MUC1^*抗体的制作方法

专利名称：MUC1^*抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及MUC1*的单克隆抗体及其用途。
背景技术：
MUCl受体是来自在许多人癌症中有牵连的粘蛋白家族的I型跨膜糖蛋白。据估计，所有固体肿瘤中约75%都异常表达MUCl受体。MUCl+癌症的组包括超过90%的乳腺癌，47%的前列腺肿瘤和高百分比的卵巢癌、直肠癌、肺癌和胰腺癌。存在这样一些证据，在 MUCl受体的正常功能中具有细胞粘附、繁殖和免疫响应作用。MUCl受体在癌症中的作用在文献中还没有被确定。然而，在细胞表面表达中的主要差异和在癌症中的受体模式已经被很好地证明。MUCl在健康细胞上的表达和在癌细胞上的表达之间最令人显著的差异是， 在健康细胞上，受体在顶边界成簇，而在癌细胞上受体是均勻分布于细胞的整个表面上。另外，还存在这样一些证据，这种受体除了模式异常之外在肿瘤细胞上是过表达的。MUCl的正常功能以及其与癌症的联系还没有明确确定。其中已知的是MUCl胞外域部分脱落或分裂并且能够在乳腺癌患者的血清中检测到。在乳腺癌患者中，脱落的MUCl 在血清中的水平有时被测量以监控患者对治疗的反应。MUCl的细胞质尾对于许多信号传输蛋白在基序中是丰富的。已经在文献中报道，作为常见的信号传输蛋白的GA2和S0S，都与 MUCl的细胞质尾有关。在科学文献中注意到，在癌细胞中，胞外域是低糖基化的。膜结合MUCl分裂产物，MUC1*，是在培养的癌细胞上和癌组织上这种蛋白的主要形式。MUC1*由细胞质尾、跨膜域和胞外域(ECD)的约45个氨基酸组成。尽管分裂的精确位点仍然还有些不确定。MUC1*在受到配体诱导的二聚作用活化时会刺激细胞生长。还存在几种情况是当期望增强一些细胞的生长并为此用于这样做的方便方法是通过加入二价抗-MUC1*抗体， 这会刺激二聚配体。在其它情况下，期望抑制MUCl*-阳性细胞生长。例如，许多癌细胞表达 MUC1*。MUCl-阳性癌细胞的生长在单价试剂结合于MUC1*并防止二聚时受到抑制。用于阻止MUC1*介导细胞生长的方便单价试剂是单价抗体。单价抗体能够是作为酶消化产物的抗体片段，或它们能够被设计以仅仅具有一个抗原结合位点。单价结合MUC1*的抗体还包括双特异性抗体，因为它们也抑制MUC1*的胞外域的二聚作用。采用多克隆抗体的MUCl*-介导的细胞生长的刺激(二价)和抑制(单价)识别MUCl生长因子受体(PSMGFR)序列(SEQ ID NO 1)及其变体的一级序列。这里，我们公开了识别PSMGFR序列及变体的单克隆抗体的产生。对于识别单克隆抗体还存在许多理由。例如，产生单抗体物种的杂交瘤提供了单抗体、单克隆的可再生供给，而不是具有各种亲和力的抗体的集合，其特异性和产生不完全是可再生的。每一批次的抗体来自不同的动物和不同的免疫化作用。相比而言，一旦识别产生具有所期望特性抗体的杂交瘤，那么通过维持该杂交瘤，就具有可再生的单物种抗体的无限供给。另外，一旦抗体的单克隆或单物种被识别，则就能够确定抗体或其可变区的序列。这能够激活许多形式的蛋白设计和重组DNA技术，其能够例如用于制备抗体衍生物，包括但不限于单链、双特异性的双特异抗体和抗体化学融合或抗体蛋白融合。例如，已知抗体序列能够产生由通过接头序列连接的可变轻和重链区组成的单价单链抗体。根据靶，这也可能期望产生其中每一可变区(重和轻链)识别不同靶的双特异性抗体。

发明内容
本发明包括使用的MUC1*抗体和抗体衍生物。本发明进一步包括使用的编码 MUC抗体的基因，其可以用于重组刺激物种如MMP-14或TACE或其它MUCl分裂酶如匪23 这种针对MUC1*的天然配体的其它MUC1*的基因等。这些基因用于刺激MUC1*生长因子受体在细胞内或在宿主动物或人中的活性。在一个实施方式中，编码MUC1*抗体的核酸插入到组织特异性启动子的下游并正好在卵和精子完全融合以产生转基因动物之前注射到原核或类似物中。这将产生会自发形成肿瘤或会是更易于形成肿瘤的小鼠或其它转基因动物。类似地，编码抗-MUC1*抗体的基因同时注射或插入到也编码另一个促进肿瘤基因以加强肿瘤形成的质粒中。通过将MUC1、MUC1*或MUC1*刺激剂的基因引入而提高对类干细胞生长刺激的方法用于接收动物或人以及体外细胞培养基中。在一个实施方式中，编码MUC1*抗体的质粒外源性加入或转染到抗体产生杂交瘤中以便经由MUC1*刺激通过提高细胞生长速率并赋予细胞对细胞死亡的耐受性而提高抗体产生。在本发明的这个方面，抗体产生细胞的生长被增强而没有污染作为期望抗体的产物。抗体产生细胞典型地生长于包含减少血清的培养基中，因为血清组分自身包含许多抗体。在细胞培养基中减少血清量使继续污染减到最小而且还降低了细胞生长和期望抗体的总产率。加入外源性抗-MUC1*或转染编码抗-MUC1* 的质粒提高了细胞生长和存活，同时单个已知抗体能够选择性地从作为期望抗体的产物中纯化出来。加入使配体如匪23 二聚的MUC1*可以可替换地使用。在一个实施方式中，将MUC1*刺激抗体给予患者用于脓毒症治疗。许多细胞类型响应于应激而提高MUC1*的表达。患者因为大量细胞死亡而迅速招致脓毒症。向患者给予 MUC1* 二聚剂如其天然配体NM23或其同源抗体会提高细胞存活，同时患者用杀死感染剂的制剂治疗而由此提高患者存活率。在另一个实施方式中，将MUC1*刺激抗体给予患有其中期望降低细胞死亡数量的感染的患者。例如，一些病原局部作用且迅速地破坏组织。MUC1*刺激抗体或者全身性给药或者局部给药以降低或防止病原诱导的细胞死亡。在另一个实施方式中，编码MUC1*刺激抗体的基因能够插入到新受精卵中以制成原生细胞，如干细胞，其中所得到的细胞产生其自身的MUC1*刺激配体，这加强或诱导多能性和其它类干细胞性质。在本发明的一个方面，本发明涉及一种分离的MUC1*的单克隆抗体。该抗体对于 MUC1*可以是二价的或单价的。这种抗体可以特异性地结合于SEQ ID NO :1的氨基酸序列。这种单克隆抗体可以具有在⑶Rl区中的重链可变区内的与NYGMN(SEQ ID NO :330)、GYAMS (SEQ ID NO :331)或 R/GYA/GMS (SEQ ID NO :332)至少 90% 同一性或与选自 SEQ ID NOS :172-184中的序列至少90%同一性的氨基酸序列；在CDR2区中的与WINTYTGEPTYA/ VG/DDFKG(SEQ ID NO :333)或 TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO :334)至少 90% 同一性或与选自SEQ ID NOS :198-210中的序列至少90%同一性的氨基酸序列；在⑶R3区中的与S/ TGT/DT/AXXY/FYA(SEQ ID NO :335)、TGTTAILNG(SEQ ID NO :336)、SGDGYffYYA(SEQ ID NO 337)或DNYGXXYDYG/A(SEQ ID NO :338)至少 90% 同一性或与选自 SEQ ID NOS :224-236 中的序列至少90%同一性的氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在⑶Rl区中的与NYGMN(SEQ ID NO :330)、GYAMS(SEQ ID NO 331)或 R/GYA/GMS (SEQ ID NO :332)至少 90% 同一性的序列；以及(ii)在 CDR2 区中的与 WINTYTGEPTYA/VG/DDH(G(SEQ ID NO :333)或 TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO: 334))至少90%同一性的序列。这种单克隆抗体可以具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序歹Ij ⑴在 CDRl 区中的与 NYGMN(SEQ ID NO :330)、GYAMS(SEQ ID NO :331)或 R/ GYA/GMS (SEQ ID NO :332)至少90%同一性的序列；以及(ii)在CDR3区中的与S/TGT/DT/ AXXY/FYA (SEQ ID NO :335)、TGTTAILNG (SEQ ID NO :336)、SGDGYWYYA (SEQ ID NO :337)或 DNYGXXYDYG/A(SEQ ID NO 338)至少90%同一性的序列。这种单克隆抗体可以具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在CDR2区中的与WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(SEQ ID NO 333)或 TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO :334)至少 90% 同一性的序列；以及(ii) 在 CDR3 区中的与 S/TGT/DT/AXXY/FYA (SEQ ID NO :335)、TGTTAILNG (SEQ ID NO :336)、 SGDGYffYYA(SEQ ID NO :337)或 DNYGXXYDYG/A(SEQ ID NO :338)至少 90% 同一性的序列。 这种单克隆抗体可以具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在CDRl区中的与 NYGMN (SEQ ID NO :330)、GYAMS (SEQ ID NO :331)或 R/GYA/GMS (SEQ ID NO :332)至少 90% 同一性的序列；(ii)在 CDR2 区中的与 WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(SEQ ID NO :333)或 TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO :334)至少 90% 同一性的序列；以及(iii)在 CDR3 区中的与 S/TGT/DT/AXXY/FYA (SEQ ID NO :335)、TGTTAILNG (SEQ ID NO 336), SGDGYffYYA (SEQ ID NO 337)或 DNYGXXYDYG/A (SEQ ID NO :338)至少 90% 同一性的序列。在另一个方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体具有在CDRl 区中的κ链(卡帕链)可变区内的与SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)或 RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :；340)至少90%同一性的氨基酸序列。这种单克隆抗体可以具有在CDRl区中的κ链可变区内的选自SEQ ID NOS :108-110和SEQ ID NOS :112-118中的氨基酸序列。这种单克隆抗体可以具有在CDR2区中的κ链可变区内的与S/GTSNLAS(SEQ ID NO :341)或LASNLES (SEQ ID NO :342)至少 90% 同一性或与选自 SEQ ID NOS :129-138 中的区域至少90%同一性的氨基酸序列；在CDR3区中的与QQRSS/NYPS/FT (SEQ ID NO :343) 或 QHSRELPFT (SEQ ID NO :344)至少 90% 同一性或与选自 SEQ ID NOS :149-158 中的序列的至少90%同一性的氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体具有在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列:(i)在CDRl区中的与SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339) 或RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :340)至少90%同一性的序列；以及(ii)在CDR2区中的与 S/GTSNLAS (SEQ ID NO :341) ^ LASNLES (SEQ ID NO :342)至少 90% 同一性的序列。这种单克隆抗体可以具有在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在CDRl区中的与 SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)或 RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :340)至少 90% 同一性的序列；以及(ii)在 CDR3 区中的与 QQRSS/NYPS/FT(SEQ ID NO 343)或 QHSRELPFT (SEQ ID NO 344)至少90%同一性的序列。这种单克隆抗体可以具有在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列⑴在CDR2区中的与S/GTSNLAS (SEQ ID NO :341)或LASNLES (SEQ ID NO 342)至少90%同一性的序列；以及(ii)在CDR3区中的与QQRSS/NYPS/FT(SEQ ID NO 343)或QHSRELPFT (SEQ ID NO :344)至少90%同一性的序列。根据权利要求1所述的单克隆抗体可以具有在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在CDRl区中的与 SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)或 RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO :340)至少 90% 同一性的序歹Ij ； (ii)在 CDR2 区中在 CDR2 区中的与 S/GTSNLAS(SEQ ID NO :341) ^ LASNLES (SEQ ID NO 342)至少90%同一性的序列；以及(III)在CDR3区中的与QQRSS/NYPS/FT (SEQ ID NO 343)或 QHSRELPFT (SEQ ID NO :344)至少 90% 同一性的序列。在另一方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在CDRl区中的与NYGMN(SEQ ID NO :330)、GYAMS(SEQ ID NO 331)或 R/GYA/GMS (SEQ ID NO :332)至少 90% 同一性的序列；(ii)在 CDR2 区中的与 WINTYTGEPTYA/VG/DDH(G(SEQ ID NO :333)或 TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO :334)至少 90% 同一性的序列；禾口 (III)在 CDR3 区中的与 S/TGT/DT/AXXY/FYA(SEQ ID NO :335)、 TGTTAILNG(SEQ ID NO :336)、SGDGYWYYA (SEQ ID NO :337)或 DNYGXXYDYG/A (SEQ ID NO: 338)至少90%同一性的序列；以及在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在 CDRl 区中的与 SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)或 RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO :340) 至少90%同一性的序列；(ii)在CDR2区中在CDR2区中的与S/GTSNLAS (SEQ ID NO :341) 或LASNLES(SEQ ID NO :342)至少90%同一性的序列；禾口 (iii)在CDR3区中的与QQRSS/ NYPS/FT (SEQ ID NO :343)或 QHSRELPFT (SEQ ID NO :344)至少 90% 同一性的序列。在又一个方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体具有在CDRl区中的与SEQ ID NO :331至少90%同一性、在CDR2区中的与SEQ ID NO :334至少90%同一性、 和在⑶R3区中的与SEQ ID NO :374至少90%同一性的在重链可变区内的氨基酸序列；以及在CDRl区中的与SEQ ID NO :340至少90%同一性、在CDR2区中的与SEQ ID NO :342至少90%同一性、和在⑶R3区中的与SEQ ID NO :344至少90%同一性的在轻链可变区内的氨基酸序列。在另一个方面，这种单克隆抗体可以具有在⑶Rl区中的与SEQ ID NO :332至少 90%同一性、在⑶R2区中的与SEQ ID NO :3；34至少90%同一性、和在⑶R3区中的与SEQ ID NO :338至少90%同一性的在重链可变区内的氨基酸序列；以及在⑶Rl区中的与SEQ ID NO :339至少90%同一性、在CDR2区中的与SEQ ID NO :341至少90%同一性、和在CDR3区中的与SEQ ID NO :343至少90%同一性的在轻链可变区内的氨基酸序列。在又一个方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :353至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :355至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :357至少90%同一性的FWR3序列、 或与SEQ ID NO 359 90%同一性的FWR4序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :345至少 90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :347至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID N0:349至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO :351至少90%同一性的FWR4序列。在又一个方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :362至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO 363至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :364至少90%同一性的FWR3序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :365至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :366 至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :367至少90%同一性的FWR3序列。在另一个方面，本发明涉及一种抗体，所述抗体进一步包含人FWR序列，所述人 FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :353至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO 355至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :357至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO :35990%同一性的FWR4序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :345至少90% 同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :347至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :349 至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO :351至少90%同一性的FWR4序列。在另一个方面，本发明涉及一种抗体，所述抗体包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :368至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :369至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :370至少90%同一性的FWR3序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO 371至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :372至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :373至少90%同一性的FWR3序列。在另一个方面，本发明涉及人源化的单克隆抗体，其中优选框架区是已知的人框架序列。在另一个方面，本发明涉及一种编码以上描述的单克隆抗体的分离的核酸。本发明进一步涉及一种表达以上描述的单克隆抗体的分离的杂交瘤。这种抗体可以是Fab或单链单价抗体。这种抗体可以是双特异性的，其中一个识别面结合于SEQ ID NO 1的肽，而另一个识别面识别另一个表位。另一个表位可以是HER2或DLL4。本发明还涉及特异于MUC1*的scFv融合蛋白，其中，类免疫球蛋白VH域连接于类免疫球蛋白VL域，其中所述VH链和所述VL链经由肽接头连接。在另一方面，本发明涉及一种抑制细胞增殖的方法，包括使表达MUC1*的细胞与以上描述的单价单克隆抗体接触。这种细胞可以是癌细胞。在又一个方面，本发明涉及一种提高细胞增殖的方法，包括使表达MUC1*的细胞与以上描述的二价单克隆抗体接触。这种细胞可以是多能细胞或祖细胞。本发明的这些和其它目的由以下本发明的描述、所附的参考附图以及所附的权利要求将更加全面理解。


本发明由本文以下所给出的详细描述和仅以举例说明的方式给出而由此并非限制本发明的附图会变得更加全面地理解，其中图1示出了所选择杂交瘤克隆的上清液通过标准ELISA特异性结合至免疫肽(GT INVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQ SGA(SEQ ID NO :1)。图2示出了 MIN-C2抗体特异性结合于细胞表面上的MUC1* 将来自MIN-C2杂交瘤克隆的纯化抗体1 100稀释，随后对结合于活细胞表面进行测试。荧光活化的细胞分选(FACS)显示MIN-C2并未结合于MUCl阴性细胞，用任一个空载体(HCT-VEC8)转染的 HCT-116细胞，但是确实结合于用MUC1*(HCT-MUC1*-10 胞外域仅仅由GTINVHDVETQFNQYKT EAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO 1 组成)转染的 HCT-116 细胞。MIN-C2 类似地结合于MUCl-阳性乳腺癌细胞ZR-75-1。图3示出了 MIN-E6抗体特异性结合于细胞表面上的MUC1* 对来自MIN-E6 杂交瘤克隆的上清液进行结合于活细胞表面的测试。荧光活化的细胞分选(FACS)显示MIN-E6并未结合于MUCl阴性细胞，用任一个空载体(HCT-VEC8)转染的HCT-116细胞，但是确实结合于用MUC1*(HCT-MUC1*-10 胞外域仅仅由GTINVHDVETQFNQYKTEAASR YNLTI SDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO :1 组成)转染的 HCT-116 细胞。MIN-E6 类似地结合于MUCl-阳性乳腺癌细胞ZR-75-1。图4示出了通过MIN-C2单克隆抗体刺激细胞增殖在基于细胞的分析中，显示出单克隆抗体MIN-C2基本上具有与采用免疫肽SEQ ID NO :1或2产生的多克隆抗体相同的功能。当纯化的MIN-C2在分析开始时加入细胞培养物中时MUCl阳性乳腺癌细胞系T47D 的生长按照浓度依赖性方式受到刺激，随后4 之后再次受到刺激。钟形曲线是受体的配体诱导二聚作用的特性；在过量时，抗体结合于每一个受体而不是一个抗体二聚化每两个受体。图5示出了通过MIN-E6单克隆抗体刺激细胞增殖在基于细胞的分析中，显示出单克隆抗-MUC1*抗体MIN-E6基本上具有与采用免疫肽SEQ ID NO 1或2产生的多克隆抗体相同的功能。当纯化的MIN-E6在分析开始时加入细胞培养物中时MUCl阳性乳腺癌细胞系T47D的生长按照浓度依赖性方式受到刺激，随后4 之后再次受到刺激。钟形曲线是受体的配体诱导二聚作用的特性；在过量时，抗体结合于每一个受体而不是一个抗体二聚化每两个受体。图6示出了由MINC-2和MIN-E6抗体通过木瓜蛋白酶消化制备Fab片段。消化的抗体运行于4% 20%的非减少SDS-PAGE上。这种消化由MIN-C2和MIN-E6 (条带(Lane) 2 和4)两者产生Fab的预期尺寸( 50kD)。图7A-7B示出了 A. MIN-C2和B. MIN-E6单克隆抗体的Fab片段与结合于靶肽的整个抗体竞争在ELISA竞争分析中，将对应于MUC1* (SEQ ID NO=D的胞外域的序列的合成肽吸附到孔板上，随后通过母体的、完整的单克隆抗体结合。为了测试通过木瓜蛋白酶消化产生的Fab与母体抗体结合于MUC1*肽竞争的能力，加入了改变浓度的Fab。在冲洗步骤之后，ELISA通过标准方法进行处理。图示出了 Fab与母体抗体结合于同源肽的竞争。图8示出了 MUCl-阳性癌细胞增殖通过MIN-C2 Fab的抑制检测了 MIN-C2的单价形式，即MIN-C2 Fab抑制MUCl阳性乳腺癌细胞系T47D增殖的能力。该实验在96h的时间内采用生长于含3%血清的培养基中的细胞完成；Fab在实验开始时加入并在4 之后再次加入。细胞在血细胞计数器上计数。图9示出了通过MIN-E6 Fab抑制MUCl-阳性癌细胞增殖检测了 MIN-E6的单价形式，即MIN-E6 Fab抑制MUCl阳性乳腺癌细胞系T47D增殖的能力。该实验在96h的时间内采用生长于含3%血清的培养基中的细胞完成；Fab在实验开始时加入并在4 之后再次加入。细胞在血细胞计数器上计数。测试了 Fab的聚乙二醇化(MIN-E6 PEG)以及未聚乙二醇化形式。MIN-E6 PEG显示了由于半衰期升高推测的活性升高。
