专利名称：一种用烷烃锁定的siRNA双链及锁定方法
技术领域：
本发明涉及一种siRNA双链，具体涉及一种用烷烃锁定的siRNA双链。
背景技术：
干扰RNA(RNAi，或siRNA)是近年来发现的一种抑制基因表达的小RNA。RNAi的作用机制可以分为四步首先，dsRNA被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别并被切割成含有21～23碱基的小片断，即siRNA，上述特殊的核酸内切酶在果蝇中称为Dicer，Dicer同时具有RNaseIII功能、解旋酶功能以及dsRNA结合区和PAZ结合区，它可以识别长链dsRNA并将其加工成siRNA；其次，被加工成的siRNAs或导入细胞的人工合成的siRNAs形成没有活性的核蛋白复合体；第三，在ATP依赖的解旋酶的作用下形成具有活性的RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，ATP用以保证siRNAs 5’端的磷酸化；第四，非ATP依赖的过程，RISC特异性的与细胞内的同源mRNA结合后，mRNA与dsRNA中的反义链交换，原先siRNAs中的正义链被mRNA代替，mRNA随即被切割。切割部位大约位于siRNA结合的中部，于是mRNA片断由于缺少poly(A)尾或稳定的帽子结构而很快被降解，最终导致基因沉默。
siRNA的化学稳定性差不是由于其在双链形式下被降解，而是由于在双链—单链的杂交—解旋平衡中，其单链形式被RNase酶降解造成的。根据以上原理，用非核酸分子将两条siRNA链的两端分别连接起来，将siRNA双链锁定，siRNA双链就不易解旋降解，从而可以改善siRNA双链的化学稳定性和血液容留时间。在细胞内，可以利用细胞内存在的Dicer酶释放被锁定的siRNA，对靶基因的表达进行抑制。但是，已有的修饰和连接方法对siRNA的稳定性的改进十分有限。现有的siRNA仍存在化学稳定性差、血液容留时间短等缺陷。
从化学活性角度看，烷烃是最稳定的结构之一。尤其在机体内它们可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、加成等反应及广泛的pH环境均可耐受。从生物学的角度看，由于烷烃亲脂性，膜透性非常好，因此设计合成烷烃锁定siRNA将是提高siRNA稳定性和活性的理想途径。
发明内容
本发明涉及一种用烷烃锁定的siRNA双链，该siRNA双链的两条单链的两端分别通过烷烃连接，两条单链至少80％互补，其结构如通式1所示
其中，N表示为核苷酸；n为1-6的整数；所述siRNA双链可以为常规的各种具有干扰靶基因表达功能的siRNA双链。
优选地，所述siRNA双链的每条单链含19-50个碱基； 更优选地，所述siRNA双链的每条单链含19-30个碱基。
本发明还涉及一种用烷烃锁定siRNA双链的方法，该方法包括如下步骤 1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列； 2)制备选自通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷单体；
其中，n优选1-6的整数；n1和n2优选1-3的整数；B为天然的或非天然的核苷碱基，所述天然的或非天然的核苷碱基可以带有常见的保护基； 3)通过固相合成的方式，合成需要被锁定的siRNA，并在合成过程中将通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷单体连接到两条siRNA链的3’端和5`端，使每条siRNA链的3’端和5`端都含有一个末端双键； 4)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃关环复分解反应，即用烷烃链将两条siRNA链锁定。本发明用烷烃锁定siRNA双链的方法的示意图如图1所示。
优选地，所述通式2选自如下结构中的一种
其中，R为H或常见的氨基保护基，诸如苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基等；n优选1-6的整数。
优选地，所述通式3选自如下结构中的一种
其中，R为H或常见的氨基保护基，诸如苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基等；n优选1-6的整数。
优选地，所述通式4选自如下结构中的一种
其中，R为H或常见的氨基保护基，诸如苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基等；n1和n2优选1-3的整数。
优选地，所述通式5选自如下结构中的一种
其中，R为H或常见的氨基保护基，诸如苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基等；n1和n2优选1-3的整数。
步骤2)中，通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷单体的合成路线如图2所示，其制备方法参见文献J.Org.Chem，Vol.73，No.1，2008。
步骤3)中，固相合成的方式参考Current Protocols in NucleicAcid Chemistry(Chapter3 and Chapter 4)。
步骤4)中，在氮气保护下将固相合成的siRNA(1摩尔)溶于DMSO中，加入Grubbs催化剂(0.05摩尔)，常温下搅拌48h。反应结束后，采用本领域常用的技术手段先将粗产物经NAP-10凝胶柱脱盐，然后再用HPLC纯化。
本发明至少具有下列优点及有益效果 (1)本发明设计合成了2`-或3`-位修饰的核苷单体，其制备方法简单，不需要苛刻的反应条件和复杂的化学反应过程。
(2)本发明采用化学结构最稳定的烷烃锁定siRNA双链，该siRNA双链具有良好的亲脂性和膜透性，在机体内可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶等的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、加成等反应及广泛的pH环境均可耐受。
(3)本发明利用Grubbs催化剂进行偶联锁定，反应简单易行。
(4)通过本发明的方法锁定的siRNA双链，其化学稳定性和血液容留时间均得到明显的改善，而且容易透过细胞膜。被烷烃锁定的siRNA进入细胞后，经细胞内存在的Dicer酶的剪切和加工后释放被锁定的siRNA，从而对靶基因的表达进行抑制。
