括一些修饰，诸如下述·在N端添加8个精氨酸残基(R),目的是增加肽在细胞内的内在化[6](RS27；RS28；COVAl；C0VA2；PEP3；PEP1).·在N端与萤光素綴合，以便通过荧光显微镜直接显现其(C0VA2；PEP3；PEP1).·置换特定残基，以促进肽的溶解且避免其聚集(C0VA1，C0VA2,PEPl和PEP3)将ThrAlaSerGlnThr基序内的残基置换为保持p54与DLC8的相互作用能力的另一些残基(PEP3K1]。在本实施例中所用的所有设计的肽由Sigma-Genosys合成。其纯化通过HPLC进行，在所有情形中获得大于90%的纯度。一旦合成和纯化，在实验室中得到作为冻干物的所述肽。表1.实施例1中所用的肽的列表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(1)包含p54中存在的针对DLC8的结合序列。(2)与萤光素缀合。(3)包含关于p54中存在的针对DLC8的结合序列的改变，以避免所述肽的聚集和二聚体化。(4)包含8x精氨酸序列，以促进在细胞内的内在化。(5)阴性对照(6)在p54中存在的DLC8结合基序中的置换，其不改变两种蛋白之间的结合。1.2.方法1.2.1序列比较分析将存在于不同领域和ASF病毒的实验室分离株中的p54序列(存放在Genebank(NCBI))标示在BLAST数据库中，并且用局部比对搜索工具(LocalAlignmentSearchTool)进行比较。从来自不同分离株的不同序列选取保守基序和最合适的侧翼序列。对于该肽设计，考虑长度、疏水性和脯氨酸含量。脯氨酸可以在溶液和聚集体中进行顺式/反式异构化。肽的亲水性质也可能是难以纯化且难以促使沉淀的。一旦我们已经设计了该组肽，我们选择合成通过其氨基酸组成预测是可溶的且稳定的那些，并且用将它们递送至细胞的序列(如下文详述，8个精氨酸尾)标记它们。1.2.2.核磁共振在用N15标记并纯化ASFV蛋白p54和DLC8后获得核磁共振光谱。本研究所用的方法称为化学位移改变。首先，纯化两种蛋白，并且将光谱与Lo等人于1998年关于DLC8报道的那些光谱进行比较(图2)。1.2.3肽的处理按照其分子量(见表1)，将肽重悬在具有相对应的纯度mQ且无菌的H2O体积中，以获得浓度为5mM的储液。要特别注意避免溶液浑浊，并且枪头总是与滤器一起使用，以避免可能的交叉污染。制成20μ1整分试样，并且保存在-80°C直至使用时。使用其时，在冰上缓慢解冻。由储液在DMEMSC培养基中以0_100μM的浓度范围制备肽的工作溶液，制备总是在无菌条件下进行，且在将其加入到细胞培养物中之前立即制备以避免其降解。1.2.4在细胞培养物中由肽阻断P54-DLC8相互作用在实验的前夜在24-孔板中培养9xIO4Vero非洲绿猴肾细胞系细胞。次日上午，将细胞在DMEMSC中洗涤，并且用300μ1含有不同浓度的不同肽的溶液替换已有的培养基。在37°C和5%CO2培养细胞与该肽一小时，而后用ASFV感染所述细胞。为了感染细胞，取出已有的细胞培养物，并且将其替换为含有对应量的2%350μ1/孔，以获得1个噬斑形成单位(pfu)/细胞的感染系数。允许感染在37°C和5%CO2进行至需要的时间。在吸附期(在37°C2小时)后，通过用DMEMSC洗涤两次而去除残留的病毒，最后将细胞置于300μ1含有相应浓度的肽的新鲜DMEMSC中。在每次实验中，允许感染在37°C进行需要的时间，这取决于要分析的感染的参数。该过程示意性表示在图4中。1.2.5通过间接免疫荧光(IIF)检测ASFV感染的细胞在感染后6小时进行检测先前暴露于不同肽的细胞中ASFV感染的细胞。所用的通过免疫荧光检测ASFV感染的那些细胞的IIF技术是常规技术。概言之，用ImlPBS洗涤细胞，然后用3.8%PBS-低聚甲醛溶液在环境温度下固定10分钟。