图10A-10D示出了重组抗体变体的草图。A)示出了由通过接头连接的重链和轻链的可变区构成的单链可变区(scFv)抗体片段；B)示出了除了可变域之外的单链 Fab(ScFab),其包含至少部分重链和轻链恒定区；重链和轻链通过接头连接；C)示出了重链和轻链通过接头连接的单链Fab(ScFab)。重链和轻链通常在相同的细胞内分开表达。重链和轻链自发结合或能够将半胱氨酸引入以有助于结合；D)示出了由可变域构成的双特异性单链抗体变体(bscFv)。所示的bscFv识别MUC1*和HER2受体。图11示出了抗_MUCl*IgG单克隆抗体轻链可变区序列。图12示出了抗_MUCl*IgG单克隆抗体重链可变区序列。图13示出了抗_MUCl*IgM单克隆抗体轻链可变区序列。图14示出了抗_MUCl*IgM单克隆抗体重链可变区序列。图15示出了 MIN-C2 (单链片段可变)设计(重链可变_接头-轻链可变)氨基酸序列。这种scFv构建体表达于细菌中并采用C-端多-组氨酸(HHHHHH)标记纯化。图16示出了 MIN-E6 scFv (单链片段可变)设计重链可变(MIN-E6VH7)-接头-轻链可变)的氨基酸序列。这种scFv构建体表达于细菌中并利用C-端多-组氨酸(HHHHHH) 标记进行纯化。图17示出了确证表达于细菌中随后通过NTA-Ni++亲和色谱纯化的MIN-C2 scFv 纯化的SDS-PAGE凝胶。图18A和18B示出了亲和纯化的重折叠(refolded)MIN-C2 scFv改善特异性结合超过10倍重折叠MIN-C2 scFv通过在非变性条件下流过包含MUC1*胞外域肽(SEQ ID NO 1)的柱子进行亲和纯化。MIN-C2SCFv，S在重折叠蛋白纯化之前和之后都通过ELISA以抗原亲和色谱对结合至吸附到ELISA板上的SEQ ID NO 1肽的能力进行测试。亲和纯化蛋白具有大约10倍的较高特异性活性。图 19 示出了 MIN-C2 scFv 识别活细胞上的 MUC1*(FACS) :MIN_C2scFv，+ 结合于 Alexa 488 (Qiagen)的二级抗体抗-Penta-His，用 MUCl-阳性乳腺癌细胞(ZR-75-1/1500) 细胞培养并通过FACS分析。MUCl-阴性对照细胞，HCT-116-VEC8细胞并不通过MIN-C2 scFv 进行染色。图20示出了通过靶肽亲和纯化的MIN-C2 scFv抑制癌细胞生长MUC1_阳性乳腺癌细胞系ZR-75-1 (aka 1500)和MUCl-阴性HCT-116结肠癌细胞系采用已经在包含对应于 MUC胞外域的肽的柱子上亲和纯化的MIN-C2 scFv的改变浓度进行处理。实验在的时间内以3%含血清培养基实施。scFv两次加入。图21A-21B示出了 2片MIN-C2 Fab构建体和表达的蛋白MIN_C2重链区和轻链区分别克隆到细菌表达载体中。A.来自细胞RNA的MIN-C2重链和κ链的PCR产物；和 B. MIN-C2 Fab重链的细菌蛋白表达。图22示出了以上MIN-C2 Fab多肽的N-端与Ig κ前导序列 (METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID NO :328))对于有效分泌的融合。C-端与 myc 标记 (EQKLISEEDL(SEQ ID NO :3 ))和多组氨酸(HHHHHH)标记融合而有助于纯化。由此组装的MIN-C2 FAb采用允许高复制的游离型复制的载体，pCEP4(Invitrogen，Carlsl3ad，CA)表达于哺乳动物细胞中。图23示出了具有对应于正确MIN-C2 scFab (单链Fab) DNA组装的分子量带的DNA凝胶。图M示出了对于刺激人胚胎干细胞多能性生长的抗-MUC1*兔多克隆抗体与小鼠单克隆MIN-C2的对比；荧光显示细胞多能性。实验表明单克隆MIN-C2在二者刺激多能干细胞生长方面类似于多克隆抗体发生作用。
具体实施例方式在所述本申请中，“一个”和“一种”用于指代单数和复数两种对象。如本文中所使用的，“MUC1生长因子受体”(MGFR)是与活化配体相互作用的MUCl 受体部分的功能定义意义，如生长因子或改性酶如裂解酶。MUCl的MGFR区是最接近于细胞表面的胞外部分并由大多数或所有PSMGFR定义，如下定义。MGFR既包括未改性的肽又包括已经经过酶修饰，如例如，磷酸化、糖基化等的肽。如本文中所使用的，"MUC1生长因子受体的基本序列”(PSMGFR)是指在一些情况下限定大多数或所有MGFR的肽序列、以及该肽序列的功能变体和片段。PSMGFR定义为SEQ ID NO :1，而其所有功能变体和片段具有可达20 (即1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14， 15，16，17，18，19或20)的任何整数值的氨基酸取代和/或在其N-端和/或C-端可达20 的任何整数值的氨基酸添加或缺失。在以上的上下文中的“功能变体或片段”是指具有特异性结合于配体或以其他方式特异性地与配体相互作用的能力的这样的变体或片段，所述配体特异性结合于SEQ D NO 1的肽或以其他方式特异性地与SEQ D NO 1的肽相互作用，而所述变体或片段不会强力结合于其它与自身有同一性的肽分子的同一性区域，使得肽分子会具有与其它同一性肽分子聚集(即自我聚集)的能力。作为SEQ NO 1的PSMGFR肽的功能性变体的PSMGFR的一个实例是SEQ ID NO :2，其通过包含一个-SPY-序列代替-SRY-而不同于 SEQ ID NO :1ο如本文中所使用的，“MUC1*”是指N-端截短而使得胞外域基本上由PSMGFR(SEQ ID NO 1)组成的MUCl蛋白。无文本序列列表关于除了 a、g、c、t之外的核苷酸符号的使用，它们遵循在WIPO标准ST. 25，附录 2,表1中所列出的约定，其中k表示t或g ；η表示a，c，t或g ;m表示a或c ；r表示a或g ； S表不c或g ;w表不a或t,而y表不c或toGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO :1)描述了从氨基酸1110至1155的MUCl的膜近端胞外区。GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO : 描述了从氨基酸1110至1155的MUCl的膜近端胞外区的变体。5‘ -ggaaagcttatagacagatgggggtgtcgttttggc-3‘ (SEQ ID NO :3)描述了包含 HindIII限制位点的PCR引物，IgGl恒定区反向引物。5‘ -ggaaagcttcttgaccaggcatcctagagtca-3‘ (SEQ ID NO 4)描述了包含 HindIII 限制位点的PCR引物，IgG2A恒定区反向引物。5‘-ggaaagcttaggggccagtggatagactgatgg-3‘ (SEQ ID NO 5) 7yIl^-HindI11 限制位点的PCR引物，IgG2B恒定区反向引物。5，cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtc-3‘ (SEQ ID NO 6)描述了包含 EcoRI 限制位点的PCR引物，重链FRl区正向引物1。5' cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtcwgg-3' (SEQ ID NO 7)描述了包含 EcoRI 限制位点的PCR引物，重链FRl区正向引物2。5，-ggtgtcgacggatacagttggtgcagcatc-3，(SEQ ID NO :8)描述了包含 Sail 限制位点的PCR引物，κ链恒定区反向引物。5，-gggagctcgayattgtgmtsacmcarwctmca-3‘ (SEQ ID NO 9)描述了包含 SacI 限制位点的PCR引物，κ链FRl区通用简并正向引物。gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtg c agcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtggg t cgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagag ac aatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaa g acttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgcca aaacgacacccccatctgtctat (SEQ ID NO 10)描述了 MIN-C2 重链可变区。EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKR LEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAM YYCARLG⑶NYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO :11) 描述了 MIN-C2重链可变区。gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgc ag ggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccaccca aactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacaga cttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttcc g ttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(SEQ ID NO :12) 描述了 MIN-C2K链可变区。DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPG QPPKLLIYLASNLESGVPARF SGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHS RELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(SEQ ID N0:i;3)描述了 MIN-C2 κ链可变区。ggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatca(SEQ ID NO 14)^ 7 ft 头。gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgc agcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggt c gcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagac a atgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaag act tgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgcca aaacg acacccccatctRtctatRRtRRaRRCRRatcaRRtRRaRRCRRatcaRRtRRaRRCRRatcaRaca ttgtgatca cacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagca aaagtgtcag tacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctea tctatcttgca tccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccct caacatccatc ctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgtt cggaggggggac caagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc (SEQ ID NO :15)描述了 MIN-C2 重链-接头-轻链。
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgc agcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggt c gcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagac a atgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaag act tgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgcca aaacg acacccccatctgtctatggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagaca ttgtgatca cacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagca aaagtgtcag tacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctca tctatcttgca tccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccct caacatccat cctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgtt cggagggggga ccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcctgt (SEQ ID NO :16)描述了 MIN-C2 重链-接头-轻链-Cys。EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKR LEffVATISSGGTYIYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAM YYCARLG⑶NYYEYFDVWGAGTTVTVS SAKTTPPSVYGGGGSGGGG SGG GGSDIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQR PGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGT DFTLNIHPVEEEDAATYYCQ HSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSVD(SEQ ID NO: 17)描述了 MIN-C2 重链-接头-轻链。EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTF SGYAMSffVRQTPEKR LEffVATISSGGTYIYYPDSVKGR FTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAM YYCARLG⑶NYYEYFDVWGAGTTVTVS SAKTTPPSVYGGGGSGGGG SG GGGSDIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQR PGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSG TDFTLNIHPVEEEDAATYYCQ HSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSC (SEQ ID NO 18)描述了 MIN-C2 重链-接头-轻链-Cys。gaggttaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtg c agcctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtggg tc gcaaccattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagaga ca atgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaag g gataactacggtagtagctacgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcc aaaacaacagccccatcggtctat (SEQ ID NO 19)描述了 MIN-E6 重链 _7 可变区。EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKR LEWVATISSGGTYIYYPDSVKGR FTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YYCARDNYGSSYDYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVY(SEQ ID NO: 20)描述了 MIN-E6重链-7可变区。gaggtaaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtg t agtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtggg tc gcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagag ac aatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaa g ggataactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca g ccaaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctag gatgcctggtcaag(SEQ ID NO :21)描述了 MIN-E6 重链 _8 可变区。EVKLEESG⑶LVKPGGSLKLSCVVSGFTF SRYGMSWVRQTPGKR LEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVS SAKTTAPSVYPLAPVCGD TTGSSVTLGCLVK(SEQ ID NO 22)描述了 MIN-E6 重链-8 可变区。gatattgtgatcacccagactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgc a gtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttata g cacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaat ca gccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcg g ggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc (SEQ ID NO :23)描述了 MIN-E6 κ 链可变区。DIVITQTTAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWI YSTSNLASGVPVRFSGSGYGT SYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFT FGSGTKLEIKRADAAPTVS(SEQ ID NO 24)描述了 ΜΙΝ_Ε6κ 链可变区。gaggttaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtg c agcctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtggg tc gcaaccattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagaga ca atgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaag g gataactacggtagtagctacgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagc c aaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctagg a tgcctggtcaagggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagatattgtgatcacc ca gactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaag ttac atacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctg ga gtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaaga t gctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa cgggctgatgctgcaccaactgtatcc (SEQ ID NO :25)描述了 MIN-E6 scFv 重链 7-接头-轻链 (VH+ 接头 +VL)。gaggttaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtg c agcctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggt c gcaaccattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagac a atgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagg gataactacggtagtagctacgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcc a aaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctagga tg cctRRtcaaRRRtRRaRRCRRatcaRRtRRaRRCRRatcaRRtRRaRRCRRatca^atattRtRatcacc cagact acagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaag ttacatac actggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctg gagtccc tgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaaga tgctgcc acttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa cgggct gatgctgcaccaactgtatcctgt (SEQ ID NO :26)描述了 MIN-E6 scFv-Cys :重链 7_ 接头-轻链-Cys (VH+ 接头 +VL+Cys)。EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKR LEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YYCARDNYGSSYDYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGD TTGSSVTLGCLVKGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQTTAIMSASPGEEVTL TCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTS NLASGVPVRFSGSGYGTSY SLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVS(SEQ ID NO:
27)描述了MIN-E6 scFv重链7-接头-轻链(VH+接头+VL)。EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKR LEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YYCARDNYGSSYDYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGD TTG SSVTLGCLVKGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQTTAIMSASPGEEVTL TCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTS NLASGVPVRFSGSGYGTSY SLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSC(SEQ ID NO:
28)描述了MIN-E6 scFv-Cys 重链 7_ 接头-轻链-Cys (VH+ 接头 +VL+Cys)。gaggtaaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgt agtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtc gcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagac a atgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaag gga taactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcag ccaaa acaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctag gatgcc tggtcaagggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagatattgtgatca cccagactac agcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgta agttacatacac tggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggctt ctggagtccctg ttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctga agatgctgccac ttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaat aaaacgggctgat gctgcaccaactgtatcc (SEQ ID NO :29)描述了 MIN-E6 重链 8_ 接头-轻链。gaggtaaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgt agtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtc gcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagac a atgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaag gga taactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcag ccaaa acaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctag gatgcc tRRtcaaRRRtRRaRRCRRatcaRRtRRaRRCRRatcaRRtRRaRRCRRatca^atattRtRatca cccagactac agcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgta agttacatacac tggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggctt ctggagtccctg ttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctga agatgctgccac ttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaat aaaacgggctgat gctgcaccaactgtatcctgt (SEQ ID NO :30)描述了 MIN-E6 重链 8_ 接头-轻链-Cys。EVKLEESG⑶LVKPGGSLKLSCVVSGFTFSRYGMSWVRQTPGKR LEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVS SAKTTAPSVYPLAPVCGD TT GSSVTLGCLVKGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQTTAIMSASPGEEVTL TCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYST SNLASGVPVRFSGSGYGTSY SLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVS(SEQ ID NO: 31)描述了 MIN-E6重链8-接头-轻链。EVKLEESG⑶LVKPGGSLKLSCVVSGFTFSRYGMSWVRQTPGKR LEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGD TTGSSVTLGCLVKGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQTTAIMSASPGEEVTL TCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTS NLASGVPVRFSGSGYGTSY SLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSC(SEQ ID NO: 32)描述了 MIN-E6重链8-接头-轻链-Cys。5，-gggaattccaccatggratgsagctgkgtmatsctctt-3' (SEQ ID NO :33)描述了包含 EcoRI限制位点的PCR引物，伽玛正向-U5' -gggaattccaccatgracttcgggytgagctkggtttt-3' (SEQ ID NO 34) ffi述了包含 EcoRI限制位点的PCR引物，伽玛正向_2。5，-gggaattccaccatggctgtcttggggctgctcttct-3' (SEQ ID NO :3 5)描述了包含 EcoRI限制位点的PCR引物，伽玛正向_3。5‘-gggaattccaccatggrcagrcttacwtyy-3‘ (SEQ ID NO 3 6)描述了包含 EcoRI 限制位点的PCR引物，伽玛正向_4。5‘-ctacctcgagckyggtsytgctggcygggtg-3‘ (SEQ ID NO 3 7)描述了包含 XhoI 限制位点的PCR引物，伽玛反向。5‘ -gggaattccaccatggagacagacacactcctgctat-3‘ (SEQ ID NO :38)描述了包含 EcoRI限制位点的PCR引物，κ正向-1。5，-gggaattccaccatggattttcaggtgcagattttcag-3' (SEQ ID NO :39)描述了包含 EcoRI限制位点的PCR引物，κ正向-2。5‘ -gggaattccaccatgragtcacakacycaggtcttyrta-3‘ (SEQ ID NO 40) Jffi^TyIl 含EcoRI限制位点的PCR引物，κ正向-3。5，-gggaattccaccatgaggkccccwgctcagytyctkggr-3' (SEQ ID NO :41)描述了包含EcoRI限制位点的PCR引物，κ正向-4。5‘ -gggaattccaccatgaagttgcctgttaggctgttg-3‘ (SEQ ID N0:42)描述了包含 EcoRI限制位点的PCR引物，κ正向-5。5‘-gggaattccaccatgatgagtcctgcccagttcc-3‘ (SEQ ID NO :43)描述了包含EcoRI 限制位点的PCR引物，κ正向-6。5‘ -ctacctcgagttaacactcattcctgttgaagc-3‘ (SEQ ID NO 44)描述了包含 XhoI 限制位点的PCR引物，κ反向。gaggtccagctggaggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgc agcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggt c gcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagac a atgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaag act tgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgcca aaacg acacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggat gcctgg tcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcaca ccttccc agctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccag cgagacc gtcacctgcaacgttgcccacccagccagcaggaccgcg (SEQ ID NO :45)描述了 MIN-C2 Fab 重链。gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgc ag ggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccaccc a aactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacaga cttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttcc gttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccac ca tccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaat g tcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaag aca gcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgt gagg ccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt (SEQ ID NO :46) ^ 了 MIN-C2 FabK 链。EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKR LEffVATISSGGTYIYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAM YYCARLG⑶NYYEYFDVWGAGTTVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQT NSM VTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSV TVPSSTWPSETVTCNVAHPASRTA(SEQ ID NO 47)描述了 MIN-C2 Fab 重链。DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPG QPPKLLIYLASNLE SGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHS RELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS EQLTSGGASVVCFLNNFYP KDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYER HNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO 48)描述了 MIN_C2Fab κ 链。RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGS ERQNGVLNSffTDQDSKDSTYSM SSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTS TSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO :49)描述了 MIN-C2 轻 CL 区氨基酸序列。FDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFP AVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETV TCNVAHPASRTA (SEQ ID NO 50)描述了 MIN-C2 重链 CHl 区氨基酸序列。DIVLTQSTEIMSASPGEKVTITCSASSSISYIHWFQQKPGTSPKLffIF GTSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTVSRMEAEDTATYYCQQRSNYPFTF GSGTKLQIKRADAAPTVS(SEQ ID NO 51)描述了 MIN-A2-1 轻链可变区氨基酸序列。DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKL WIYSTSNLASGAPARFSGSGSGT SYSLTVSRMESEDAATYYCQQRSSYP STFGGGTKLEIKRADAAPTVS (SEQ ID NO 52)描述了 MIN-A2-2 轻链可变区氨基酸序列。DIVLTQTTAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMYWFQQKPGTSPKLW IYSTSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPST FGGGTKLEIKRADAAPTVS (SEQ ID NO 53)描述了 MIN-C9-1 轻链可变区氨基酸序列。DIVITQSTAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYTYWFQQKPGTSPKLWI YSTSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPSTF GGGTKLEIKRADAAPTVS (SEQ ID NO 54)描述了 MIN-C9-2 轻链可变区氨基酸序列。DIVITQTPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKL WIYSTSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTVSRMESEDAATYYCQQRSSYP STFGGGTKLEIKRADAAPTVS (SEQ ID NO 55)描述了 MIN-D7-1 轻链可变区氨基酸序列。DIVLTQSTAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKL WIYSTSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTVSRMESEDAATYYCQQRSSYP STFGGGTKLEIKRADAAPTVS (SEQ ID NO :56)描述了 MIN-D7-2 轻链可变区氨基酸序列。
DIVMTQSPEIMSASPGEKVTITCSASSSISYIHWFQQKPGTSPKLffI FGTSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTVSRMEAEDTATYYCQQRSNYPFT FGSGTKLQIKRADAAPTVS (SEQ ID NO 57)描述了 MIN-F2-1 轻链可变区氨基酸序列。DIVITQSTEIMSASPGEKVTITCSASSSISYIHWFQQKPGTSPKLffIF GTSNLASGVPARFSGSGSGT SYSLTVSRMEAEDTATYYCQQRSNYPFTF GSGTKLQIKRADAAPTVS (SEQ ID NO 58)描述了 MIN-F2-2 轻链可变区氨基酸序列。EVKLQESGPELKKPGETVEISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKG LKWMGffINTYTGEPTYAGDFKGRF AFSLETSASTAYLQINTLKNEDTAT YFCARSGDGYWYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO 59) 描述了 MIN-A2-1重链可变区氨基酸序列。EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGK GLKWMGffINTYTGEPTYAGDFKGRF AFSLETSASTAYLQINTLKNEDT ATYFCARSGDGYWYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO 60) 描述了 MIN-A2-2重链可变区氨基酸序列。QVQLQESGPELKQPGETVK I SCKASGYTFTNNGMNffVKQAPGK GLKWMGffINTYTGEPTYADDFKGRFAF SLDTSASTAYLQINNLKNED MATYFCARTGTARAFYAMDYffGQGTSVT VSSTKTTAPSVY (SEQ ID NO 61)描述了 MIN-C9-1重链可变区氨基酸序列。QVQLQQSGPELKQPGETVK I SCKASGYTFTNNGMNffVKQAPGK GLKWMGffINTYTGEPTYADDFKGRFAF SLGTSASTAYLQINNLKNED MATYFCARTGTARAFYAMDYffGQGTSVT VSSTKTTAPSVY (SEQ ID NO :62)描述了 MIN-C9-2重链可变区氨基酸序列。EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFINYGMNWVKQAPGKG LKWMGffINTYTGEPTYVDDFKGRF AFSLETSARTAYLQINNLKNEDM ATYFCARTGTTAILNGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO 63) 描述了 MIN-D7-1重链可变区氨基酸序列。EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGK GLKWMGffINTYTGEPTYAGDFKGRF AFSLETSASTAYLQINTLKNEDT ATYFCARSGDGYWYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO :64) 描述了 MIN-D7-2重链可变区氨基酸序列。EVKLEESGPELKKPGETVKISCKASGYTFINYGMNWVKQAPGKG LKWMGffINTYTGEPTYVDDFKGRF AFSLETSARTAYLQINNLKNEDM ATYFCARTGTTAILNGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO 65) 描述了 MIN-F2-1重链可变区氨基酸序列。EVQLEQSGAELVRPGASVKLSCKALGYTFTDYEMHWVKQTPVH GLEffIGAIHPGSGGTAYNQKFKGKA TLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSA VYYCTNYGSFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVY(SEQ ID NO :66)描述了 MIN-F2-2重链可变区氨基酸序列。RCRLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFINYGMNWVKQAPGKG LKWMGffINTYTGEPTYVDDFKGRF AFSLETSARTAYLQINNLKNEDM ATYFCARTGTTAILNGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSCL(SEQ ID NO :67) 描述了 MIN-F2-3重链可变区氨基酸序列。EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFINYGMNWVKQAPGKG LKWMGffINTYTGEPTYVDDFKGRF AFSLETSARTAYLQINNLKNEDM ATYFCARTGTTAILNGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO 68) 描述了 MIN-F2-4重链可变区氨基酸序列。DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKR LIYATSSLDSGVPKRFSGSRSG SDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPHV RCffDQAGAETGCCTNC (SEQ ID NO 69)描述了 MIN-14 轻链可变区氨基酸序列。
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPG QPPRLLIYLVSNLESGVPARF SGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHI RELTRSEGGPSff (SEQ ID NO 70)描述了 MIN-17-1 轻链可变区氨基酸序列。DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTffLAffYQQKPGKSPQ LLIYAATSLADGVPSRFSGSGSG TKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTP WTFGGGTKLEIKRADAAPTV(SEQ ID NO 71)描述了 MIN-17-2 轻链可变区氨基酸序列。DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPG QPPRLLIYLVSNLESGVPARF SGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHI RELTRSEGGPSff (SEQ ID NO :72)描述了 MIN-29 轻链可变区氨基酸序列。DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPG QPPRLLIYLVSNLESGVPARF SGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHI RELTRSEGGPSff (SEQ ID NO 73)描述了 MIN-34 轻链可变区氨基酸序列。DIVMTQSQKFMSTSV⑶RVSVTCKASQNVGTNVGWYQQKPGQS PKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSG TDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYN NYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTV (SEQ ID NO 74)描述了 MIN-42 轻链可变区氨基酸序列。DIQMTQPPASLSASVGETVTITCRASGNIHNFLAWYQQKQGKSPQ LLVYNAKTLADGVPSRF SGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWS TPffTFGGGTKLEIKRADAAPTV(SEQ ID NO 75)描述了 MIN-45轻链可变区氨基酸序列。QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQ GLEffIGEINPSNGRTNYNEKFKSKA TLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAV YYCATYGNYffYF (SEQ ID NO 76)描述了 MIN-14 重链可变区氨基酸序列。QITLKESGPGIVQPSQPFRLTCTFSGFSLSTSGIGVTWIRQPSGKGLE WLATIffffDDDNRYNPSLKSR LTVSKDTSNNQAFLNIITVETADTAIYYC AQSTMVTA (SEQ ID NO 77)描述了 MIN-17-2 重链可变区
