专利名称：一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白tat-gh及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白，还涉及一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白的制备方法，还涉及一种表达口服重组蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，同时还涉及一种口服重组蛋白在促进黄鳝生长中的应用。
背景技术：
黄鳝(Monopterus albus),俗称鳝鱼、田鳗和长鱼等,它是一种淡水硬骨鱼类，广泛分布于中国、印度、马来西亚和印度尼西亚，已在中国中南部开展大面积的养殖。中国目前的养殖总产量已经达到18万吨，由于其生长快，成活率高以及对网箱养殖条件的适应性好，它被当作中国水产养殖的首选品种之一。鳝肉质细嫩，鲜美可口，营养价值高，具有滋补 强身和药用功能，是人们喜爱的滋补水产品，深受中国消费者的青睐。为了繁荣市场，丰富人民生活，发展池塘养殖已变得日益迫切，对黄鳝的生物学特性、生长变化规律等方面的研究已成为重要的课题。近年来其水产养殖发展很快。在水产养殖中高效饵料的研制是增产增收的基本途径。如何提高饵料转化率，缩短养殖周期，降低生产成本，提高水产养殖品的产量和质量被越来越多的科研工作者和养殖户所关注。鱼类生长激素是由鱼的脑垂体前叶细胞合成分泌的一种单链多肽，具有提高饵料转化率、促进鱼类生长发育、调节蛋白质合成和脂肪代谢等多种生理功能。GH的作用途径有两种，一种是诱导肝细胞、肌细胞产生IGFs等生长介导素(somatomedins),再经IGF间接起作用，另一种是GH激活JAK2 (Janus Kinase)，JAK2及GHR (生长激素受体)磷酸化，并同磷酸化的受体一起将GH信号向下游传递。无论哪一种方式GH都需要首先同细胞表面的特异性受体即GHR结合，再由受体介导，激发一系列生化反应并最终产生生物效应。鱼类GH的作用的发生，主要是通过IGFs的间接方式。IGFs属于胰岛素家族成员，包括IGF-I和IGF-II两个亚型，合成部位主要在肝脏，其合成和分泌主要由GH控制，生长激素能诱导肝脏中IGF-I和IGF-II的合成。反过来，IGF对GH的合成和分泌有抑制作用。鱼类的生长和其它脊椎动物一样，是通过脑神经内分泌-GH-IGF轴来实现的。但正常鱼体内的生长激素含量甚微，每升鱼血仅含20 yg。生长激素直接投喂给鱼苗，可以促进鱼体的生长，表明生长激素多肽可以活性成分的形式进入鱼体。研究发现，鱼类小肠上皮细胞可以通过胞饮作用吸收大分子并转移进入血液循环。同时许多研究已经证实，用基因工程方法获得的生长激素具有代偿内源生长激素的功能，肌肉注射外源生长激素，可促进鱼体生长；饵料中添加的重组生长激素可通过鱼体消化道后肠上皮细胞的胞饮作用吸收，提高鱼体的生长速度，并且在鱼体内半衰期一般在6h以内，在12 24h之后，基本检测不到。Atia等(1999)将外源表达的金头鳃生长激素蛋白经口投喂鱼苗38天，生长率比对照组提高55飞5%。而经注射重组GH 90天后，生长率也比对照鱼提高了 29 33%。同样，白俊杰等(1998)将鲑鱼生长激素通过PCR技术改造后，克隆到大肠杆菌中获得表达，重组蛋白为可溶性，占细胞总蛋白的10%。鲑鱼重组蛋白经纯化、复性后，同饲料一起投喂罗非鱼，产生了明显的促生长作用。2001年王伟等人工合成了草鱼GH基因，在大肠杆菌中的表达量占到细胞总蛋白量的40%。2003年Li等在毕赤酵母中用AOX基因启动子表达鲤鱼生长激素，其表达量为300-400mg/L0罗非鱼经注射重组鲤鱼GH 5周后，实验鱼的增长率比对照提高53. 1%。1998年陈丹等也在毕赤酵母中用AOX基因启动子构建了鲈鱼生长激素表达载体，经甲醇诱导后，成功表达了鲈鱼生长激素。2003年陈荣忠等则将表达鲈鱼GH基因的重组酵母菌制成干粉，掺入到饲料中进行促生长试验，发现重组酵母能明显促进大黄鱼、卵形鳃、花尾胡椒鳃等鱼种的生长。因此，用基因工程方法获得廉价的重组鱼生长激素具有产量高、成本低的优点，适宜大量制备，将其应用于水产养殖业是增收节支的有效途径。TAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体-蛋白质转导结构(proteintransduction domains, pTDs)或称细胞穿膜妝(cell penetrating peptides, CPP)。