然后，通过用ImlPBS洗涤细胞3次而去除残余的低聚甲醛。使用0.2%PBS-TritonX-100在环境温度下进行细胞膜的渗透15分钟。再用PBS洗涤3次后，将细胞在37°C在封闭溶液(3%PBS-BSA)中温育45分钟。当检测病毒抗原时，选择ASFVp30的早期蛋白[5]，并且使用1200稀释在PBS中的抗-p30抗体在37°C进行其检测1小时。将细胞用PBS洗涤3次，并且将其用1300稀释在PBS中的小鼠抗-IgG抗体的溶液在环境温度下温育30分钟。将细胞在PBS中洗涤，并且最后结合用Hoechst3332标记的核仁。最后，使用Prolong作为封固介质将包含所述细胞的盖玻片封固在载玻片上。在常规荧光显微镜(Leica)下观察该制备物，以计数针对病毒抗原P30阳性的细胞数目。1.2.6^ASFV感染i寸禾旱中诵过屈白质印迹分析病毒蛋白的合成待分析的病毒蛋白受试者是在感染开始阶段表达的早期ASFVp30蛋白[5]和在感染晚期阶段表达的P72蛋白(有时还称为p73)[7，8]。对所述细胞进行蛋白质印迹，所述细胞用Iml冷PBS洗涤，然后收集在50μ1冷冻RIPA蛋白提取缓冲液(150mMNaCl,5mMβ-巯基乙醇，1%ΝΡ40,1%SDS和50mMTris-HClpH=8)中。将其在轨道搅拌条件下在4°C温育20分钟，以溶解该蛋白，然后将其在台式离心机中在4V以12，OOOrpm离心10分钟。弃掉沉淀，收集上清，将上清保存在-70°C直至通过蛋白质印迹对其进行分析时。将样品在冰上解冻，并且通过Bradford法定量不同样品中的蛋白质量。通过在15%丙烯酰胺二丙烯酰胺凝胶中在100V恒定电压下电泳90分钟而分离20μg在100°C5分钟完全变性的蛋白。在存在转移缓冲液(Tris-甘氨酸，20%甲醇)的条件下，在100V恒压下90分钟，将分离的蛋白转移到硝基纤维素膜上。在存在50ml5%脱脂PBS-奶粉的条件下，在环境温度和轨道旋转下，封闭该膜至少1小时。然后，将该膜与150稀释在PBS中的IOml抗-DLC8多克隆抗体在环境温度和搅拌下杂交1小时。此后，将该膜在环境温度下用20ml0.05%PBS-Tween洗涤3次，每次15分钟。在环境温度和搅拌下，用缀合至过氧化物酶上且14000稀释在PBS中的二级兔抗-IgG抗体温育持续1小时。已完成之后，将该膜用0.005%PBS-吐温洗涤3次，每次15分钟。最后，按照供应商的使用说明以常规方式进行利用ECL的化学发光检测。使用来自暴露于或未暴露于不同肽且后来感染或未感染ASFV16小时的非洲绿猴肾细胞系细胞的总可溶蛋白提取物作为分析的起始样品。在独立的膜中，使用1100稀释在PBS中的抗-p30单克隆抗体和12000稀释在PBS中的抗-p72单克隆抗体作为一级抗体。将膜用两种抗体在室温和轨道搅拌下温育1小时。在两种情形中，使用缀合至过氧化物酶上的小鼠抗-IgG抗体作为二级抗体。最后，进行化学发光反应的密度计量，以定量和相对描述在所检测的每条条带中存在的蛋白的量。1.2.7检测和定量ASFV基因组通过使用特定的寡核苷酸(SEQIDNO10和SEQIDNO11)和TaqMan探针(SEQIDNO12)的定量实时PCR实现对ASFV基因组的检测和定量。在感染后16小时(16hpi)用DNeasy血液和组织试剂盒(DNeasybloodandtissuekit)(Qiagen)提取并纯化用BA71V0.5pfu/细胞感染的或假感染的细胞的DNA。通过测量260nm处的吸光度(A26tl)估算DNA浓度和纯度。在冰上制备扩增混合物，如下3口1模板0嫩(1口8).1μ1寡核苷酸0E3F50pmol.1μ1寡核苷酸0E3R50pmol.10μ1QuantimixEasy工胃(QuantimixEasyProbesBiotools)2X.1μ1TaqMan探针SE25pmol.4μ1H2O.