氨基酸序列。QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQ GLEffIGEINPSNGRTNYNEK-FKSK ATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCATYGNYffYF(SEQ ID NO 78)描述了 MIN-17-1 重链可变区氨基酸序列。DVKLVESG⑶LXKLTEGEDIWEGLTLCRDSDQSPLAPVSKPGRVV RPQRSCTVIQGCVLRLQTAHLQV QGVLGIVS⑶GESALHSVWIVGATTI TINGC DQLQPLLWSLANPRHVIATESESRGCTG(SEQ ID NO :7 描述了 MIN-四重链可变区氨基酸序列。QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGL EffLGVIffGGGSTDYNAAFISRLS ISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIY YCARNDYPAffF(SEQ ID NO 80)描述了 MIN-34 重链可变区氨基酸序列。EVQLVESGGDLVKPGRSLKLSCAASGFTFSSFGMSWVRQTPDKRL EffVATISSGGTYTYYPDSVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YYCSRRFYYDYD (SEQ ID NO 81)描述了 MIN-42 重链可变区氨基酸序列。cgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgc ct cagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacg aca aaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacg ttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccatt gtcaagagcttcaacaggaatgagtgt (SEQ ID NO 82)描述了 MIN-C2 轻链 CL 核苷酸序列。Ttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtcta t ccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccc t gagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtc t gacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgt tgcccacccagccagcaggaccgcg—(SEQ ID NO :83)描述了 MIN-C2 重链 CHl 核苷酸序列。EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMSWVMQSHGKS LEWIGRINPYNGDTFYNQKFKGKATLTVDKS STTAHIELRSLASEDSAV YYCARKGLYG(SEQ ID NO :84)描述了 MIN-45重链可变区氨基酸序列。gacatccagatgacccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcagtctcacttgt eg agcaagtcaggacattggtagtagcttaaactggcttcagcaggaaccagatggaactattaaacgcctgatct a cgccacatccagtttagattctggtgtccccaaaaggttcagtggcagtaggtctgggtcagattattctctcac ca tcagcagccttgagtctgaagattttgtagactattactgtctacaatatgctagttctcctcacgttcggtgc tggga ccaagctggagctgaaacgggc (SEQ ID NO :85)描述了 MIN-14 轻链可变区核苷酸序列。gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatac ag ggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccaccc a gactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacag a cttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttac a cgttcggaggggggaccaagctggaa(SEQ ID NO :86)描述了MIN-17-1 轻链可变区核苷酸序列。gacattcagatgacccagtctcctgcctcccagtctgcatctctgggagaaagtgtcaccatcacatgc ct ggcaagtcagaccattggtacatggttagcatggtatcagcagaaaccagggaaatctcctcagctcctgattt at gctgcaaccagcttggcagatggggtcccatcaaggttcagtggtagtggatctggcacaaaattttctttcaa ga tcagcagcctacaggctgaagattttgtaagttattactgtcaacaactttacagtactccgtggacgttcggt gga ggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgta(SEQ ID NO :87)描述了MIN-17-2 轻链可变区核苷酸序列。gtgacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctca tac agggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagcca c ccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctggga c agacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagct t acacgttcggaggggggaccaagctgg (SEQ ID NO :88)描述了 MIN-四轻链可变区核苷酸序列。gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatac ag ggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccaccc a gactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacag a cttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttac a cgttcggaggggggaccaagctgg(SEQ ID NO :89)描述了 MIN-M 轻链可变区核苷酸序列。gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgc a aggccagtcagaatgtgggtactaatgtaggttggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatt t actcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacaactatccgtacacgttcgga ggggggaccaagctggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgta(SEQ ID NO 90) Jffi^iT MIN-42 链可变区核苷酸序列。gacatccagatgactcagcctccagcctccctatctgcatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgt c gagcaagtgggaatattcacaattttttagcatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtct at aatgcaaaaaccttagcagatggtgtgccatcaaggttcagtggcagtggatcaggaacacaatattctctcaa g atcaacagcctgcagcctgaagattttgggagttattactgtcaacatttttggagtactccgtggacgttcggt gg aggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgta(SEQ ID NO :91)描述了MIN-45轻链可变区核苷酸序列。caggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgca a ggcttctggctacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtgg a ttggagagattaatcctagcaacggtcgtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgta g acaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaa cctatggtaactactggtacttc (SEQ ID NO 92)描述了 MIN-14 重链可变区核苷酸序列。caggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgca a ggcttctggctacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtgg a ttggagagattaatcctagcaacggtcgtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgta g acaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaa cctatggtaactactggtacttc (SEQ ID NO :93)描述 MIN-17-1 重链可变区核苷酸序列。cagattactctgaaagagtctggccctgggatagttcagccatcccagcccttcagacttacttgcact ttc tctgggttttcactgagcacttctggtataggtgtaacctggattcgtcagccctcagggaaaggtctggagt ggct ggcaacgatttggtgggatgatgataaccgctacaacccatctctaaagagcaggctcacagtctccaaaga ca cctccaacaaccaagcattcctgaatatcatcactgtggaaactgcagatactgccatatactactgtgctcag tct actatggttacggcggga(SEQ ID NO :94)描述了 MIN-17-2 重链可变区核苷酸序列。ccaggtgcagctgaagcagtcaggacctggcctagtgcagccctcacagagcctgtccatcacctgca cagtctctggtttctcattaactagctatggtgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggct g ggagtgatatggggtggtggaagcacagactataatgcagctttcatatccagactgagcatcagcaaggacaa ttccaagagccaagttttctttaaaatgaacagtctgcaagctaatgacacagccatatattactgtgccagaaatg actatccggcctggttt(SEQ ID NO 95)描述了 MIN-M重链可变区核苷酸序列。gtgaggtgcaactggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggaaggtccctgaaactctcctgt g cagcctctggattcactttcagtagctttggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtggg t cgcaaccattagtagtggtggtacttacacctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagag a caatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgttcaag aaggttctactatgattacgac (SEQ ID NO :96)描述了 MIN-42 重链可变区核苷酸序列。gaggttcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaag gcttctggttactcatttactggctactttatgagctgggtgatgcagagccatggaaagagccttgagtggattg g acgtattaatccttacaatggtgatactttctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaa at cctctaccacagcccacatagagctccggagcctggcatctgaggactctgcagtctattattgtgcaagaaag g gcctctatggg(SEQ ID NO :97)描述了 MIN-45重链可变区核苷酸序列。
DIVITQSTASLGVSLGQRATISC (SEQ ID NO :98)描述MIN-C2 轻链可变框架区 1 (FWRl)
氨基酸序列。DIVITQTTAIMSASPGEEVTLTC (SEQ ID NO :99)描述MIN-E6 轻链可变框架区 1 (FWRl)
氨基酸序列。DIVLTQSTEIMSASPGEKVTITC(SEQ ID NO :1 00)描述 MIN-A2-1 轻链可变框架区 1 (FWRl)氨基酸序列。DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTC (SEQ ID NO : 101)描述 MIN-A2-2 轻链可变框架区 1 (FWRl)氨基酸序列。DIVLTQTTAIMSASPGEKVTITC (SEQ ID NO : 102)描述 MIN-C9-1 轻链可变框架区 1 (FWRl)氨基酸序列。DIVITQSTAIMSASPGEKVTITC (SEQ ID NO : 103)描述 MIN-C9-2 轻链可变框架区 1 (FWRl)氨基酸序列。DIVITQTPAIMSASPGEKVTMTC (SEQ ID NO : 104)描述 MIN-D7-1 轻链可变框架区 1 (FWRl)氨基酸序列。DIVLTQSTAIMSASPGEKVTMTC (SEQ ID NO : 105)描述 MIN-D7-2 轻链可变框架区 1 (FWRl)氨基酸序列。DIVMTQSPEIMSASPGEKVTITC (SEQ ID NO : 106)描述 MIN-F2-1 轻链可变框架区 1 (FWRl)氨基酸序列。DIVITQSTEIMSASPGEKVTITC (SEQ ID NO : 107)描述 MIN-F2-2 轻链可变框架区 1 (FWRl)氨基酸序列。RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :108)描述 MIN-C2 轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)
氨基酸序列。SATSSVSYIH(SEQ ID NO : 109)描述MIN-E6轻链可变互补性决定区1 (CDRl)氨基
酸序列。SASSSISYIH(SEQ ID NO :110)描述 MIN-A2-1 轻链可变互补性决定区 I(CDRl)氨
基酸序列。SASSSVSYMH(SEQ ID NO :112)描述 MIN-A2-2 轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)氨
基酸序列。SASSSVSYMY (SEQ ID NO :113)描述 MIN-C9-1 轻链可变互补性决定区 I(CDRl)氨
基酸序列。SASSSVSYTY (SEQ ID NO :114)描述 MIN-C9-2 轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)氨
基酸序列。SASSSVSYMH(SEQ ID NO :115)描述 MIN-D7-1 轻链可变互补性决定区 I(CDRl)氨
基酸序列。SASSSVSYMH(SEQ ID NO :116)描述 MIN-D7-2 轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)氨
基酸序列。SASSSISYIH(SEQ ID NO :117)描述 MIN-F2-1 轻链可变互补性决定区 I(CDRl)氨
基酸序列。SASSSISYIH(SEQ ID NO :118)描述 MIN-F2-2 轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)氨基酸序列。WYQQRPGQPPKLLIY (SEQ ID NO 119)描述 MIN-C2 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。WFQQRPGTSPKLffIY (SEQ ID NO :120)描述 MIN-E6 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。WFQQKPGTSPKLffIF (SEQ ID NO :121)描述 MIN-A2-1 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WFQQKPGTSPKLffIY (SEQ ID NO :122)描述 MIN-A2-2 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WFQQKPGTSPKLffIY (SEQ ID NO :123)描述 MIN-C9-1 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WFQQKPGTSPKLffIY (SEQ ID NO :124)描述 MIN-C9-2 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WFQQKPGTSPKLffIY (SEQ ID NO :125)描述 MIN-D7-1 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WFQQKPGTSPKLffIY (SEQ ID NO :126)描述 MIN-D7-2 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WFQQKPGTSPKLffIF (SEQ ID NO :127)描述 MIN-F2-1 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WFQQKPGTSPKLffIF (SEQ ID NO :128)描述 MIN-F2-2 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。
LASNLES (SEQ ID NO 129)描述MIN-C2轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。STSNLAS (SEQ ID NO 130)描述MIN-E6轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。GTSNLAS (SEQ ID NO :131)描述MIN-A2-1轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。STSNLAS (SEQ ID NO : 132)描述MIN_A2_2轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。STSNLAS (SEQ ID NO :133)描述MIN-C9-1轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。STSNLAS (SEQ ID NO :1 34)描述MIN-C9-2轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。STSNLAS (SEQ ID NO :135)描述MIN_D7_1轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。STSNLAS (SEQ ID NO : 136)描述MIN_D7_2轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。GTSNLAS (SEQ ID NO :137)描述MIN_F2_1轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。
GTSNLAS (SEQ ID NO 138)描述MIN-F2-2轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ ID NO 架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID NO 架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYC(SEQ ID NO 框架区3(FWR3)氨基酸序列。GAPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYC(SEQ ID NO 框架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID NO 框架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID NO 框架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYC(SEQ ID NO 框架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYC(SEQ ID NO 框架区2(FWR2)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYC(SEQ ID NO 框架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYC(SEQ ID NO 框架区3(FWR3)氨基酸序列。
149)描述MIN-C2轻链可变互补性决定区3(CDR!3)氨基酸139)描述MIN-C2轻链可变框 140)描述MIN-E6轻链可变框 141)描述MIN-A2-1轻链可变 142)描述MIN-A2-2轻链可变 143)描述MIN-C9-1轻链可变 144)描述MIN-C9-2轻链可变 145)描述MIN-D7-1轻链可变 146)描述MIN-D7-2轻链可变 147)描述MIN-F2-1轻链可变 148)描述MIN-F2-2轻链可变
序列。
序列。
酸序列
酸序列
酸序列
酸序列
酸序列
酸序列
QHSRELPFT(SEQID NO
QQRSSSPFT(SEQID NO
QQRSNYPFT(SEQID NO
QQRSSYPST(SEQID NO
QQRSSYPST(SEQID NO
QQRSSYPST(SEQID NO
QQRSSYPST(SEQID NO
QQRSSYPST(SEQID NO
QQRSNYPFT(SEQID NO
150)描述MIN-E6轻链可变互补性决定区3(CDR!3)氨基酸
151)描述MIN-A2-1轻链可变互补性决定区3(CDR3)氨基
152)描述MIN-A2-2轻链可变互补性决定区3(CDR!3)氨基
153)描述MIN-C9-1轻链可变互补性决定区3(CDRIB)氨基
154)描述MIN-C9-2轻链可变互补性决定区3(CDRIB)氨基
155)描述MIN-D7-1轻链可变互补性决定区3(CDR3)氨基
156)描述MIN-D7-2轻链可变互补性决定区3(CDR!3)氨基
157)描述MIN-F2-1轻链可变互补性决定区3(CDR3)氨基酸序列。QQRSNYPFT (SEQ ID NO 158)描述 MIN-F2-2 轻链可变互补性决定区 3 (CDR3)氨基酸序列。EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO 区I(FWRl)氨基酸序列。EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。EVKLEESG⑶LVKPGGSLKLSCWSGFTFS(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。EVKLQESGPELKKPGETVEISCKASGYTFT(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。QVQLQESGPELKQPGETVKISCKASGYTFT(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。QVQLQQSGPELKQPGETVKISCKASGYTFT(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFI(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。EVKLEESGPELKKPGETVKISCKASGYTFI(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。EVQLEQSGAELVRPGASVKLSCKALGYTFT(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。RCRLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFI(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFI(SEQ ID NO 架区I(FWRl)氨基酸序列。
172)描述MIN-C2重链可变互补性决定区1(⑶Rl)氨基酸序列。
173)描述MIN-E6-7重链可变互补性决定区1(OTRl)氨基酸序159)描述MIN-C2重链可变框架 160)描述MIN-E6-7重链可变框 161)描述MIN-E6-8重链可变框 162)描述MIN-A2-1重链可变框 163)描述MIN-A2-2重链可变框 164)描述MIN-C9-1重链可变框 165)描述MIN-C9-2重链可变框 166)描述MIN-D7-1重链可变框 167)描述MIN-D7-2重链可变框 168)描述MIN-F2-1重链可变框 169)描述MIN-F2-2重链可变框 170)描述MIN-F2-3重链可变框 171)描述MIN-F2-4重链可变框列。列。列。列。
GYAMS(SEQ ID NO RYGMS(SEQ ID NO
RYGMS(SEQID NO
NYGMN(SEQID NO
NYGMN(SEQID NO
NNGMN(SEQID NO174)描述MIN-E6-8重链可变互补性决定区1 (OTRl)氨基酸序 175)描述MIN-A2-1重链可变互补性决定区1 (OTRl)氨基酸序 176)描述MIN-A2-2重链可变互补性决定区1 (OTRl)氨基酸序 177)描述MIN-C9-1重链可变互补性决定区1 (OTRl)氨基酸序列。NNGMN (SEQ ID NO :178)描述MIN-C9-2重链可变互补性决定区1 (CDRl)氨基酸序 列。NYGMN (SEQ ID NO :179)描述MIN-D7-1重链可变互补性决定区1 (CDRl)氨基酸序 列。NYGMN (SEQ ID NO :180)描述MIN-D7-2重链可变互补性决定区1 (CDRl)氨基酸序 列。NYGMN (SEQ ID NO :181)描述MIN-F2-1重链可变互补性决定区1 (CDRl)氨基酸序 列。DYEMH (SEQ ID NO :182)描述MIN-F2-2重链可变互补性决定区1 (CDRl)氨基酸序 列。NYGMN (SEQ ID NO :183)描述MIN-F2-3重链可变互补性决定区1 (CDRl)氨基酸序 列。NYGMN (SEQ ID NO :184)描述MIN-F2-4重链可变互补性决定区1 (CDRl)氨基酸序 列。WVRQTPEKRLEWVA (SEQ ID NO : 185)描述 MIN-C2 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸 序列。WVRQTPDKRLEWVA (SEQ ID NO : 186)描述 MIN-E6-7 重链可变框架区 2 (FWR^ 氨基
酸序列。WVRQTPGKRLEWVA (SEQ ID NO 187)描述 MIN-E6-8 重链可变框架区 2 (FWR^ 氨基
酸序列。WVKQAPGKGLKWMG (SEQ ID NO 188)描述 MIN-A2-1 重链可变框架区 2 (FWR^ 氨基
酸序列。WVKQAPGKGLKWMG (SEQ ID NO 189)描述 MIN-A2-2 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WVKQAPGKGLKWMG (SEQ ID NO : 190)描述 MIN-C9-1 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WVKQAPGKGLKWMG (SEQ ID NO : 191)描述 MIN-C9-2 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WVKQAPGKGLKWMG (SEQ ID NO : 19 描述 MIN-D7-1 重链可变框架区 2 (FWR^ 氨基