TAT能穿透细胞膜、细胞核膜，携带肽、蛋白质和DNA分子等进入胞质和胞核发挥生物效应，具有高效性、无须耗能或通过受体转运的特点，为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、简便的方法。Tat蛋白是一个小型蛋白，其分子大小依HIV-I病毒的品系不同而有所差异，从86到130个氨基酸残基不等，由两个外显子编码。一般以86个氨基酸的Tat蛋白作为研究对象，分析其结构与功能。根据氨基酸的组成，Tat序列可被 分为几个不同的区N末端激活区(I 19位氨基酸)、半胱氨酸富集区(20 31位氨基酸)、中心区(32 47位氨基酸)、碱性氨基酸富集区(48 57位氨基酸)及谷胺酰胺富集区(60 76位氨基酸)。半胱氨酸富集区对维持Tat的功能是必需的，可介导体外金属连接的二聚物的形成。碱性氨基酸富集区含有核定位序列，且在病毒Tat蛋白序列中具有高度保守性。中心区、碱性氨基酸富集区及谷胺酰胺富集区均与RNA结合相关。TAT分子中的富含碱性氨基酸、具有较多正电荷的多肽片段与跨膜转导有关。Schwarze等确定具有蛋白转导功能的最小肽段是47-57，由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，该段等电点12. 7，为碱性多肽，转导速度快，效率高。该结构域已被证明能以一种快速高效的方式将外源融合蛋白转导到真核细胞内，这种方式不依赖细胞膜，转运子，但其详细机制目前还不是很清楚。自Nagahara等报道构建了一个可通用的原核表达载体(pTAT_HA)之后，有关TAT介导的蛋白质功能的研究报道急剧增加，如丁劲等利用该载体在大肠杆菌中成功地表达了 TAT2乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白。并且，其研究的方法学也趋于成熟。目前的体内及体外试验显示HIV-TAT，可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞，且未观察到明显毒副作用。TAT可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内转导进入细胞，而且在体内可以通过血液循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内。自PTD被识别并鉴定以来，数百种化合物和蛋白质被成功转导进入不同的细胞或者跨越血脑屏障入脑，并表现出了相应的生物活性，而且已将多种变性的蛋白质如半乳糖苷酶转导进入小鼠体内并恢复了生物活性，被带入细胞的分子基本上保留了它们各自原有的性质，在细胞内会各显其能，各尽其责，这些特性使得这种技术特别具有吸引力。本发明将一种蛋白转导结构域多肽(TAT)和黄鳝生长激素成熟肽(简称GH)构建成融合蛋白，通过黄鳝口服之后能有效发挥其生物学活性，促进黄鳝生长，为制备TAT介导的口服蛋白制剂提供了理论依据
发明内容
本发明的主要目的是提供了一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白，其序列为SEQ IDNO. 2所示。本发明将TAT穿膜肽与GH蛋白融合表达，得到具有生物活性的TAT-GH蛋白，利用TAT的穿膜功能将GH蛋白穿过肠壁细胞进入血液发挥其生物学功能。本发明的另一个目的是在于提供了一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白的制备方法，该方法可应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。本发明的目的另一个目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株大肠杆菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-maGH, F_ompThsdSB(rB_mB0 gal dcm(DE3)；CCTCCNO :M2012147。该菌株可以表达蛋白转导结构域多肽(TAT)和黄鳝生长激素成熟肽(GH)基因工程融合蛋白TAT-GH。其优点是表达量大，部分可溶，表达的包涵体蛋白复性容易，易于工业化生产，成本低，安全性好。本发明的再一个目的是在于提供了一种黄鳝生长激素基因工程融合蛋白在促进黄鳝生长中的应用。通过口服方式，TAT-GH蛋白穿过肠壁细胞进入血液发挥其生物学功能，产生了明显的促进黄鳝生长的效应。 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白的制备方法，其步骤为I 黄鳝GH基因的制备根据GeneBank中已经发表的GH(GeneBank AY265351. I)的序列人工合成黄鳝GH基因(由上海Generay公司合成)，并设计PCR引物进行基因扩增。