扩增反应在RotorGene6000(CorvetteResearch)中进行，如下表所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>在测定中包括阳性扩增对照(由ASFV病毒体纯化的DNA)和阴性扩增对照(来自假感染的细胞的DNA)，并且每份样品分析一式两份。1.2.7.在ASFV感染过程中肽处理对病毒后代产生的影响在实验前夜在24-孔板中接种9xIO4非洲绿猴肾细胞系细胞。在感染前1小时，将细胞在300μ1包含不同浓度的C0VA1或RS28肽的DMEM中温育。然后，将细胞用0.5pfu/细胞的ASFVBA71V毒株进行感染或假感染。在感染后36小时(36hpi)，从孔中收集100μ1培养基，并且保存在-80°C直至分析细胞外病毒后代。还将感染的细胞收集在100μ1新鲜DMEM中。将细胞冷冻并且解冻三次，以能够增溶胞内病毒后代，然后保存在-80°C备用。通过噬斑测定法分析来自胞内或胞外样品的病毒滴度。简言之，将接种在6-孔板中的非洲绿猴肾细胞系细胞单层用500μ1含有病毒后代的10倍连续稀释的样品温育。在90分钟吸附时间后，将细胞在新鲜DMEM5%中洗涤两次，并且向细胞中加入3ml/孔的覆盖物(低熔点琼脂糖2%和DMEM2X,νν)。当覆盖物变成固体时，将平板在37°C和5%CO2下温育12天。然后，将细胞用在5%甲醛中的结晶紫染色，以能够显现病毒噬斑。计算病毒滴度，如下pfu/ml=2xn°噬斑χ10稀释倍数1.2-9细胞毒性分析。细胞存活力和增殖测定为了评估细胞存活力，将接种在24孔板中的非洲绿猴肾细胞系细胞在含有浓度在0-100μM范围内的抑制剂肽C0VA1或阴性对照RS28的DMEM中温育。在用肽温育24小时后，收集细胞，并且通过Tripanblue(西格玛(Sigma))染色排除测定法确定细胞混悬液中存在的存活细胞数目。简言之，将20μ1含有0.08%TripanBlue的PBS加入当等体积的细胞混悬液中并且混合。2分钟后，使用血细胞计数器和常规光学显微镜计数蓝色细胞(死细胞)。为了评估细胞增殖，将接种在96孔板中的3xl04非洲绿猴肾细胞系细胞在50μ1含有浓度在0-100μM范围内的抑制剂肽C0VA1或阴性对照RS28的DMEM中温育。温育36小时后，使用CellTiter96Aqueous(Promega)测定法，按照供应商的使用说明，确定细胞增殖。1.3.结果1.3.1抗病毒肽设计将存在于不同地域和实验室的ASF病毒分离株中的p54序列标示在数据库中，并进行比较。基于在来自不同来源的不同病毒分离株中存在的病毒ASFV蛋白p54的这一序列分析比较，我们设计了一组肽(表1)，其包括在大部分病毒分离株中保守的共有序列和最便利的侧翼序列，在侧翼序列中在不同病毒分离株之间蛋白存在变异(图1)。对于肽设计，考虑长度、疏水性和脯氨酸含量。脯氨酸可以在溶液和聚集体中进行顺式/反式异构化。肽的疏水性质也可能是难以纯化且难以促使沉淀的。一旦我们已经设计了该组肽，我们选择合成通过其氨基酸组成预测是可溶的且稳定的那些，并且用将它们递送至细胞的序列(如下文详述，8个精氨酸尾)标记它们，然后我们通过下述方法继续检测这些肽。1.3.2.通过其核磁共振光谱分析相互作用表面在用N15标记并纯化两种蛋白后获得核磁共振光谱。本研究所用的方法称为化学位移改变。该方法分析当目标蛋白与配体相互作用时在目标蛋白中观察到的化学改变。首先，纯化两种蛋白，并且将光谱与Lo等人于1998年(13)关于DLC8报道的那些光谱进行比较(图2A)。在存在增加浓度的ASFV蛋白p54的条件下，DLC8光谱改变，并且结合基序包含的信号渐进消失。在0.Ieq的p54浓度下，最先消失的信号对应于残基W54，K9，S88，N61，N23。