酸序列。WVKQAPGKGLKWMG (SEQ ID NO 19 描述 MIN-D7-2 重链可变框架区 2 (FWR^ 氨基
酸序列。WVKQAPGKGLKWMG (SEQ ID NO 194)描述 MIN-F2-1 重链可变框架区 2 (FWR^ 氨基
酸序列。WVKQTPVHGLEWIG (SEQ ID NO 195)描述 MIN-F2-2 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WVKQAPGKGLKWMG (SEQ ID NO 196)描述 MIN-F2-3 重链可变框架区 2 (FWR^ 氨基
酸序列。
WVKQAPGKGLKWMG(SEQ IDNO197)描述MIN-F2-4重链可变框架区2 (FWM)氨基酸序列。
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQIDNO198)描述MIN-C2重链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQIDNO199)描述 MIN-E6-7 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
TISGGGTYIYYPDSVKG(SEQIDNO200)描述 MIN-E6-8 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYA⑶FKG(SEQIDNO201)描述 MIN-A2-1 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYA⑶FKG(SEQIDNO202)描述 MIN-A2-2 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYADDFKG(SEQIDNO203)描述 MIN-C9-1 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYADDFKG(SEQIDNO204)描述 MIN-C9-2 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYVDDFKG(SEQIDNO205)描述 MIN-D7-1 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYA⑶FKG(SEQIDNO206)描述 MIN-D7-2 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYVDDFKG(SEQIDNO207)描述 MIN-F2-1 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
AIHPGSGGTAYNQKFKG(SEQIDNO208)描述 MIN-F2-2 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYVDDFKG(SEQIDNO209)描述 MIN-F2-3 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
WINTYTGEPTYVDDFKG(SEQIDNO210)描述 MIN-F2-4 1■链可变互补性决定区2(CDR2)氨基酸序列。
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCAR(SEQ ID NO :211)描述MIN-C2重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR(SEQID NO :21 描述 MIN-E6-7 重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTR(SEQID NO :21 描述 MIN-E6-8 重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFAFSLETSASTAYLQINTLKNEDTATYFCAR(SEQID NO :214)描述 MIN-A2-1 重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFAFSLETSASTAYLQINTLKNEDTATYFCAR(SEQID NO :21 描述 MIN-A2-2 重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFAFSLDTSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAR(SEQID NO :216)描述 MIN-C9-1 重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFAFSLGTSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAR(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDMATYFCAR(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。
RFAFSLETSASTAYLQINTLKNEDTATYFCAR(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDMATYFCAR(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。KATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTN(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDMATYFCAR(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。RFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDMATYFCAR(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。LG⑶NYYEY (SEQ ID NO 224)描述MIN-C2重链可变互补性决定区3 (CDR3)氨基酸序列。DNYGSSYDYA (SEQ ID NO :225)描述 MIN-E6-7 重链可变互补性决定区 3 (CDR3)氨
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基酸序列。SGDGYffYYA(SEQ 酸序列。SGDGYffYYA(SEQ 酸序列。TGTARAFYA(SEQ 酸序列。TGTARAFYA (SEQ 酸序列。TGTTAILNG(SEQ 酸序列。SGDGYffYYA(SEQ 酸序列。TGTTAILNG(SEQ 酸序列。YGSFA (SEQ ID NO :234)描述MIN-F2-2重链可变互补性决定区3 (CDR3)氨基酸序列。TGTTAILNG(SEQ ID NO :235)描述 MIN-F2-3 重链可变互补性决定区 3 (CDR3)氨基酸序列。
IDNO 217)描述MIN-C9-2重链可变
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ID NO 227)描述MIN-A2-1重链可变互补性决定区3 (⑶R3)氨基 ID NO 228)描述MIN-A2-2重链可变互补性决定区3(⑶氨基 ID NO 229)描述MIN-C9-1重链可变互补性决定区3 (CDR3)氨基 ID NO 230)描述MIN-C9-2重链可变互补性决定区3(CDR;3)氨基 ID NO 231)描述MIN-D7-1重链可变互补性决定区3 (⑶R3)氨基 ID NO 232)描述MIN-D7-2重链可变互补性决定区3(⑶氨基 ID NO 233)描述MIN-F2-1重链可变互补性决定区3 (⑶R3)氨基
TGTTAILNG(SEQ ID NO :236)描述 MIN-F2-4 重链可变互补性决定区 3 (CDR3)氨基酸序列。DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTC (SEQ 1 (FffRl)氨基酸序列。DIVLTQSPASLAVSLGQRATISY (SEQ 1 (FffRl)氨基酸序列。
DIQMTQSPASQSASLGESVTITC (SEQ 1 (FffRl)氨基酸序列。DIVLTQSPASLAVSLGQRATISY (SEQ 1 (FffRl)氨基酸序列。DIVLTQSPASLAVSLGQRATISY (SEQ 1 (FffRl)氨基酸序列。DIVMTQSQKFMSTSV⑶RVSVTC (SEQ 1 (FffRl)氨基酸序列。DIQMTQPPASLSASVGETVTITC (SEQ 1 (FffRl)氨基酸序列。RASQDIGSSLN(SEQ ID NO 244)描述 MIN-14 轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)氨基酸序列。RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :245)描述 MIN-17-1 轻链可变互补性决定区 I(OTRl)氨基酸序列。LASQTIGTffLA (SEQ ID NO :246)描述 MIN-17-2 轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)氨
基酸序列。RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :247)描述 MIN-四轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)
氨基酸序列。RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :248)描述 MIN-34 轻链可变互补性决定区 1 (CDRl)
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酸序列。WYQQKPGKSPQLLIY (SEQ ID NO 253)描述 MIN-17-2 轻链可变框架区 2 (FWM)氨基酸序列。WNQQKPGQPPRLLIY (SEQ ID NO :254)描述 MIN-四轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。WNQQKPGQPPRLLIY (SEQ ID NO :255)描述 MIN-34 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸
ID NO 237)描述MIN-14轻链可变框架区 ID NO 23 8)描述MIN-17-1轻链可变框架区 ID N0:239)描述MIN-17-2轻链可变框架区 ID NO 240)描述MIN-四轻链可变框架区 ID NO 241)描述MIN-34轻链可变框架区 ID NO 242)描述MIN-42轻链可变框架区 ID NO 243)描述MIN-45轻链可变框架区
32序列。WYQQKPGQSPKALIY (SEQ ID NO 266)描述 MIN-42 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。WYQQKQGKSPQLLVY (SEQ ID NO 267)描述 MIN-45 轻链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。ATSSLDS (SEQ ID NO 268)描述MIN-14轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。LVSNLES (SEQ ID NO 269)描述MIN-17-1轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。AATSLAD (SEQ ID NO :270)描述MIN-17-2轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。LVSNLES (SEQ ID NO :271)描述MIN-四轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。LVSNLES (SEQ ID NO :272)描述MIN_;M轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。SASYRYS (SEQ ID NO :273)描述MIN-42轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。NAKTLAD (SEQ ID NO :274描述MIN-45轻链可变互补性决定区2 (CDR2)氨基酸序列。GVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYC(SEQ 架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYC(SEQ 框架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ 架区3(FWR3)氨基酸序列。 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ 架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC(SEQ 架区3(FWR3)氨基酸序列。GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYC(SEQ 架区3(FWR3)氨基酸序列。QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT(SEQ ID NO :292)描述 MIN-14 重链可变框架区I(FWRl)氨基酸序列。QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT(SEQ ID NO :293)描述 MIN-17-1 重链可变框架区I(FWRl)氨基酸序列。QITLKESGPGIVQPSQPFRLTCTFSGFSLSTS(SEQ ID NO :294)描述 MIN-17-2 重链可变框架区I(FWRl)氨基酸序列。
ID NO 275)描述MIN-14轻链可变框 ID NO 276)描述MIN-17-1轻链可变 ID NO 277)描述MIN-17-2轻链可变 ID NO 288)描述MIN-四轻链可变框 ID NO 289)描述MIN-34轻链可变框 ID NO 290)描述MIN-42轻链可变框 ID NO 291)描述MIN-45轻链可变框
DVKLVESG⑶LXKLTEGEDIWEGLTLCRDSDQSPLAPVSKPGRVV RPQRSCTVIQGCVL(SEQ ID NO 295)描述MIN-四重链可变框架区I(FWRl)氨基酸序列。QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT (SEQ ID NO :296)描述 MIN-34 重链可变框架区I(FWRl)氨基酸序列。EVQLVESGGDLVKPGRSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO :298)描述 MIN-42 重链可变框架区I(FWRl)氨基酸序列。EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFT(SEQ ID NO :299)描述 MIN-45 重链可变框架区I(FWRl)氨基酸序列。SYWMH(SEQ ID NO :300)描述MIN-14重链互补性决定区I(CDRl)氨基酸序列。SYWMH(SEQ ID NO :301)描述MIN-17-1重链互补性决定区I(CDRl)氨基酸序列。GIGVT (SEQ ID NO :302)描述MIN-17-2重链互补性决定区I(CDRl)氨基酸序列。SYGVH(SEQ ID NO :303)描述MIN-34重链互补性决定区I(CDRl)氨基酸序列。SFGMS (SEQ ID NO :304)描述MIN-42重链互补性决定区I(CDRl)氨基酸序列。GYFMS (SEQ ID NO :305)描述MIN-45重链互补性决定区I(CDRl)氨基酸序列。WVKQRPGQGLEffIG (SEQ ID NO :306)描述 MIN-14 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。WVKQRPGQGLEffIG (SEQ ID NO :307)描述 MIN-17-1 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。WIRQPSGKGLEffLA (SEQ ID NO :308)描述 MIN-17-2 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基
酸序列。RLQTAHLQVQGVL (SEQ ID NO :309)描述 MIN-四重链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。WVRQSPGKGLEffLG (SEQ ID NO :310)描述 MIN-34 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。WVRQTPDKRLEffVA (SEQ ID NO :311)描述 MIN-42 重链可变框架区 2 (FWR2)氨基酸序列。WVMQSHGKSLEffIG (SEQ ID NO :312)描述 MIN-45 重链可变框架区 2 (FWRl)氨基酸序列。EINPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO :313)描述 MIN-14 重链互补性决定区 2 (CDR2)氨
基酸序列。EINPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO :314)描述 MIN-17-1 重链互补性决定区 2 (CDR2)
氨基酸序列。TIffffDDDNRYNPSLKS (SEQ ID NO :315)描述MIN-17-2 重链互补性决定区 2 (CDR2)氨
基酸序列。GIVSGDGESALHSVWIVG (SEQ ID NO :316)描述MIN-四重链互补性决定区 2 (CDR2)氨
基酸序列。VIffGGGSTDYNAAFIS (SEQ ID NO :317)描述 MIN-34 重链互补性决定区 2 (CDR2)氨
基酸序列。TISSGGTYTYYPDSVKG (SEQ ID NO :318)描述 MIN-42 重链互补性决定区 2 (CDR2)氨基酸序列。RINPYNGDTFYNQKFKG (SEQ ID NO :319)描述 MIN-45 重链互补性决定区 2 (CDR2)氨
基酸序列。KATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAT(SEQ ID NO :320)描述 MIN-14 重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。KATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAT(SEQ ID NO :321)描述 MIN-17-1 重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。RLTVSKDTSNNQAFLNIITVETADTAIYYCAQ (SEQ ID NO :322)描述 MIN-17-2 重链可变框架区3(FWR3)氨基酸序列。ATTITINGCDQLQPLLWSLANPRHVIATES(SEQ ID NO :323)描述 MIN-29 重链可变框架区3(FWR;3)氨基酸序列。RLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCAR(SEQ ID 架区3(FWR3)氨基酸序列。RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCSR(SEQ ID 架区3(FWR3)氨基酸序列。KATLTVDKSSTTAHIELRSLASEDSAVYYCAR(SEQ ID 架区3(FWR3)氨基酸序列。DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPG QPPKLLIYLASNLESGVPARF SGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHS RELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFL NNFYP KDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYER HNSYTCEATHKTSTSPIVKSF NRNECSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGG GSEGGGSGGGSGEVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMS WVRQTPEKRLEffVATIS SGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQM SSLRSEDTAMYYCARLG⑶NYYEYFDV WGAGTTVTVSSAKTTPPSVY PLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTL SSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASRTA (SEQ ID NO :327)描述 MIN-C2 单链 Fab (轻链-接头-重链；VL+CL+接头+VH+CH1)氨基酸序列。METDTLLLWVLLLWVPGSTCD (SEQ ID NO 328)描述 IgK-链前导序列。EQKLISEEDL (SEQ ID NO :329)描述 Myc 标记。NYGMN(SEQ ID NO :330)描述对于 IgG抗-MUC1*抗体的可变重链的 VH-CS-CDRl. 1 ⑶Rl共有序列。GYAMS (SEQ ID NO :331)描述对于 IgG抗-MUC1*抗体的可变重链的 VH-CS-CDR1. 2 ⑶Rl共有序列。R/GYA/GMS(SEQ ID NO :332)描述对于IgG抗-MUC1*抗体的可变重链的 VH-CS-CDRl. 3 =CDRl 共有序列。WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG (SEQ ID NO 333)描述对于 IgG 抗-MUC1* 抗体的可变重链的VH-CS-⑶R2. 1 ⑶R2共有序列。TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO :334)描述对于 IgG 抗-MUC1* 抗体的可变重链的 VH-CS-CDR2. 2 :CDR2 共有序列。S/TGT/DT/A—Y/FYA (SEQ ID NO :335)描述对于 IgG 抗-MUC1* 抗体的可变重链的 VH-CS-CDR3. 1 :CDR3 共有序列。
NO 324)描述MIN-;34重链可变框 NO 325)描述MIN-42重链可变框 NO 326)描述MIN-45重链可变框
TGTTAILNG(SEQ ID NO :336)描述对于IgG抗-MUC1*抗体的可变重链的 VH-CS-CDR3. 2 :CDR3 共有序列。S⑶GYWYYA(SEQ ID NO :337)描述对于IgG抗-MUC1*抗体的可变重链的 VH-CS-CDR3. 3 :CDR3 共有序列。DNYG-YDYG/A (SEQ ID NO :338)描述对于IgG抗-MUC1*抗体的可变重链的 VH-CS-CDR3. 4 :CDR3 共有序列。SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)描述对于 IgG 抗-MUC1* 抗体的可变轻链的 VL-CS-CDRl. 1 =CDRl 共有序列。RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :340)描述对于 IgG 抗-MUC1* 抗体的可变轻链的 VL-CS-CDRl. 2 =CDRl 共有序列。S/GTSNLAS(SEQ ID NO :341)描述对于IgG抗-MUC1*抗体的可变轻链的 VL-CS-CDR2. 1 :CDR2 共有序列。LASNLES(SEQ ID NO :342)描述对于IgG抗-MUC1*抗体的可变轻链的 VL-CS-CDR2. 2 :CDR2 共有序列。QQRSS/NYPS/FT (SEQ ID NO 343)描述对于 IgG 抗-MUC1* 抗体的可变轻链的 VL-CS-CDR3. 1 :CDR3 共有序列。QHSRELPFT (SEQ ID NO 344)描述对于IgG抗-MUC1*抗体的可变轻链的 VL-CS-CDR3. 2 :CDR3 共有序列。DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO :345)描述框架区 1 人 IgGl 轻链氨基酸 SEQ。5' gat ate cag atg acc cag tcc ccg age tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc gat agg gtc acc ate acc tgc cgt gcc 3，(SEQ ID NO :346)描述框架区 1 人 IgGl 轻链 DNA SEQ。WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO :347)描述框架区 2 人 IgGl 轻链氨基酸 SEQ。5' tgg tat caa cag aaa cca gga aaa get ccg aaa cta ctg att tac 3' (SEQ ID NO 348)描述框架区2人IgGl轻链DNA SEQ。GVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO :349)描述框架区 3 人 IgGl 轻