图1为本发明锁定siRNA的方法的示意图； 图2为通式2、通式3、通式4或通式5所示核苷单体的合成路线。
具体实施例方式 实施例1用烷烃锁定的siRNA双链及锁定方法 1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列 选择GAPDH(Genbank登记号为NC_000012)为靶基因，设计siRNA，其对应于NC_000012的位置为2700-2718bp； 正义链5`-GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT-3`； 反义链5`-CUU GAG GCU GUU GUC AUA CTT-3`； 2)制备选自通式2和通式3所示的核苷单体
制备方法参见文献J.Org.Chem，Vol.73，No.1，2008； 3)固相合成siRNA
4)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定
实施例2用烷烃锁定的siRNA双链及锁定方法 1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列 选择GAPDH(Genbank登记号为NC_000012)为靶基因，设计siRNA，其对应于NC_000012的位置为2700-2718bp； 正义链5`-GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT-3`； 反义链5`-CUU GAG GCU GUU GUC AUA CTT-3`； 2)制备选自通式4和通式5所示的核苷单体
制备方法参见文献J.Org.Chem，Vol.73，No.1，2008； 3)固相合成siRNA
4)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定
实施例3实施例1和2制备的用烷基锁定的siRNA双链的稳定性 将未锁定的siRNA双链和实施例1、2制得的用烷基锁定的siRNA双链分别在10％的血清中孵育1min、30min、1.5h、3h、6h、12h、24h，进行20％PAGE电泳，以观察上述siRNA双链在血清中的稳定性。
结果表明未锁定的siRNA双链在血清中孵育30min时明显降解，6h时完全降解，而实施例1和实施例2制备的用烷基锁定的siRNA双链在24h内未观察到明显降解。进一步实验表明，实施例2制备的用烷基锁定的siRNA双链在36h时开始降解，72h后降解明显，而实施例1制备的用烷基锁定的siRNA双链始终未观察到明显降解。
显然，本发明用烷基锁定的siRNA双链的化学稳定性很好，血液容留时间较长。
实施例4体内(胞内)抑制靶基因活性作用 培养HEK293细胞(人胚肾细胞系)，分别用未锁定的siRNA双链和实施例1、2制得的用烷基锁定的siRNA双链进行转染，通过Realtime-PCR检测三组实验中HEK293细胞GAPDH基因mRNA的表达量，以未转染siRNA的HEK293细胞作为阴性对照。
结果表明未锁定的siRNA对GAPDH的抑制率为91％，实施例1中锁定的siRNA的抑制率为93％，实施例2中锁定的siRNA的抑制率为89％，说明用本发明的方法锁定的siRNA双链，其活性作用与未锁定的siRNA双链相比，没有显著性差异。
权利要求
1.一种用烷烃锁定的siRNA双链，其特征在于，该siRNA双链的两条单链的两端分别通过烷烃连接，两条单链至少80％互补，其结构如通式1所示
其中，N表示为核苷酸；n为1-6的整数。
2.根据权利要求1所述的用烷烃锁定的siRNA双链，其特征在于，所述siRNA双链的每条单链含19-50个碱基。
3.根据权利要求2所述的用烷烃锁定的siRNA双链，其特征在于，所述siRNA双链的每条单链含19-30个碱基。
4.一种用烷烃锁定siRNA双链的方法，其特征在于，包括如下步骤
1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列；
2)制备选自通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷单体；
其中，n为1-6的整数；n1和n2为1-3的整数；B为天然的或非天然的核苷碱基，所述天然的或非天然的核苷碱基带有或不带有保护基；
3)通过固相合成的方式，合成需要被锁定的siRNA，并在合成过程中将通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷单体连接到两条siRNA链的3’端和5`端；
4)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通式2选自如下结构中的一种
其中，R为H或氨基保护基；n为1-6的整数。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通式3选自如下结构中的一种
其中，R为H或氨基保护基；n为1-6的整数。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通式4选自如下结构中的一种
其中，R为H或氨基保护基；n1和n2为1-3的整数。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通式5选自如下结构中的一种
其中，R为H或氨基保护基；n1和n2为1-3的整数。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述氨基保护基为苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基。
全文摘要
本发明涉及一种用烷烃锁定的siRNA双链，该siRNA双链的两条单链的两端分别通过烷烃连接，两条单链至少80％互补。该siRNA双链具有良好的亲脂性和膜透性，在机体内可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶等的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、加成等反应及广泛的pH环境均可耐受。本发明还涉及用烷烃锁定siRNA双链的方法。通过本发明的方法锁定的siRNA双链，其化学稳定性和血液容留时间均得到明显的改善。
文档编号C07H1/00GK101824062SQ20101014990
公开日2010年9月8日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者高源 , 刘迎春 申请人:北京欧凯纳斯科技有限公司