当达到0.3eq的浓度时，消失的信号对应于残基N33，G59，N23,S86，R60,E15，yY75(图1A)。在DLC8和P54之间观察到的相互作用过程的缓慢交换表明这些蛋白之间的结合以高亲和力发生。然而，当加入某些肽时，我们能够干涉该高亲和力的相互作用，并且在任意浓度的P54的条件下，没有观察到在来自蛋白活性中心的上述提及的任意残基中的DLC8光谱改变(图2B)，这首次表明该相互作用可能被给定的肽序列(表1)有效阻断了。1.3.3.肽在非洲绿猴肾细胞系细胞中的内在化参考书目描述了在肽末端添加精氨酸残基显著增加它们对细胞内部的穿透性。对于所述目的，我们结合由8个精氨酸组成的胞内递送转运体。为了检验所设计的肽高效在细胞内部内在化，在N端结合萤光素标记。那些没有精氨酸胞内递送转运体的肽不能进入细胞，而结合了所述转运体尾的那些以微管连续模式有效地内在化，并且在用该肽温育1和3小时后，几乎100%存在于培养物中的细胞被清楚地染色(图3)。C0VA2肽满足这一组特征，其包括先前在P54中记述的DLC8结合基序，并且其用于直接观察在非洲绿猴肾细胞系细胞中的内在化。从图3可以观察到，该肽有效内在化，对于其甚至在其加入后6小时通过直接荧光显微镜检测是可能的。C0VA2肽的最适浓度为50和100μΜ，在两种浓度之间无显著区别。可以检测25μM的C0VA2，尽管比以更高的浓度具有更大的难度，然而，较低的浓度，即，低于5μΜ，几乎不能通过荧光显微镜检测。1.3.4.通过阻断p54-DLC8结合的肽抑制ASFV感染如在本实施例的方法部分详述的，感染以lpfu/细胞在预先暴露于不同肽的非洲绿猴肾细胞系细胞的单层ASFV上进行。在存在肽的条件下时感染进行，并且分析下述感染参数，以检验待检测的肽的抑制作用。1.3.4.1.肽对病毒感染的致细胞病变作用特征的影响ASFV感染在感染的细胞上产生损害，其是非常特征性的，并且通过常规的显微镜方法作为致细胞病变作用易于检测到的。其在感染早期开始，并且最终导致进展性的胞内液泡化(vacuolization)、细胞轮廓变圆和感染细胞所附着的表面的分离[9]。我们在存在不同肽的条件下，在其中进展感染的非洲绿猴肾细胞系细胞培养物中评估了感染后18小时的普遍致细胞病变作用的存在或不存在。使用该方法，可以验证在用这样的肽温育的那些细胞培养物中对致细胞病变作用的抑制，所述肽在其序列中包含DLC8结合基序和促进其进入细胞内部的精氨酸序列。相反，那些暴露于对照肽或无精氨酸序列的肽的细胞发展与在正常发展感染的细胞中观察到的相似的致细胞病变作用。如图5所示，所观察到的致细胞病变作用程度与所用的肽浓度成正比。因此，抑制致细胞病变作用的PS19肽浓度完全在25-100μM的浓度范围之内，但是低于25μM的浓度在抑制所述致细胞病变作用时不是有效的。下表总结对于所检测的不同肽及其相应的浓度抑制致细胞病变作用的能力。表2.在50在100DLC8结8χ精氨肽别名μΜ的μΜ的合基序酸I·C.Ε·I·C.Ε·PS19INTSTP1有%%%RS27INTSTP2有WWWSS20INTCTl%%%%RS28INTCT2%WCOVAlDNBLKlWWWWC0VA2DNBLK2WWWWPEPlDNBLK3WWWW<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>此外，具有那些修饰的、含有DLC8结合基序的肽保持肽的相互作用能力，并且证明在感染中抑制致细胞病变作用时是有效的。1.3.4.2.肽对感染细胞的百分数的影响通过计数ASFV感染的细胞(对抗原ρ30是阳性的)数目而分析肽的抑制作用。为了进行此，在存在不同的抑制剂肽和对照肽的条件下，在病毒感染之前，温育细胞，如在本实施例的方法部分详述的那样。如图6所示，与在用对照肽RS28温育的细胞中获得的数据相比较，在感染之前用C0VA2肽温育导致感染的细胞的百分数的急剧减少。