链氨基酸SEQ。5' gga gtc cct tct cgc ttc tct gga tcc aga tct ggg acg gat ttc act ctg acc ate age agt ctg cag ccg gaa gac ttc gca ate tat tac 3' (SEQ ID NO :350)描述框架区3人IgGl轻链DNA SEQ。FGQGTKVEIK(SEQ ID NO :351)描述框架区 4 人 IgGl 轻链氨基酸 SEQ。5' ttc gga cag ggt acc aag gtg gag ate aaa 3' (SEQ ID NO :352) ^ ! 区4人IgGl轻链DNA SEQ。EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO :353)描述框架区 1 人 IgGl 重链氨基酸 SEQ。5' gag gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca ggg ggc tea CtC Cgt ttg tcc tgt gca get tct 3，(SEQ ID NO :；354)描述框架区 1 人 IgGl 重链DNASEQ。WVRQAPGKGLEffVA(SEQ ID NO :355)描述框架区 2 人 IgGl 重链氨基酸 SEQ。
5' tgg gtg cgt cag gcc ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt gca 3， (SEQ ID NO 356)描述框架区2人IgGl重链DNA SEQ0RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR(SEQ ID NO :；357)描述框架区 3 人 IgGl 重
链氨基酸SEQ。5' cgt ttc act ata age gca gac aca tcc aaa aac aca gcc tac ctg cag atg aac age ctg cgt get gag gac act gcc gtc tat tat tgt tct aga 3' (SEQ ID NO :358) 描述框架区3人IgGl重链DNA SEQ。WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 359)描述框架区 4 人 IgGl 重链氨基酸 SEQ。5' tgg ggt caa gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 3' (SEQ ID NO :360)描述框架区4人IgGl重DNA SEQ。SGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSG(SEQ ID NO :361)描述接头序列氨基酸。EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFS (SEQ ID NO :362)描述 IGHV3 (名称源自 Igblast) =FffRl 与MIN-C2的可变重链区具有84. 7%同源性(Μ9Λ94)的人IgG抗体框架区序列。WVRQAPGKGLEffVS (SEQ ID NO :363)描述 IGHV3 (名称源自 Igblast) :FWR2 与 MIN-C2的可变重链区具有84. 7%同源性(Μ9Λ94)的人IgG抗体框架区序列。RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV (SEQ ID NO 3 64)描述 IGHV3 (名称源自 Igblast) :FWR3 与MIN-C2的可变重链区具有84. 7%同源性(Μ9Λ94)的人IgG抗体框架区序列。DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC(SEQ ID NO :365)描述 IGkV7(名称源自 Igblast) FffRl 与MIN-C2的可变轻链区具有76. 4%同源性0沈/296)的人IgG抗体框架区序列。WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO :366)描述 IGkV7 (名称源自 Igblast) :FWR2 与 1讯义2的可变轻链区具有76.4%同源性0沈/296)的人IgG抗体框架区序列。GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYY (SEQ ID NO :367)描述 IGkV7 (名称源自 Igblast) =FffR 3 与MIN-C2的可变轻链区具有76. 4%同源性(226/296)的人IgG抗体框架区序列。EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO :368)描述 IGHV3(名称源自 Igblast) =FffRl 与MIN-E6的可变重链区具有84. 同源性Q49/296)的人IgG抗体框架区序列。WVRQAPGKGLEffVS (SEQ ID NO :369)描述 IGHV3 (名称源自 Igblast) :FWR2 与 MIN-E6的可变重链区具有84. 同源性Q49/296)的人IgG抗体框架区序列。RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO :370)描述 IGHV3 (名称源自 Igblast) :FWR3 与MIN-E6的可变重链区具有84. 同源性(Μ9Λ96)的人IgG抗体框架区序列。EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC(SEQ ID NO :371)描述 IGkV3(名称源自 Igblast) FffRl 与MIN-E6的可变轻链区具有69. 5%同源性(187Λ69)的人IgG抗体框架区序列。WFQQRPGTSPK LLIY (SEQ ID NO :372)描述 IGkV3 (名称源自 Igblast) :FWR2 与 MIN-E6的可变轻链区具有69. 5%同源性(187Λ69)的人IgG抗体框架区序列。GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC(SEQ ID NO :373)描述 IGkV3 (名称源自Igblast) :FWR3 与MIN-E6的可变轻链区具有69. 5%同源性(187/269)的人IgG抗体框架区序列。单克隆抗体克隆单克隆抗体可用于各种原因。产生单抗体的杂交瘤细胞提供一种用于产生大量相同并发挥相同效应的抗体的方法。这可用于预定用于治疗用途的抗体。确定单克隆抗体的序列，尤其是轻链和重链可变区的单克隆抗体的序列，是特别有用的，因为它们能够使许多形式的蛋白质工程会例如允许产生像单链抗体(例如，scFv)或重组单价抗体(例如， Fabs)的抗体变体。确定单克隆的序列，特别是可变区的单克隆序列，重要的是能够使有时候优选用于人治疗的“人源化”或部分人源化(嵌合)抗体产生，因为它们通过显示出类人而能够较好地避免宿主免疫系统。对于产生单克隆抗体和产生本文中公开的抗体变体，例如，单链抗体、双特异性抗体、重组Fabs、人源化而特别是人源化抗体等，还存在许多种方法。本文中描述的方法旨在示例性的并且本发明涉及单克隆抗体而通过其它方法产生的这些抗体的衍生化将具有与通过本文中描述的方法产生的那些相同的效果。单克隆抗-MUC1*抗体将按照以下描述进行生产和筛选。小鼠采用对应于MUC1*( GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS AQSGA (SEQ ID NO :1))的胞外域的合成肽或包含单个氨基酸取代的肽变体(GTINVHDVETQFNQITEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SE Q ID NO :2))进行免疫。杂交瘤根据所述领域内的标准实践生成。产生抗-MUC1*抗体的各个杂交瘤因为其在ELISA分析中结合至MUC1*肽的能力而被识别。在预先的选择过程中识别的来自杂交瘤的上清液，随后被加入到MUCl*-阳性以及MUCl-阴性细胞中，而FACS用于识别那些分泌能够识别活细胞上MUC1*的抗体的杂交瘤。大量的识别的MUC1*同源抗体随后通过用杂交瘤(腹水)注射小鼠获得或根据标准方法通过大规模培养产生。所得的抗体按照先前的描述进行分析。另外，通过将抗体克隆结合于并二聚化MUC1*的胞外域而对抗体克隆刺激MUCl*-阳性细胞生长的能力进行测试。有效刺激MUCl*-阳性细胞(多能干细胞，癌细胞和转染细胞)生长的抗体随后被生化切割以产生应该阻断MUC1* 二聚而由此抑制MUC1*表达细胞生长的单价抗体。在一些情况下，抗体经过木瓜蛋白酶消化以产生单价Fabs，对其抑制MUCl*-阳性细胞生长的能力进行了分析。在一些情况下，Fab是根据公开的方法进行聚乙二醇化，据观察，聚乙二醇化提高了抗体片段的稳定性。所选抗体的重链和轻链的序列通过标准方法获得，并且制成制备二价和单价MUC1*抗体和抗体衍生物的各种构建体。包含通过接头连接的重链和轻链的可变区的单链构建体是单价的，因此可用于抑制MUCl*-介导的细胞生长。也可以引入恒定区的部分以有助于补体的募集(ADCC)，并且设计这种构建体的方法对于本领域技术人员而言是已知的。为了阻止会产生二价抗体衍生物的恒定区的二聚作用，能够引入突变如Cyteine取代等。聚乙二醇化通常是一种用于延长单价抗体片段的半衰期的有用的方法并用于提高Fab和本文中所述单链抗体的稳定性。本发明的抗-MUC1*抗体可以是单链可变片段抗体(scFv)。重组方法已经导致单链可变片段抗体(scFv)的开发。单体scFv具有仅仅约30kDa的分子质量，这在各种系统中表示为通过富含Gly/Ser的合成接头连接的单VL-VH对(Berezov A. et al. ,2001, J Med Chem 44:2565)。当在细菌或真核细胞中表达时，scFv折叠成类似于母体抗体对应区的构
38象。其表现出保持对Fab的相当的亲和性(Kortt et al. ,1994,Eur J Biochem 221 :151)。 ScFvs受各种遗传修饰如人源化和融合蛋白产生的作用以作为治疗剂增强其潜能。噬菌体展示法可以用于生产抗-MUCl*scFV。在这种方法中，抗体可变区cDNA的大 (文)库由B细胞收集，而VHs和VLs的重组按照scFvs的形式表达于丝状抗菌素的表面。 表达scFvs的噬菌体从抗原涂覆的板中进行淘选(panned)。抗-MUCl*scFV的亲和性可以通过将构建体的CDRs突变并随后重复淘选过程而改善。本发明的抗-MUC1*抗体可以是Fab、Fab2双特异性抗体、Fab3三特异性抗体、二价微型抗体(minibody)、三价三链抗体(triabody)或四价四链抗体(tetrabody)。单价抗-MUC1*抗体用途之一是用于治疗经常过表达MUC1*的癌细胞。为了避免抑制也存在MUC1*的非癌细胞，可以制备双特异性抗体，其中一部分杂交抗体结合于并阻断MUC1*，而另一部分杂交抗体结合于另一肿瘤特异性或类似的抗原。例如，一部分会识别 MUC1*，而另一部分会结合于HER2、CEA、转铁蛋白、EGFR、TF (组织因子)、DLLs (类德耳塔配体)、DLL-4、锯齿状切口受体配体、切口受体的部分等等。协同结合超过单体结合的亲合性提高会优先将抗体保持在靶向肿瘤细胞上。本发明的抗-MUC1*抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆抗体，优选具有双靶向特异性的人或人源化抗体。双特异性抗体衍生于具有不同特异性的两个抗体的可变域的重组；双特异性抗体由此能够结合其母体抗体的两种抗原。在抗-MUC1*的情况下，例如，结合特异性之一能够针对MUC1*而另一个可能针对另一蛋白或任何其它细胞表面蛋白。这些双特异性抗-MUC1*抗体可以起到拮抗性或激动性抗体的作用。用于制备双特异性抗体的方法是众所周知的(Traunecker et al.，EMBO J，1991， 10 3655 ；WO 93/08829 ；Suresh et al.，Methods in Enzmology, 1986,121:210 ；Milstein and Cuello，1983，Nature，305 :537)。简而言之，具有所需结合特异性的抗体可变域融合至免疫球蛋白恒定域。这种融合包含免疫球蛋白重链恒定域(铰合部分，CH2区和CH3区) 并优选包含第一重链恒定区(CHl)。编码免疫球蛋白重链融合和免疫球蛋白轻链的DNA插入到分别的表达载体中并进行共转染。在MUC1*的情况下，双特异性抗体会通过阻断MUC1*配体结合位点的二聚作用而作为细胞生长抑制剂。如果一个可变区识别MUC1*而另一个识别另一肿瘤特异性抗原， 则抑制MUCl*-介导的生长的不需要的副作用将会被避免。双特异性抗体会优先结合于展示两种抗原的肿瘤细胞。这种方法对于具有增强的特异性和抗肿瘤效果(Robinson， et al. 2008)的HER2-HER3双特异性抗体、以及阻断来自两种受体的信号传输(Lu，et al. 2004)的EGFR-IGFR双特异性抗体，已经取得了成功。而且，双特异性抗体的第二 “臂” 能够靶向、募集和结合免疫系统的细胞，如募集T细胞的CD3 (Baeuerle and Reinhardt， 2009，Bortoletto, et al 2002)或CD16以募集嗜中性白细胞、天然杀伤细胞或其它单核细胞(Bruenke, et al. 2005，McCall, et al. 1999)。治疗性抗体的两个臂能够以多种格式作为单链串联克隆，如串联scFv分子和类似的串联双特性抗体(Chames and Baty 2009， Holliger P，1993)。来自不同抗体的Fab片段也能够化学结合以形成双特异性Fab (Chames and Baty 2009)。相反，存在许多这样的情况，其中期望增强MUCl*-阳性细胞的生长。例如，多能干细胞和一些祖细胞表达MUC1*。二价MUCl*-抗体使在原始细胞上的MUC1*受体二聚化并且增强细胞生长，同时维持细胞处于多能性状态。二价抗-MUC1*抗体可以外源性地加入或从遗传学上加入到该细胞中。例如，编码二价抗-MUC1*抗体的基因加入到原始细胞中，甚至在卵和精子融合完成之前的时间加入到原始细胞中。按照这种方式，所得的干细胞及其子代会产生和分泌刺激其无限增殖的配体。可替换地，编码抗体的质粒转染至原始细胞中以通过活化MUC1*受体来维持其多能性或拯救已经进入分化过程的干细胞。类似地，通过将编码MUC1*的基因引入而在细胞中诱导多能性，这可以单独引入或与其他基因结合引入，所述其他基因包括增强通过MUC1*的信号传输的那些基因如编码 MUCl裂解酶的基因像MMP-14和TACE或编码匪23这种MUC1*的天然配体的基因。将二价MUC1*抗体和抗体衍生物给予遭受化疗作用和患有其中期望增强造血干细胞和前体细胞增殖的其它病症的患者。在这些情况下，患者可以全身性给药或经由局部注射给药。各种形式的干细胞移植疗法会受益于原位注射MUCl*-刺激抗体以在分化开始之前建立移植细胞群的活力。在本发明还有的另一个方面，存在期望控制MUC1*表达和生长刺激信号传输的抗-细胞凋亡性质的许多情况。一种这样的实例就是当支持细胞存活的制剂会延迟病症的灾害性后果时的脓毒症的情况。采用二价MUC1*抗体或抗体衍生物的短暂的全身治疗会增强细胞存活并在如此进行中控制威胁生命的症状直至合适的抗生素或其它治愈性治疗能够被给予(或施加)或有时间发挥疗效。类似地，细菌的有毒菌株破坏肉体区域并导致大量细胞由于毒性效应而死亡。这里还给予MUCl*-刺激抗体会使得细胞更耐受细胞死亡并为看护者提供更多的时间以控制感染。因此，MUCl*-刺激抗体可以局部给药或全身性给药。其它情形自身适合于MUCl*-介导的生长刺激。例如，经由用于制造转基因动物的方法能够产生自发产生肿瘤或产生生长更快的肿瘤的动物，在这些情况下，会产生这些动物使得其细胞会制造和分泌MUC1*刺激抗体。在这种情况下，MUCl*-刺激抗体的基因位于组织特异性启动子的下游。例如，为了产生自发产生乳腺肿瘤的小鼠，MUC1*抗体配体的基因会被置于乳房特异性蛋白的启动子的下游。将插入到组织特异性启动子下游的MUC1*抗体的基因注射到原核中或类似地在正在卵和精子完全融合之前注射以产生转基因动物，例如，小鼠模型，其自发形成肿瘤或增强肿瘤形成。抗体基因可以独立注射或结合增强MUC1* 分裂或信号传输的其它基因，包括但不限于MMP-14、TACE、匪23等注射。在另一个方面，编码MUC1*抗体的质粒外源性加入或转染至抗体产生杂交瘤中以便经由MUC1*刺激通过提高细胞生长率和赋予细胞对细胞死亡的耐受性而提高抗体产生。 在本发明的这方面，抗体产生细胞的生长被增强而没有污染作为期望抗体的产物。抗体产生细胞典型地生长于包含血清减少的培养基中，因为血清组分自身包含许多抗体。在细胞培养基中降低血清的量使继续污染减到最小而且还降低了细胞生长和期望抗体的总产率。 加入外源性抗-MUC1*或转染编码抗-MUC1*的质粒提高了细胞生长和存活，同时单个已知抗体能够选择性地从作为期望抗体的产物中纯化出来。具有单克隆抗体的序列也允许制备其中一部分衍生于抗体而另一部分可以衍生于另一蛋白，如毒素、细胞因子像IL-2等或蛋白像能够作为标记的GFP(绿荧光蛋白)的融合蛋白。本发明的抗体和抗体变体能够生化融合至或被遗传设计以融合至标记、标签、毒素、放射性物质、靶向基序、前导序列肽、有毒物质、蛋白或肽。类似地，非天然氨基酸能够引入到重组抗体或抗体衍生物中，其中所述非天然氨基酸可以有助于偶联(结合)，可以具有信号传输能力，可以对重组蛋白赋予蛋白酶敏感性或不敏感性，等等。本发明也提供了本文所述的一些或所有抗-MUC1*抗体和抗体变体的人源化或部分人源化作用。克隆单克隆抗体并测定其序列，尤其是轻链和重链可变区的序列，能够产生人源化和部分人源化(嵌合的)抗体。正如本领域已知的，人源化和嵌合抗体的特征在于副作用很少并且效能较高，因为人源化抗体能够更好地避免人免疫系统的检测(Lonberg 2005)。正如本领域技术人员所熟知的，用于产生人源化抗体的常用方法涉及在非识别区域如框架区(FWR)中用非-人序列交换人序列，如描述于Muzard，et al. 2009中。类似地，用识别区像非人单克隆抗体的互补性决定区(OTR)交换人抗体的⑶R(Carter P，et al. Humanization of an anti-pl85HEE2 antibody for human cancer therapy Proc. Natl Acad. Sci89 :4285-4289)。人框架区如列于SEQ ID NOS :345-360中的那些，都是在本文公开的所述单克隆序列中能够交换小鼠FWR的人框架区。对于人抗体序列的数据库研究也用于识别与来自非人源的期望单克隆抗体同源的人抗体。例如，SEQ ID NOS :362-367的氨基酸序列是来自高度同源于MIN-C2的人抗体的框架区(FWR)。这些序列或那些序列能够连同 MIN-C2 的 CDR(SEQ ID NOS :331、334、374、340、342 和 344) —起使用。在另一个实例中，如SEQ ID NOS :368-373所示的氨基酸序列是源自高度同源于 MIN-E6的人抗体的框架区(FWR)。这些序列能够与MIN-E6的CDR(SEQ ID NOS :332、334、 338、339、341和34 结合使用。编码这些氨基酸序列的核酸可以用于遗传设计这种嵌合的、部分人源化的抗体和抗体变体。为了用所选的人框架区取代鼠框架区用于制备嵌合的抗体构建体，采用合成DNA 和通过重叠PCR产生的DNA的组合。为了构建人源化的MIN-C2，编码SEQ ID NOS =362,363 和364的氨基酸序列的人框架区核苷酸序列用于分别取代含SEQ ID NOS :159、185和211 的鼠重链框架区。另外，编码SEQ ID N0S:365、366和367的氨基酸序列的核苷酸序列用于分别取代含SEQ ID NOS :98、119和139的MIN-C2轻链框架区。为了构建人源化的MIN-E6， 编码SEQ ID NOS =368,369和370的氨基酸序列的人框架区核苷酸序列用于分别取代含有 SEQ ID NOS :160、186和212的重链框架区。另外，编码SEQ ID NOS :371、372和373的氨基酸序列的核苷酸序列用于分别取代含有SEQ ID NOS =99,120和140的MIN-E6轻链框架区。许多设计的构建体，包括但不限于scFab、重组Fab、双特异性重组抗体和scFv，都采用这些方法产生。本文所公开的抗-MUC1*抗体和抗体变体能够按照这种方式进行人源化。按照人源化方法，抗体亲和性能够通过许多方法包括通过使用噬菌体展示法而得以改善。在人源化抗体和抗体变体之后，一些会失去亲和性并需要“亲和力成熟”的过程。一种方法涉及通过诱发突变接着选择对于其同源抗原显示出增强的亲和性的那些而完成的分子演化(Razai，et al. 2005)。可替换地，人源化的抗体或抗体片段能够从重组库中分离出来 (Nahary and Benhar，2009，Rothe C, et al.)。获得全人源化抗体的另一种方法是对设计用于产生人抗体的转基因小鼠进行免疫化(Jakobovitz，et al. 2007，Lonberg，2005)。本发明设想了一些或所有这些方法连同识别MUC1*的抗体区的序列(CDR)以产生体外以及体内结合至PSMGFR序列(SEQ ID N0:1)的抗体的用途以及治疗用途。Razai等人报道了在亲和力成熟也称为分子演化之后，总共60个⑶R残基中的5个发生突变，这对应于约8%的⑶R诱变率。这意味着在亲和力成熟之后约92%的⑶R区仍保持未变化。其他报道了在亲和力成熟之后类似的百分数变化(JucSrez-Gonzcnehet al 2005 ；and Finlay, et aK2009))。本文中公开的任何新抗体和抗体变体的产生能够在来自不同生物体的宽泛的各种细胞中实施，包括但不限于采用细菌载体的细菌，如大肠杆菌(Zheng，et al. 2009)，采用酵母载体的酵母细胞如毕赤酵母(Pichia pastoris) (Schoonooghe, et al. 2009)，采用昆虫载体的昆虫细胞，如S2细胞(Joharmson，et al.)，采用哺乳动物载体的哺乳动物细胞， 如中国仓鼠卵巢细胞(CHO) (Majors, et al. 2009)等。可用于抗体合成的载体和细胞很多且对于本领域技术人员是众所周知的。在另一个实施方式中，本发明的抗体和抗体变体通过宿主动物产生。有人能够制造出转基因动物，例如，能够制造出预定抗体并将其分泌于其奶汁中Chang，et al. 2009) 或其它体液中。采用蛋白质工程方法来培育新型和有用的抗体和抗体衍生物的其它情形采用本文中公开的单克隆抗体的序列都是可能的。本发明并不限于本文中描述的具体实施方式
的范围。实际上，除了本文中所述的那些之外本发明的各种修改对于本领域技术人员来说根据前述描述和附图会变得显而易见。这种修改旨在落在所附权利要求的范围内。以下实施例通过举例说明本发明的方式而非任何限制性的方式提供。实施例实施例1-抗-MUCl 单克隆抗体的产生单克隆抗体对于MUC1*肽采用标准杂交瘤产生和随后的筛选而产生，这对于本领域技术人员而言是熟知的。MUC1* 肽(GTINVHDVETQFNQITEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSG A, SEQ ID NO 1)或包含单个氨基酸取代的肽变体(GTINVHDVETQFNQITEAASPYNLTISDVSVSD VPFPFSAQSGA, SEQ ID NO 2)采用在羧基末端允许结合于KLH的另外的半胱氨酸残基合成。 结合的肽用于对小鼠进行免疫。对于来自包含融合细胞的孔中的上清液进行筛选以用于通过ELISA识别MUC1*肽。其中，几个克隆基于其在ELISA结合分析中对其识别MUC1*肽的能力的高滴度而选择。来自六个(6个)杂交瘤克隆的上清液的这种结合结果示出在图1中。 随后通过FACS (荧光活化细胞分选)测试这些克隆结合于完整细胞上的MUC1*的能力(图 2和3)。将这些中的最佳结果维持为杂交瘤并进行测序。两个克隆，MIN-C2和MIN-E6，基于其结合于表达乳腺癌细胞系(ZR-75-1)的MUCl和用MUC1*编码质粒转染的HCT-116结肠癌细胞的细胞表面上的MUC1*而尤其优选(图2和3)。这种杂交瘤产生的过程重复多于一次，产生几个单克隆抗体，选择性结合于MUC1*的胞外域的IgG和IgM，也称为基本上由 PSMGFR 序列、(GTINVHDVETQFNQITEAASRYNLTISDVSVSDVPF PFSAQSGA, SEQ ID NO 1)构成的MGFR。所选的单克隆抗-MUC1*抗体的可变区的序列示出于图11-14中。实施例2-抗-MUCl 单克隆抗体结合于细胞表面上的MUCl 的分析在细胞表面上识别MUC1*，通过采用FACS的细胞表面染色进行分析。对于MIN-C2 抗体，使50 μ L的10 μ g/ml的纯化抗体溶液在4°C下单独结合于用空载体转染的MUCl-阴性HCTl 16细胞(HCT116-VEC8)或用MUC1*表达载体转染的MUCl-阴性HCTl 16细胞 (HCT-MUC1*-10)和MUCl阳性ZR-75-1细胞30min。将细胞冲洗2次，并在4°C下用10 μ g/ ml抗-小鼠-PE处理30min。将细胞冲洗两次，在PBS中的2%甲醛中进行固定，并采用BDFACS Cantoll流式细胞计数器进行分析(图2)。对于MIN-E6抗体也按照类似的过程实施， 仅有的差异是采用来自MIN-E6杂交瘤的50 μ L未稀释上清液代替纯化抗体(图3)。实施例3-抗-MUCl女单克隆抗体(二价)MIN-C2和ΜΙΝ-Ε6诱导表达乳腺癌细胞系的MUCl的增殖为了测定抗-MUC1*单克隆抗体的能力，使用了表达乳腺癌细胞系T47D的MUCl。 在含10%血清的培养基中对96孔板中的每个孔平板接种7，500个细胞。第二天将三个孔中的细胞进行胰蛋白酶化，再悬浮于培养基中并采用血细胞计数器计数以获得第0天的数。将在细胞中的培养基改变成含3%的FBS的培养基并以各种浓度加入抗-MUC1*抗体。 48h之后改变培养基，接着第二次加入抗体。在另一个4 之后，计数细胞并估计细胞生长的刺激(图4和5)。实施例4-Fab片段产生和聚乙二醇化为了制备MUC1*抗体的单价Fab片段，采用了木瓜蛋白酶消化方法(Pierce)。将 MIN-C2和MIN-E6抗体有效地采用木瓜蛋白酶消化并通过蛋白A-琼脂糖亲和色谱纯化(图 6)。这些Fab片段连同其母体mAb在竞争ELISA分析中测试以确认Fab片段能够结合于其抗原，MUC1*肽。如图7中所示，所产生的Fab片段有效地与其母体mAb竞争。Fab也采用TMS(PEG)试剂按照制造商的规程(Pierce)进行聚乙二醇化。聚乙二醇化的Fab在细胞基生长抑制分析中相对于未聚乙二醇化的Fab而起作用。实施例5-单价MIN-C2和MIN-E6 Fab片段对于抑制过表达MUCl *的细胞增殖效果测试将表达乳腺癌细胞系T47D的MUC1*平板接种于在完全培养基(含10% FBS的 RPMI)中的96孔板(5，000个细胞/孔)中并允许结合过夜。第二天，培养基变化成含3% FBS的培养基。将三个孔中的细胞在胰蛋白酶化和再悬浮之后采用血细胞计数器计数以获得第0天的数。接着，将MIN-C2或MIN-E6 Fab蛋白按照各种浓度加入到各个板中。在4 之后，置换掉培养基并第二次加入Fab蛋白。在另外4 之后对所有孔中的细胞进行计数。 相对于未含Fab蛋白的细胞生长来计算细胞生长的抑制作用。在MIN-E6的情况下，对该蛋白的聚乙二醇化形式也进行测试(图8、图9)并且与未聚乙二醇化的Fab相比显示出功能。实施例6-采用多肽接头构建和表达作为单链Fv片段的MUCl女结合多肽对MIN-C2的scFv片段(识别MUCl膜近端胞外区的从氨基酸1110至1155的45 个氨基酸的单克隆抗体PSMGFR)进行设计，将其构建和表达于大肠杆菌中。构建体采用载体pET2lb (Novagen)进行设计而无任何分泌信号，所述载体pET21b产生具有羧基端标记的含6个组氨酸残基的蛋白。MIN-C2和MIN-E6 scFv的构建体的设计示出在图IOA和图15 和图16中。羧基端组氨酸标记允许scFv蛋白经由Ni-NTA亲和色谱进行纯化(图17)。为了对单克隆抗体测序，产生单克隆抗体的杂交瘤细胞按照教导的生长于含G418 的RPMI培养基中。随后，采用iTrizol试剂制备总RNA，采用SuperScript III第一链cDNA 合成试剂盒(Irwitrogen，CA)产生其第一链cDNA。为了克隆重链和轻链的可变区，根据文献使用简并引物(Wang et al.，2000)。对于重链克隆，使用与SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7(正向)一起的SEQ ID NOS :3_5(反向)而设立PCR。对于κ链，使用与SEQ ID NO 9(正向)一起的SEQ ID Ν0:8(反向)。所有正向和反应PCR引物含有对于重链的EcoRI
43和HindIII限制位点和对于出于下游克隆目的的κ链的Md和Mill位点。PCR条件如下94°C lmin,45°C lmin,72°C 2min 进行 30 个循环，以及 72°C进行 lOmin。随后，将 PCR 产物在琼脂糖凝胶上运行并检测重链和轻链的 500bp大小的显著的PCR条带。产物由琼脂糖凝胶纯化并采用对应酶进行限制酶切消化，随后克隆到pET21b细菌表达载体中用于测序和简单的细菌表达以证实其全长表达。对质粒DNA进行测序。对于优选的单克隆抗体MIN-C2的可变区(⑶R 互补性决定区)的DNA和氨基酸序列被提供在可变重链VH的SEQ ID NOS 10和11中和可变轻链或 κ链VL的SEQ ID NOS 12和13中。MIN-C2的重链和轻链的恒定区的DNA和氨基酸序列也被进行测定并显示为SEQ ID N0S:49和50。具有较高稳定性和结合亲和性的重组抗体片段通过将这些恒定区包含到设计中而产生。重组Fab由重(VH)和轻(VL)链的可变区加上恒定区(CHl和CL)组成。对于另一个优选的单克隆抗体MIN-E6的DNA和氨基酸序列被类似地测定并提供于重链的SEQ ID NOS :19-22和轻链或κ链的SEQ ID NOS :23- 中。其它单克隆抗-MUC1* 抗体的序列示出在图11-14中。例如，对于IgG重链可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NOS 59-68中；而轻链可变区显示于SEQ ID NOS :51-58中。对于IgM重链可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NOS 76-81和SEQ ID NO 84中；而轻链可变区显示于SEQ ID NOS 69-75 中。为了产生基本上由单克隆抗体的可变区组成的单链抗体片段(scFv)，将具有15 个氨基酸(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3的接头序列(SEQ ID NO 14)采用标准PCR而引入到重可变序列与κ可变序列之间。产生MIN-C2和MIN-E6的scFv。产生最终的重-接头-κ 构建体的MIN-C2 scFv的序列显示为(SEQ ID N0S:15和17)。还产生具有羧基端半胱氨酸的 MIN-C2 scFv 变体:MIN-C2 scFv-Cys (SEQ ID NOS :16 和 18)。类似地产生单克隆抗体MIN-E6和scFv-Cys变体的单链抗体片段(scFv)形式。所得的MIN-E6 scFv和MIN-E6 scFv-Cys的DNA和氨基酸序列显示为SEQ ID NO 25和27以及SEQ ID NOS 26和观(Cys)。包含通过接头连接的重链和轻链可变区序列的组合的DNA 采用限制性酶消化，并克隆于pET-21b细菌表达载体中并用于转化细菌培养物。接着，细菌培养物通过加入IPTG (异丙基硫代半乳糖苷)至ImM的浓度并允许诱导进行他而诱导。测试表明，所有的scFv蛋白都定位于包含体内。MIN-C2、MIN-E6-7的 scFv蛋白通过采用8M脲溶解大肠杆菌包含体部分接着根据标准方法实施M-NTA柱色谱而进行纯化。洗脱蛋白的SDS-PAGE分析显示出具有约^kDa预期尺寸的单物种(约95% 纯度)。洗脱蛋白的浓度通过在^Onm下测定吸光度而测定。蛋白采用结合缓冲液(0.02 M Tris. HCl pH 8. 0,0. 5M NaCl，8M 脲，5mM 咪唑)稀释至 150ug/ml。向蛋白中加入 GSH 和GSSG分别至5mM和0. 5mM的最终浓度并在4°C下搅拌16h。洗脱的蛋白随后进行重折叠过程。通过将蛋白转移到透析膜中并对0.4M含L-精氨酸的缓冲液(0.05 M Tris. HCl pH8.0，0.4 M L-精氨酸)透析而完成重折叠。最终的透析在50mM pH 8.0和5%甘油中完成。蛋白从透析膜中移出并旋转(spin down)以除去沉淀物并采用具有10，000MW截止膜 (Amicon Ultra, Millipore)离心过滤而浓缩。部分蛋白进一步通过亲和纯化柱而进行纯化。对MIN-C2的重组scFv进行表达、纯化(图17)和重折叠。图18(A)显示了，在ELISA 中，MIN-C2 scFv特异性结合于MUC1*胞外域肽(PSMGFR)。在重折叠之后，将一些MIN-C2scFv进行靶肽亲和纯化；在非变性缓冲液中，scFv流过PSMGFR肽柱。洗脱的MIN-C2 scFv 显示出特异性活性(图18B)。实施例7-scFv结合于靶MUCl女肽及其与母体MIN-C2抗体竞争的能力MUC1*肽通过过夜培养结合于96孔ELISA板的孔中。接着采用超级阻断剂 (superblock) (Pierce)也通过过夜培养进行阻断。接着，移出超级阻断剂，孔用含3% FBS 的DMEM培养基阻断30min。按照各种浓度采用最高浓度为50 μ g/ml的8个系列稀释液加入scFv蛋白。为了测定scFv蛋白非特异性结合，将该蛋白加入到与不含结合MUC1*肽的另一组孔相同的稀释液中。继续培养lh。接着，孔用OJml PBST(磷酸盐缓冲的含0.02% 吐温20的盐水)冲洗3次。接着加入在通过100倍稀释含3% FBS的DMEM而制备的培养基中按照1 40，000稀释的兔抗-His抗体(AbCam)。这允许培养Ih之后接着用0. 3ml PBST冲洗3次。接着向孔中加入0. Iml的底物四甲基联苯胺并在黑暗中允许显色15min， 接着加入0. Iml的2NHC1。这些实验证实，重组scFv有效地与完整母体抗体对于结合于 PSMGFR(MUC1*胞外域)肽进行竞争。实施例8-MIN-C2 scFv细胞表面结合于表达乳腺癌细胞的MUCl乳腺癌细胞系ZR-75-1用于测试MIN-C2 scFv识别细胞表面上MUC1*的能力。细胞采用1.5ug/ml scFv原料的1 2或1 10稀释液或无任何scFv蛋白作为对照在4°C 下培养30min。在两次冲洗之后采用结合于以1 200、1 50或1 10稀释的Alexa 488 (Qiagen)的第二抗体抗-五-His来培养细胞以检测scFv上的6X组氨酸标记。流式细胞计数分析表现出指示特异性结合的一组细胞的浓度依赖性变化，这在无MIN-C2 scFv存在时是观察不到的(图19)。实施例9-测试MIN-C2 scFv蛋白对于过表达MUCl ±的癌细胞增殖的影响因为MUC1*受体当其通过其活化配体发生二聚时刺激细胞生长，所以单体抗体和抗体片段预期抑制MUCl*-阳性细胞的生长。表达乳腺癌细胞系ZR-75-l(aka 1500)的 MUC1*在完全培养基(含10% FBS的RPMI)中平板接种于96孔板(10，000个细胞/孔) 中并允许结合过夜。第二天，培养基变成含3% FBS的培养基。作为对照的另一个细胞系 HCT116，并不表达MUC1*的衍生结肠癌也平板接种0，000个细胞/孔)于完全培养基(含 10% FBS的DMEM)中，允许结合过夜并将培养基变化成含3% FBS的培养基。对于每一细胞系，将在三个孔中的细胞在胰蛋白酶化和再悬浮之后采用血细胞计数器计数以获得第0天的数。接着，将MIN-C2 scFv抗体变体按照各种浓度加入。在4 之后，置换培养基并且第二次加入scFv蛋白。在另外的4 之后对所有孔中的细胞都进行计数。相对于不含scFv 蛋白的细胞生长来计算细胞生长的抑制。据观察，尽管scFv蛋白抑制表达ZR-75-1细胞的 MUC1*的生长，但是它们对并不表达MUC1*的对照细胞系HCT 116并不具有这种抑制效应 (图 20)。实施例10-重组Fab抗体的构建和表达也产生重组Fab。在一些情况下，Fab相对于scFv设计是优选的。相比于scFv， 重组Fab在血清中具有较长的半衰期，并且其结合亲和性通常可与整个母体抗体相比。在哺乳动物系统中的表达经由提高适当折叠的蛋白数量而提供了增强的活性。由哺乳动物细胞产生的抗体变体以大规模产生。为了产生哺乳动物表达的重组抗体，可变区加上恒定区克隆自产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。重组的Fab采用许多抗体设计而产生。它们基本上由VH，VL，CH和CL区构成。在一些情况下，接头用于将重链连接至轻链。在其它情况下，重链和轻链承载于分开的载体上并表达于其中它们自我结合以形成功能Fab的相同细胞中。 制备两种设计的Fab。产生单克隆MUC1*抗体的杂交瘤细胞(MIN-C2和MIN-E6克隆)在含G418的RPMI 培养基中根据标准实践生长。随后，总RNA采用Trizol试剂制备，并且采用Superscript III第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen，CA)产生第一链cDNA。为了克隆包含其自己分泌信号序列的重链和轻链，根据文献采用了简并PCR引物(Morrison，2002 ；Kettleborough, 1993) ο对于重链克隆，采用PCR与37 (反向)一起的SEQ ID NOS :33、34、35或36 (正向) 而建立。对于κ链，采用与44 (反向)一起的SEQ ID NOS :38、39、40、41、42或43 (正向)。 所有正向和反向PCR引物分别出于下游克隆目的而包含EcoRI和B10I限制位点。所用的 PCR条件如下94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 60s进行30个循环，以及72°C进行lOmin。然后， 使PCR产物在琼脂糖凝胶上运行以检测那个引物产生了所期望产物。图21(A)示出了，当使用SEQ ID NOS 34和37的引物时产生了正确的MIN-C2重链(显著的PCR条带 800bp)。适当的MIN-C2轻链采用SEQ ID NOS 38和44的引物而产生。由琼脂糖凝胶纯化产物并采用对应酶进行限制酶切消化，然后克隆到pET21b细菌表达载体中用于进行测序和简单细菌表达以证实其全长表达。对质粒DNA进行测序并且被发现同一于我们产生的MIN-C2 scFv变体，证实了即使实施不同引物和不同酶消化，所得的变体都含有来自母体单克隆抗体的相同可变区。提供了对于重组MIN-C2 Fab的重(SEQ ID NOS 45 和 47)和轻(SEQ ID NOS 46 和 48)链序列。对各个Fab构建体在细菌中的表达进行了测试。将包含pET21b_重链或轻链的 BL21转化体接种到含羧苄青霉素(carbenacillin) (100yg/ml)的5ml LB培养基中并且在37°C下培养过夜。然后，采用过夜细菌培养物0.5mL)接种含羧苄青霉素(100yg/ml) 的5ml LB培养基并进一步在30°C下培养直至其0D600nm达到0.5。将其余培养物旋转并冷冻。向50ml培养物中加入IPTG至最终浓度为ImM。将培养物进一步培养证而随后被制粒。然后，将细菌颗粒(在IPTG诱导之前和之后)关于SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。产生了对应于重链或轻链插入物的显著的 25KDa带，表明那些重链和轻链适当地表达(图21 (B))。按照以上所述产生的重组Fab基本上发挥了与由完整母体抗体发生酶裂解的Fab 相同的功能。对于哺乳动物重组蛋白表达，那些重链和轻链插入物采用Τ0Ρ0克隆试剂盒 (Invitrogen, CA)克隆至哺乳动物表达载体，ρOptiVec和pcDNA3. 3中。实施例11-重组抗-MUCl *单链Fab (scFab)的产生为了进一步提高重折叠的效率而最终提高抗体变体的特异性活性，产生了单链 Fab (scFab)。对应于抗-MUC1*抗体MIN-C2和MIN-E6的重组单链Fab构建体采用图10B 和图22中所示的设计产生。在N-端开始，scFab构建体，由轻链(VL)的可变区、轻链(CL) 的恒定区、34个氨基酸的柔性接头、重链(VH)的可变区和重链恒定区的CHl部分组成。重链和轻链通过具有以下序列SGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSG(SEQ ID NO :361)的柔性接头连接。轻链(VL+CL)和重链片段(VH+CH1)，通过采用从使用特异性引物的特异性杂交瘤克隆分离的mRNA实施逆转录PCR而获得。
在轻链、重链片段和接头正确的组装之后，将DNA框架内克隆到哺乳动物表达载体(psecTag，Invitrogen, Carlsbad CA)中。这导致 N-端 Ig_k 前导序列和 C-端 myc 和有助于纯化的多组氨酸标记的框架内添加。由该构建体，包括Ig-k前导序列和纯化标记的 DNA片段经由PCR和通过采用合适限制位点亚克隆到允许高拷贝复制质粒DNA和使用高表达CMV启动子的另一个表达载体pCEP4中。由此产生的构建体用于哺乳动物细胞中的短暂表达。为此目的，使用适用于在悬浮培养物(Invitrogen，Carlsbad CA)中生长的人胚胎肾细胞(ΗΕΚ49;3)并且分泌的Fab采用抗myc标记亲和色谱进行纯化。图23示出了采用 MIN-C2序列的这种构建体的完整组装。实施例12-人源化或嵌合的(框架区是人的而CDR不是人的)抗-MUCl *抗体的
产生本发明的抗-MUC1*单克隆抗体可以是人源化的单克隆抗体或人单克隆抗体。当少部分鼠抗体嫁接到人免疫球蛋白分子从而产生其中免疫球蛋白分子中仅仅Fc部分为人的嵌合抗体或其中免疫球蛋白中仅仅互补性决定区(CDR)为鼠的而90%至95%的分子为人的人源化抗体时全部抗原鼠mAb变成人友好的。在一个方面，全人单克隆抗体可以通过采用传统方法如 HuMAb-Mouse (GenPharm-Medarex)或 XenoMouse (Abgenix，Inc.)技术产生于转基因小鼠中。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白，其中来自接受者的CDR的残基被来自具有所期望特异性、亲和性和生物学功能的非人物种如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基取代。人抗体也能够采用诸如噬菌体展示库(Hoogenboom and Winter，J. Mol. Biol， 1991,227 38l,Marks et al.，J.Mol.Biol. 1991,222 :581)的技术而产生。用于人源化非人抗体的方法也是众所周知的。人源化能够按照如公开于Jones et al. ,Nature, 1986, 321 522 ；Riechmann et al. , Nature,1988,332 :323 ；禾口Verhoeyen et al. , Science,1988,239 1534中的Winter等人的方法通过用啮齿动物的CDR序列或CDR取代人抗体的对应序列而进行实施。这种人源化抗体就是嵌合抗体(美国专利号4，816，567)。典型地，人源化抗体是其中CDR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的抗体。源自非人物种的治疗性抗体可能在一些情况下当注射到人中时引起免疫响应，由此限制其功用。因此用于在人中治疗应用的抗体的人源化或部分人源化是优选的。还存在许多方法用于产生人源化或部分人源化的抗体和抗体变体。本发明涉及任何这些适合于对本发明的组合物人源化的方法的用途。在一种方法中，具有人抗体位点的小鼠用于产生全人源化抗体(Jakobovits et al.)。在另一种方法中，来自人的B细胞的DNA选择用于结合至所选择的靶，随后重新插入到全抗体的范围中。在常见的方法中，产生于非人宿主中的抗体的框架区与人框架区进行交换，保留原始的⑶R序列。这些被称为嵌合抗体。在这种方法中仅仅6个互补性决定区(OTR)每个形成鼠抗体的重链和轻链的三个被保留，该框架区的序列取代紧密相关的人抗体的那些(描述于Muzard et al.，2009中的方法)。首先，实施同源性研究以独立地相对于登记于蛋白数据库中的人抗体序列的清单比对抗-MUC1*抗体(MIN-C2或MIN-E6)的VH和VL氨基酸序列。在最佳匹配抗_MUC1*VH和VL的衍生于不同人抗体的可变区内序列中，选择那种特殊的抗体序列，其对于抗_MUC1*VH和VL序列具有最高结合的同源性。这是必需的，以便保持发生在天然抗体中的域间接触。可选地，当仅仅在框架区内进行计算时在65% 70%范围内的序列同一性是优选的。采用化学合成DNA和PCR的组合，构建成人源化的抗-MUCl*scFV， 其中框架区序列交换了人抗体的那些。将所得的DNA片段插入到表达载体中并对表达和对重折叠后的结合亲和性进行了测试。亲和性通过测试从相同的人抗体至抗-MUCl*scFV的人源化VL和VH序列加入恒定区(CL和CHl)序列而改进亲和性。所得的嵌合重链和轻链通过34个氨基酸柔性接头 SGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGS EGGGSGGGSG (SEQ ID NO :361)连接以产生单链人源化抗_MUCl*SCFab。将组装的DNA分子在N-端框架内加入IG_k信号序列和在C-端框架内加入myc和多组氨酸标记之后克隆到高拷贝复制体和高表达哺乳动物表达载体 pCEP4(Invitrogen,Carlsbad CA)中。由此产生的构建体用于在哺乳动物细胞，如已适合于在悬浮培养物(Invitrogen，Carlsbad CA)中生长的人胚胎肾细胞(HEK493)中表达。然后将分泌的Fab，例如，采用抗-myc标记亲和色谱进行纯化。为了进一步改善亲和性，将原始非人单克隆抗体或嵌合抗体变体的计算机设计的 3D结构与蛋白结构数据库中可获得的人抗体的许多3D结构相比较。然后引入在所述框架区内的另外的变体以制成与人抗体更加密切相似的嵌合变体。亲和性强化也能够通过使用噬菌体展示方法(Finlay et al 2009)完成，这种方法对于本领域技术人员而言是已知的。实施例13-用SEQ ID NO :1产生的兔多克隆抗体和用于刺激多能干细胞生长的单克隆小鼠抗体MIN-C2的比较将兔多克隆抗-MUC1*抗体(由采用SEQ ID NO=I的肽免疫化而产生)与单克隆抗-MUC1*抗体MIN-C2对于在没有bFGF或饲养细胞提取物存在下能够使干细胞生长同时维持其多能性的能力进行比较；这通过使基本上包括PSMGFR序列(SEQ ID NO=D的MUC1* 的胞外域发生二聚而完成。将人胚胎干细胞生长于类基质胶的底物上并在基本干细胞培养基上培养a)单独；b)采用30%的成纤维细胞调节的培养基加上^g/ml的bFGF(技术状态)；c)采用 50ng/ml多克隆抗-MUC1*抗体；或d)采用50ng/ml单克隆抗_MUC1*MIN_C2。基于集落形态学和其对0CT4的连续表达来评价所得细胞的多能性。多能干细胞集落以不连续的平和圆的集落生长，具有平滑的明确限定的边界，同时已经进入分化的那些具有不规则的边界并开始垂直生长。多能干细胞在其核内表达0CT4。已经丧失0CT4表达的细胞已经进入分化过程。使用了被设计以表达GFP(绿色荧光蛋白)离开0CT4启动子的胚胎干细胞，使得多能干细胞，即0CT4-阳性细胞，会发出绿荧光而因此会易于与已经开始分化的那些区别开来。图M示出了生长于基本培养基单独(A)或根据技术方案的状态，即bFGF和来自饲养细胞(B)的调节培养基中的干细胞已经生长成具有不规则边缘和以非圆形图案的集落。另外，荧光照片(右图)表明，接近一半的干细胞已经分化并不再表达0CT4或GFP。C 图和D图表明，用多克隆抗-MUC1*或单克隆抗-MUC1*MIN-C2处理的干细胞生长成具有明确限定边界的明显成形的平和圆的集落，其是多能干细胞形态学的标志。对应的荧光图像 (右图)表明，实际上每个干细胞保持了通过GFP以及通过延伸、0CT4表达证实的多能性。 多克隆和单克隆MIN-C2的效能基本上是相同的。引用的参考文献
Aboud-Pirak, et al. Inhibition of human tumor growth in nude mice by a conjugate of doxorubicin with monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor.Proc Natl Acad Sci USA. 1989 May ；86 (10) :3778-81.Baeuerle PA and Reinhardt C Bispecific T Cell Engaging Antibodies for Cancer Therapy Cancer Res 2009 Jun 15 ；69 (12) :4941-4.Bortoletto， et al.Optimizing anti_CD3 affinity for effective T cell targeting against tumor cells Eur J Immunol 2002 Nov 32(11) :3102-7.Bruenke J，et al. Br J Haematol. Effective lysis of lymphoma cells with a stabilized bispecific single-chain Fv antibody against CD19 and FcgammaRIII (CD16)2005 Jul ； 130 (2) :218-28Cao, et al. Construction and characterization of an enhanced GFP-tagged anti-BAFF scFv antibody. Appl Microbiol Biotechnol. 2008Jun ；79 (3) :423-31.Chames P and Baty D Bispecific Antibodies for Cancer Therapy. Curr Opin Drug Discov Devel.2009 Mar ； 12 (2) :276-83.Finlay WJ, Cunningham 0， Lambert MA, Darmanin-Sheehan A， Liu X， Fennell BJ, Mahon CM， Cummins E, Wade JM, Of Sullivan CM， Tan XY, Piche N， Pittman DD， Paulsen J， Tchistiakova L， Kodangattil S， Gill D， Hufton SE.Affinity maturation of a humanized rat antibody for anti-RAGE therapy-comprehensive mutagenesis reveals a high level of mutational plasticity both inside and outside the complementarity-determining regions. J Mol Biol. 2009May 8 ；388 (3) :541-58.Holliger P et al. Diabodies Small bivalent and bispecific antibodies Proc Natl Acad Sci 1993 Jul 15 ；90 (14) :6444-8.Hurwitz E et al. The covalent binding of daunomycin and adriamycin to antibodies,with retention of both drug and antibody activities. Cancer Res. 1975 May ；35(5) :1175-81.Jakobovits A，et al. From XenoMouse technoloby to panitumumab，the first fully human antibody product from transgenic mice. Nat Biotechnol. 20070ct ； 25(10) 11 34-43.Johansson, et al. Efficient expression of recombinant human monoclonal antibodies in Drosophila S2 cells. J Imm Methods. 2007 318(1-2) :37-46.Juarez-Gonzalez,et al Directed Evolution，Phage Display and Combination of Evolved Mutants :A Strategy to Recover the Neutralization Properties of the scFv Version of BCF2 a Neutralizing Monoclonal Antibody Specific to Scorpion Toxin Cn2) J Mol Biol. 2005 Mar 11 ；346(5) :1287-97.Kettleborough C. Α.，Saldanha，J. , Ansel 1, K. H. and Bendig, Μ. M. Optimization of primers for cloning libraries of mouse immunoglobulin genes using the polymerase chain reaction. Eur. J. Immunol. 1993. 23 :206-211.Lonberg N Human antibodies from transgenic animal s. Nat Biotechnol. 2005Sep ；23 (9) :1117-25.