此外，该减少取决于所用的C0VA2肽的浓度。1.3.4.3.肽对病毒蛋白合成的影响使用特异性抗体通过蛋白质印迹分析早期和晚期ASFV蛋白的合成。因此，可以观察到，在存在COVAl肽的条件下发生ASFV感染时，早期(ρ30)和晚期(ρ72)病毒蛋白的合成二者均剂量依赖性减少。此外，所述减少取决于添加到细胞培养物中的COVAl的剂量(图7).1.3.4.4.通过病毒基因组复制计数测量的肽的作用非洲绿猴肾细胞系细胞用不同的肽浓度预先温育，如前述，并且用BA71VASFV分离株感染。在感染后16小时(16hpi)收集细胞，并且通过定量实时PCR使用特异性TaqMan探针和寡核苷酸[11]分析ASFV基因组的复制。从图8可看出，用抑制剂肽COVAl处理剂量依赖性强烈地减少ASFV基因组的复制。类似地，用其它阻断肽(PEP1和PEP3)预先温育，所述肽在DLC8结合基序中包含不影响P54-DLC8相互作用的改变，也导致ASFV基因组复制的减少，尽管用COVAl序列处理以较低的肽浓度(25μΜ)是有效的。病毒DNA复制在肽处理后的这种减少是这些肽对感染的抑制的结果。然后，通过该灵敏的定量方法，可以在所述肽内确定可以妨碍P54-DLC8键合和干涉感染，存在可以在体内更有效阻断感染的给定序列(图8).1.3.4.5.肽处理对ASFV感染过程中的病毒后代产生的影响将生长在24-孔板中的9χ104非洲绿猴肾细胞系细胞用不同浓度的肽COVAl和RS28在37°C处理1小时，如在材料和方法部分所述。然后，将细胞以0.5pfu/细胞用BA71V感染或假感染。在感染后36小时(36hpi)，通过噬斑测定法分析来自感染的细胞培养物的胞外和胞内病毒后代。如在图9中所示，当在存在50μM或更大浓度的COVAl的条件下进行感染时，在所计算的胞外(图9Β)和胞内(图9Α)病毒滴度中观察到统计学显著的减少。然而，用不同浓度的阴性对照肽RS28温育不影响病毒滴度，并且所获得的病毒后代数值与不存在肽的条件下来自感染细胞的那些相似。1.3.5.细胞毒性分析。肽处理对细胞存活力和增殖的影响。为了评估任何细胞毒性或副作用是否与用所述肽对非洲绿猴肾细胞系细胞的处理相关，进行细胞增殖和细胞存活力测定。在这些实验中，当与用阴性对照肽RS28处理的细胞比较时，在用不同浓度的COVAl肽处理后的细胞增殖数值没有减少(图10)。用COVAl获得的增殖数值与在不存在肽的条件下在对照细胞中获得的那些相似。此外，在用不同的肽(抑制剂或对照肽)温育后，细胞存活力百分数没有改变，如Tripan-blue排除测定所判断的那样。在所有情形中，细胞存活力百分数约为90%。这些结果证明，用本发明所述的肽温育不影响非洲绿猴肾细胞系细胞的增殖或存活力。1.3.5.1.细胞结构和DLC8功能整合我们检测与微管发动动力蛋白相关的主要细胞结构是否被肽治疗改变。与肽内在化一起，我们分析了细胞骨架成分的完整性，并且我们观察到，在存在肽C0VA2的条件下，微管没有被改变(图11)。此外，微管上的轻链动力蛋白分布模式保持在与微管组织中心(MTOC)相对应的致密区域(图11)。已知动力蛋白功能在有丝分裂中是重要的，在有丝分裂纺锤体的形成和染色体的迁移中起作用，并且我们发现细胞分裂没有改变(图12)。1.3.5.2.萤光素标记的C0VA2肽的细胞分布模式萤光素标记的肽C0VA2表现出与用针对完整DLC8分子的多克隆抗体染色的DLC8相似的分布。DLC8可在细胞质中与所选的调控细胞器转运的货物、RNA和向微管负端(向核仁)的蛋白相互作用，并且其功能对于有丝分裂后细胞器如高尔基体的重新放置是基本的。有趣的是，C0VA2肽与DLC8分子的动力区室精确共同定位。荧光肽主要分布在细胞质区域、细胞突出物、丝状伪足(filopodia)和在其余细胞中的细胞接触中。