Lu D， et al.Simultaneous Blockade of Both the Epidermal Growth Factor Receptor and the Insulin-like Growth Factor Receptor Signaling Pathways in Cancer Cells with a Fully Human Recombinant Bispecific Antibody. J Biol Chem. 2004 Jan 23 ；279 (4) :2856-65.Majors BS, et al. MCl-I overexpression leads to higher viabilities and increased production of humanized monoclonal antibody in Chinese hamster ovary cells.Biotechnol Prog. 2009 Jul-Aug ；25 (4) :1161-8.McCall AM，et al. Mol. Immunol. Isolation and characterization of an anti-CD16 single-chain Fv fragment and construction of an anti_HER2/neu/ anti-CD16 bispecific scFv that triggers CD16_dependent tumor cytolysis Mol Immunol. 1999 May ；36 (7) :433-45.McCarron， et al.Antibody Conjugates and Therapeutic Strategies Molecular Interventions 2005 5 :368-380.Morrison，S.L.Cloning, expression, and modification of antibody V regions. Current Protocols in Immunology. 2002. Unit 2. 12. John Wiley & Sons,Inc., New York, NY.Muzard J et al.Design and humanization of a murine scFv that blocks human platelet glycoprotein VI in vitro.FEBS J.2009 Aug ；276 (15) :4207-22. Epub2009 Jun 2.Nahary L，and Benhar I. Methods Mol Biol Design of a human synthetic combinatorial library of single-chain antibodies. 2009 ；525 :61-80, xiv.Razai A，et al. J Mol Biol. Molecular evolution of antibody affinity for sensitive detection of botulinum neurotoxin type A.2005 Aug5 ；351 (1) :158-69.Robinson MK, et al. Br J Cancer. Targeting ErbB2 and ErbB3 with a bispecific single-chain Fv enhances targeting specificity and induces a therapeutic effect in vitro 2008 Nov 4 ；99 (9) :1415-25.Wang, Z.，Raifu，M.，Howard, M.，Smith，L，Hansen，D.，Goldsby，R.，Ratner， D. Universal PCR amplification of mouse immunoglobulin gene variable regions :The design of degenerate primers and an assessment of the effect of DNA polymerase
to exonuclease activity. J. Immuno. Methods. 2000. 233 :167-177.将本文中引用的所有参考文献以其全文结合于本文中作为参考。ΦΦΦΦΦ本领域技术人员仅仅采用常规实验会意识到或能够确定许多本文中具体描述的本发明具体实施方式
的等价物。这种等价物旨在都包括在权利要求的范围内。
权利要求
1.一种分离的MUC1*单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体对于MUC1*是二价的。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体对于MUC1*是单价的。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合于SEQID N0:1的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在CDRl区中的重链可变区内的与 NYGMN(SEQ ID NO :330)、GYAMS (SEQ ID NO :331)或 R/GYA/GMS (SEQ ID NO :332)至少 90% 同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在CDRl区中的重链可变区内的与选自SEQ ID NOS :172-184中的序列至少90%同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在CDR2区中的重链可变区内的与 WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(SEQ ID NO :333)或 TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO :334)至少 90%同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在CDR2区中的重链可变区内的与选自SEQ ID NOS =198-210中的序列至少90%同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在CDR3区中的重链可变区内的与S/TGT/ DT/AXXY/FYA (SEQ ID NO :335)、TGTTAILNG (SEQ ID NO :336)、SGDGYWYYA (SEQ ID NO :337) 或DNYGXXYDYG/A (SEQ ID NO :338)至少90%同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在CDR3中的重链可变区内的与选自SEQ ID NOS =224-236中的序列至少90%同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序歹丨J ⑴在 CDRl 区中的与 NYGMN(SEQ ID NO :330)、GYAMS (SEQ ID NO :331)或 R/GYA/ GMS (SEQ ID NO :332)至少90%同一性的序列；以及(ii)在CDR2区中的与WINTYTGEPTYA/ VG/DDFKG (SEQ ID NO :333)或 TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO :334)至少 90% 同一性的序列。
12.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序列⑴在CDRl区中的与NYGMN(SEQ ID NO :330)、GYAMS (SEQ ID NO 331)或R/GYA/GMS(SEQ ID NO :332)至少90%同一性的序列；以及(ii)在CDR3区中的与 S/TGT/DT/AXXY/FYA(SEQ ID NO :335)、TGTTAILNG(SEQ ID NO 336),SGDGYffYYA(SEQ ID NO 337)或 DNYGXXYDYG/A (SEQ ID NO :338)至少 90% 同一性的序列。
13.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在CDR2区中的与WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG (SEQ ID NO :333) 或 TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO 334)至少 90% 同一性的序列；以及(ii)在 CDR3 区中的与 S/TGT/DT/AXXY/FYA (SEQ ID NO :335)、TGTTAILNG (SEQ ID NO :336)、SGDGYffYYA (SEQ ID NO 337)或 DNYGXXYDYG/A (SEQ ID NO :338)至少 90% 同一性的序列。
14.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序列⑴在CDRl区中的与NYGMN(SEQ ID NO :330)、GYAMS (SEQ ID NO 331)或 R/GYA/GMS (SEQ ID NO :332)至少 90% 同一性的序列；(ii)在 CDR2 区中的与 WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG (SEQ ID NO :333)或 TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO :334)至少90% 同一性的序列；以及(iii)在 CDR3 区中的与 S/TGT/DT/AXXY/FYA(SEQ ID NO :335)、 TGTTAILNG(SEQ ID NO :336)、SGDGYWYYA (SEQ ID NO :337)或 DNYGXXYDYG/A (SEQ ID NO: 338)至少90%同一性的序列。
15.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在CDRl区中的κ链可变区内的与 SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)或 RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :340)至少 90% 同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在CDRl区中的κ 链可变区内的选自SEQ ID NOS :108-110和SEQ ID NOS :112-118中的氨基酸序列。
17.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在CDR2区中的κ链可变区内的与S/ GTSNLAS(SEQ ID NO 341)或 LASNLES(SEQ ID NO :342)至少 90% 同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在CDR2区中的κ 链可变区内的与选自SEQ ID NOS :1四-138中的序列至少90%同一性的氨基酸序列。
19.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在CDR3区中的κ链可变区内的与QQRSS/ NYPS/FT (SEQ ID NO :343)或 QHSRELPFT (SEQ ID NO :344)至少 90% 同一性的氨基酸序列。
20.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在CDR3区中的κ 链可变区内的与SEQ ID NOS =149-158中的序列至少90%同一性的氨基酸序列。
21.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在CDRl区中的与SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)或 RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO :340)至少90%同一性的序列；以及(ii)在CDR2区中的与 S/GTSNLAS(SEQ ID NO :341)或 LASNLES(SEQ ID NO :342)至少 90% 同一性的序列。
22.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列⑴在CDRl区中的与SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)或 RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO :340)至少90%同一性的序列；以及(ii)在CDR3区中的与 QQRSS/NYPS/FT (SEQ ID NO :343)或 QHSRELPFT (SEQ ID NO :344)至少 90% 同一性的序列。
23.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在⑶R2区中的与S/GTSNLAS(SEQ ID NO :341)或 LASNLES(SEQ ID NO 342)至少90%同一性的序列；以及(ii)在CDR3区中的与QQRSS/ NYPS/FT (SEQ ID NO :343)或 QHSRELPFT (SEQ ID NO :344)至少 90% 同一性的序列。
24.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列⑴在CDRl区中的与SASSSV/ISYM/IH/Y(SEQ ID NO :339)或 RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO :340)至少 90% 同一性的序列；(ii)在 CDR2 区中在 CDR2 区中的与 S/GTSNLAS(SEQ ID NO :341) ^ LASNLES (SEQ ID NO :342)至少 90% 同一性的序列； 以及(iii)在 CDR3 区中的与 QQRSS/NYPS/FT (SEQ ID NO 343)或 QHSRELPFT (SEQ ID NO: 344)至少90%同一性的序列。
25.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体具有在重链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在⑶Rl区中的与NYGMN (SEQ ID NO: 330)，GYAMS (SEQ ID NO :331)或R/GYA/GMS (SEQ ID NO :332)至少90% 同一性的序列；(ii) 在 CDR2 区中的与 WINTYTGEPTYA/VG/DDH(G(SEQ ID NO :33；3)或TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO 334)至少 90% 同一性的序列；禾口 (iii)在 CDR3 区中的与 S/TGT/DT/AXXY/FYA (SEQ IDNO :335)、TGTTAILNG (SEQ ID NO :336)、SGDGYWYYA (SEQ ID NO :337)或 DNYGXXYDYG/A (SEQ ID NO 338)至少90%同一性的序列；以及在κ链可变区内的由下述组成的氨基酸序列(i)在CDRl区中的与SASSSV/ISYM/IH/ Y(SEQ ID NO 339)或 RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO :340)至少 90% 同一性的序列；(ii) 在 CDR2 区中在 CDR2 区中的与 S/GTSNLAS(SEQ ID NO :341)或 LASNLES (SEQ ID NO 342) 至少90%同一性的序列；和(iii)在CDR3区中的与QQRSS/NYPS/FT (SEQ ID NO :343)或 QHSRELPFT (SEQ ID NO :344)至少 90% 同一性的序列。
26.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在CDRl区中的与SEQ ID NO :331至少90%同一性、在CDR2区中的与SEQ ID NO 334 至少90%同一性、和在⑶R3区中的与SEQ ID NO :374至少90%同一性的在重链可变区内的氨基酸序列；以及在CDRl区中的与SEQ ID NO :340至少90%同一性、在CDR2区中的与SEQ ID NO :342 至少90%同一性、和在⑶R3区中的与SEQ ID NO :344至少90%同一性的在轻链可变区内的氨基酸序列。
27.根据权利要求1所述的单克隆抗体，具有在CDRl区中的与SEQ ID NO :332至少90%同一性、在CDR2区中的与SEQ ID NO 334 至少90%同一性、和在⑶R3区中的与SEQ ID NO :338至少90%同一性的在重链可变区内的氨基酸序列；以及在CDRl区中的与SEQ ID NO :339至少90%同一性、在CDR2区中的与SEQ ID NO :341 至少90%同一性、和在⑶R3区中的与SEQ ID NO :343至少90%同一性的在轻链可变区内的氨基酸序列。
28.根据权利要求1所述的单克隆抗体，包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :353至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :355至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :357至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO 359 90%同一性的FWR4序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :345至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :347至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :349至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO 351至少90%同一性的FWR4序列。
29.根据权利要求1所述的单克隆抗体，包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :362至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :363至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :364至少90%同一性的FWR3序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :365至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :366至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :367至少90%同一性的FWR3序列。
30.根据权利要求25所述的抗体，进一步包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :353至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :355至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :357至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO 359 90%同一性的FWR4序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :345至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :347至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :349至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ IDNO 351至少90%同一性的FWR4序列。
31.根据权利要求25所述的抗体，进一步包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :362至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :363至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :364至少90%同一性的FWR3序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :365至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :366至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :367至少90%同一性的FWR3序列。
32.根据权利要求沈所述的抗体，进一步包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :353至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :355至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :357至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO 359 90%同一性的FWR4序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :345至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :347至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :349至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO 351至少90%同一性的FWR4序列。
33.根据权利要求沈所述的抗体，进一步包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :353至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :355至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :357至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO 359 90%同一性的FWR4序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :345至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :347至少90%同一性的FWR2序列、与SEQ ID NO :349至少90%同一性的FWR3序列、或与SEQ ID NO 351至少90%同一性的FWR4序列。
34.根据权利要求27所述的抗体，进一步包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :362至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :363至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :364至少90%同一性的FWR3序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :365至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :366至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :367至少90%同一性的FWR3序列。
35.根据权利要求27所述的抗体，进一步包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :362至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :363至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :364至少90%同一性的FWR3序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :365至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :366至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :367至少90%同一性的FWR3序列。
36.根据权利要求1所述的抗体，包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :368至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :369至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :370至少90%同一性的FWR3序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :371至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :372至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :373至少90%同一性的FWR3序列。
37.根据权利要求27所述的抗体，进一步包含人FWR序列，所述人FWR序列包括在人重链中的与SEQ ID NO :368至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :369至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :370至少90%同一性的FWR3序列；以及在人轻链中的与SEQ ID NO :371至少90%同一性的FWRl序列、与SEQ ID NO :372至少90%同一性的FWR2序列、或与SEQ ID NO :373至少90%同一性的FWR3序列。
38.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体被人源化。
39.根据权利要求38所述的单克隆抗体，其中，框架区是已知的人框架序列。
40.一种分离的核酸，编码根据权利要求1所述的单克隆抗体。
41.一种分离的杂交瘤，表达根据权利要求1所述的单克隆抗体。
42.根据权利要求1所述的抗体，为Fab、或单链单价抗体。
43.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是双特异性的，其中，一个识别面结合于SEQ ID NO 1的肽，而另一个识别面识别另一个表位。
44.根据权利要求43所述的抗体，其中，另一个表位是HER2或DLL4。
45.一种特异于MUC1*的scFv融合蛋白，其中，类免疫球蛋白VH域连接于类免疫球蛋白VL域，其中，所述VH链和所述VL链经由肽接头连接。
46.一种抑制细胞增殖的方法，包括使表达MUC1*的细胞与根据权利要求3所述的单价单克隆抗体接触。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述细胞是癌细胞。
48.一种提高细胞增殖的方法，包括使表达MUC1*的细胞与根据权利要求2所述的二价单克隆抗体接触。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述细胞是多能细胞。
50.根据权利要求48所述的方法，其中，所述细胞是祖细胞。
全文摘要
本发明描述了MUC1*的单克隆抗体。
文档编号C07K16/30GK102239182SQ200980148911
公开日2011年11月9日 申请日期2009年10月6日 优先权日2008年10月6日
发明者桑吉乌·马汉塔, 辛西娅·巴姆达德 申请人:米纳瓦生物技术公司