在进行有丝分裂的细胞中，它保持在外周细胞质区域中直到发生晚期有丝分裂。然后，在进行核分裂的细胞和子代细胞中，C0VA2染色增加，并且在有丝分裂后进行细胞器再分布的那些细胞中在所有的细胞质区域是非常致密的(图13)。使用染色完整DLC8分子的抗体，在有丝分裂后，在活性重置细胞器的细胞中，共同定位的百分数较高。然后，发现其是细胞中与DLC8介导的转运相联系的动力区室的选择性标记。这些结果清楚地表明，可以使用基于在不同病毒分离株的病毒p54中存在的DLC8结合基序而专门设计的防止两种蛋白之间的相互作用的肽来抑制(ASFV的)病毒感染。这种抑制反映在对致细胞病变作用的抑制、感染细胞数目的急剧减少、每细胞病毒基因组拷贝数的急剧减少(其反映在细胞中发现的以ng/μ1为单位的病毒复制的减少)、和因此引起的病毒生产和病毒蛋白合成的显著减少。总之，本发明首次使用基于病毒通过其结合动力蛋白DLC8的序列设计的肽，所述病毒结合动力蛋白DLC8是感染成功的必需步骤，并且所述肽表现出在易感细胞中有效抑制病毒感染且具有可证明的抗病毒作用。参考书目1.Alonso,C.,等人’Africanswinefevervirusp54proteininteractswiththemicrotubularmotorcomplexthroughdirectbindingtolight-chaindynein(非洲猪瘟病毒p54蛋白通过直接结合轻链动力蛋白与微管动力复合体相互作用)·JVirol(病毒学杂志)，2001.75(20):ρ·9819-27.2.Harrison,Α.禾口S.Μ·King,Themolecularanatomyofdynein(云力力蛋白的分子剖析)·EssaysBiochem(生物化学测定)，2000.35:ρ·75-87.3.King,S.Μ.,Organizationandregulationofthedyneinmicrotubulemotor(动力蛋白微管动力的组织和调控).CellBiolInt(国际细胞生物学),2003.27(3):p.213-5.4.Enjuanes,L.，等人，TitrationofAfricanswinefever(ASF)virus(瘟(ASF)病毒的滴定)·JGenVirol(基因病毒学杂志)，1976.32(3):ρ·471-7.5.Afonso,C.L.,^ΑCharacterizationofp30,ahighlyantigenicmembraneandsecretedproteinofAfricanswinefevervirus(p30白勺表征，p30为与猪癌病毒的高抗原性膜和分泌蛋白).Virology(病毒学)，1992.189(1):ρ·368-73.6.Melikov,K.禾口L.V.Chernomordik,Arginine_richcellpenetratingpeptides:fromendosomaluptaketonucleardelivery(富含精氨酸的穿透肽由内体摄入至细胞核递送).CellMolLifeSci(细胞分子生命科学)，2005.62(23)p.2739-49.7.Tabares,E.,^ΑProteinsspecifiedbyAfricanswinefevervirus.II.Analysisofproteinsininfectedcellsandantigenicproperties(猪;iS病毒特异性蛋白。II.对感染细胞中的病毒和抗原性特性的分析。)ArchVirol(病毒学报)，1980.66(2):ρ·119-32.8.Cobbold,C.禾口Τ·WiIeman，ThemajorstructuralproteinofAfricanswinefevervirus,p73,ispackagedintolargestructures,indicativeofviralcapsidormatrixprecursors，ontheendoplasmicreticulum.(非洲猪痕病毒的主要结构蛋白P73在内质网上包装成指示病毒衣壳或基质前体的大结构)JVirol(病毒学杂志)，1998.72(6):p.5215-23.9.Nunes,J.F.，J.D.Vigario,禾口A.Μ·Terrinha，UltrastructuralstudyofAfricanswinefevervirusreplicationinculturesofswinebonemarrowcells(非洲猪瘟病毒在猪骨髓细胞培养物中的复制的超结构研究).ArchVirol(病毒学学报)，1975.49(1):ρ·59-66.10.Martinez-Moreno,Μ.等人’RecognitionofnovelviralsequencesthatassociatewiththelightchaindyneinLC8identifiedthroughaρ印scantechnique(通过ρ印scan技术鉴定的与轻链动力蛋白LC8缔合的新病毒序列的知识)·FEBSLetters(FEBS通信)2003.544:262_267.11.King,D.P.,等K,DevelopmentofaTaqManPCRassaywithinternalamplificationcontrolforthedetectionofAfricanswinefevervirus(用于非洲猪瘟病毒检测的具有内部扩增对照的TaqManPCR测定法的开发).VirolMethods(病毒学方法).2003.107:53_61.12.Rodriguez-Crespo,I.,等人，IdentificationofnovelcellularproteinsthatbindtotheLC8dyneinlightchainusingapepscantechnique.(使用pepscari技术鉴定与LC8动力蛋白轻链结合的新型细胞蛋白)，FEBSLett.(FEBS通信)503135-141(2001).13.Lo,K.W.,等人，The8_kDadyneinlightchainbindstoisttargetsviaaconserved(K/R)XTQTmotif(8_kDa动力蛋白轻链通过保守(K/R)XTQT基序结合其靶标)·J.Biol.Chem.(生物化学杂志)27614059-14066(2001).14.Taylor,W.R.,Theclassificationofaminoacidconservation(氨基酸保守性的分类).JournalofTheoreticalBiology(理论生物学杂志)，119:205_218(1986).权利要求抗病毒组合物，其包括属于由SEQIDNO14或由其衍生的在至少一个氨基酸处具有保守变化且能够结合DLC8蛋白的任意序列表示的家族的肽。2.根据权利要求1的抗病毒组合物，其包括属于由SEQIDNO:1或由其衍生的在至少一个氨基酸处具有保守变化且能够结合DLC8蛋白的任意序列表示的家族的肽。3.根据权利要求1或2的抗病毒组合物，其特征在于所述肽还包含增加所述肽内在化到细胞中的工具。4.根据权利要求3的抗病毒组合物，其中将所述肽内在化到细胞中的所述工具由8个精氨酸的尾部组成。5.根据权利要求1-4中任一项的抗病毒组合物，其中所述肽选自SEQIDN0:3,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7，SEQIDNO8或SEQIDNO:9。6.根据权利要求1的抗病毒组合物，其中所述肽是SEQIDN0:2。7.根据权利要求1-6中任一项的抗病毒组合物，其还包括另一种活性化合物和/或任意药用载体、赋形剂、媒介物或稀释剂。8.根据前述权利要求中任一项的抗病毒组合物，其有效用于治疗归因于选自下列各项的病毒感染ASFV，人乳头瘤病毒，腺病毒，昆虫痘病毒A.moorei，痘苗病毒，呼吸道合胞病毒，人柯萨奇病毒，狂犬病毒，人单纯疱疹病毒，Mokola病毒或AIDS病毒。9.属于由SEQIDN0:14或SEQIDNO1或由其衍生的在至少一个氨基酸处具有保守变化且能够结合DLC8蛋白的任意序列表示的家族的肽，其缀合至可检测的荧光标记上或任何常用的标记上，所述标记允许优选利用二级抗体、荧光标记和生色团检测其。10.根据权利要求9的肽，其选自:SEQIDNO7,SEQIDNO:8禾口SEQIDNO:9。11.抗病毒化合物的选择及其功效评估的方法，其特征在于所述方法包括a)将细胞培养物用能够结合DLC8的化合物、其部分序列或通过保守置换序列的至少一个氨基酸产生的能够结合DLC8的类似序列或其部分序列预先温育或预先混合；b)将病毒与在步骤a)预先温育或混合的细胞培养物接触；c)在一定时间后检测并定量细胞内病毒感染的水平；d)通过不同方法将所述病毒感染水平与在没有与能够结合DLC8的化合物预先温育或预先混合的感染该病毒的细胞培养物中达到的病毒感染水平进行比较。12.评估肽、特别是病毒来源的肽向细胞中内在化和细胞的细胞质运输的方法，其通过目前所有的任意方法，诸如用可追踪的标记直接标记属于由SEQIDN0:14或SEQIDNO1表示的家族的一种肽，并且通过特异性测量由与所述肽结合的标记发射的信号、或间接地通过在二级抗体上的二级步骤标记检测。13.研究细胞中的动力蛋白的细胞生物学和功能的方法，其通过用可追踪的标记来标记属于由SEQIDN0:14或SEQIDNO1表示的家族的一种肽或对所述肽特异性的二级抗体，并且通过测量由与所述肽或与所述抗体结合的标记发射的信号来检测它而进行。14.根据权利要求12或13任一项的方法，其中所述肽或所述抗体用荧光分子如萤光素、罗丹明或本领域已知的允许通过直接的荧光显微镜检测的任何其它荧光标记进行标记。15.根据权利要求12或13任一项的方法，其中所述肽或所述抗体用任意非荧光标记如生物素、血细胞凝集素、c-myc或GST标记。16.根据权利要求12-15中任一项的方法，其中所述肽选自SEQIDN0:7，SEQIDNO8禾口SEQIDNO:9。17.选择抗病毒化合物和评估其抗病毒功效的方法，其特征在于包括a)获得单独的DLC8蛋白的RMN光谱作为对照光谱；b)用病毒蛋白预先温育DLC8足够的时间，以允许病毒蛋白和DLC8之间的相互作用，随后获得结合所述病毒蛋白的DLC8的RMN光谱；c)首先用抗病毒化合物预先温育DLC8足够的时间，以允许抗病毒-DLC8相互作用，随后加入病毒蛋白，温育足够时间，以允许DLC8-病毒蛋白相互作用，然后，获得DLC8光谱；d)将步骤c)中获得的光谱与步骤a)或b)中获得的那些进行比较，在步骤c)中获得的光谱与步骤a)的对照光谱越相似，检测到越大功效的干扰结合活性。全文摘要新的抗病毒肽干扰病毒与DLC8的结合，大量病毒来源的致病试剂在它们感染周期的某些点利用基于动力蛋白的细胞内转运系统。本发明由新型抗病毒治疗组成，所述新型抗病毒治疗由通过主要经由防止病毒蛋白和细胞DLC8蛋白之间的相互作用的干扰机制来抑制由利用动力蛋白系统的那些病毒引起的病毒感染组成。本发明首次公开了通过这样的肽对该相互作用功能的阻断，所述肽的序列包括病毒蛋白与DLC8结合结构域相对应的完整或部分序列或由其组成。文档编号C07K14/01GK101835795SQ200880112912公开日2010年9月15日申请日期2008年10月20日优先权日2007年10月24日发明者何塞·安赫尔·马丁内斯埃斯克里瓦诺,布鲁诺·艾尔奈斯德拉普拉萨,科瓦东加·阿隆索马蒂申请人:西班牙食品与饮料技术国家研究所;交替基因表达有限公司