2.融合基因TAT-GH的制备通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成TAT-GH。即以人工合成的黄鳝GH基因为模板，通过搭桥的方法在GH序列的前端加上TAT序列，得到TAT-GH片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I 所示。3.融合基因的制备及表达载体的构建用EcoR I 和 BamH I 双酶切 TAT-GHPCR 片段和质粒 pET_32a ( + )(购自 Novagen公司)，目的片段TAT-GH和开环pET-32a ( + )胶回收后4°C连接过夜，转化大肠杆菌JM109(购自Novagen公司)感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定，用碱裂解法小量提取质粒，参照《分子克隆实验指南》进行，DNA产量在IOOng和5 ii g之间，依质粒的拷贝数而定。对提取的质粒进行酶切鉴定，得到的阳性克隆命名为pET-32a ( + ) -TAT-GH。4.大肠杆菌基因工程菌的制备将质粒pET_32a ( + ) -TAT-GH转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自Novagen公司)感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-GH 的重组基因工程菌株 Escherichia coli BL21 (DE3) pET_32a_TAT - GH，申请人已于2012年4月26日将该菌送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNO:M 2012147，分类命名大肠杆菌 BL21 (DE3) pET-32a-TAT_maGH，F^ompThsdSe (rB_mB0 gal dcm(DE3), Escherichia coli BL21 (DE3) pET-32a-TAT_maGH,F ompThsdSg (rB mB) gal dcm (DE3)。通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-32a-TAT-GH，它属于革兰氏阴性杆菌，无芽胞。最适生长温度为37°C，菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色。该菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好，能发酵多种糖类产酸、产气。所述的大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a_TAT_GH 能够表达 TAT-GH融合蛋白，该蛋白的基因为SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。5.基因工程融合蛋白TAT-GH的诱导表达重组基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET_32a-TAT_GH 的单菌落接种于含氨苄青霉素(终浓度为IOOii g/ml)的20ml LB液体培养基中，于37°C摇床中，300rpm振摇过夜培养10 12h。按I :100的比例接种到20ml新鲜的LB (Amp+)液体培养基中，37°C恒温、300rpm培养3h左右，至OD6tltl约0. 6^0. 8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0. 6mM,于37°C恒温、300rpm诱导表达 5h。离心 12000g, 4°C, IOmin 收集菌体，用 20ml 的 Lysis Buffer重悬菌体进行超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。进一步扩大培养，超声波破碎后，12000g，4°C离心，20min收集沉淀。
6.基因工程融合蛋白TAT-GH的纯化收集湿菌体后，加入20ml细胞lysis buffer重悬菌体沉淀,于_20°C反复冻融3次，再进行超声波破碎(400W，工作3s，间歇3s)，菌液破碎至清亮。将破碎后的菌液于4°C离心，12000rmp、20min，分别收集上清和菌体沉淀。用2M尿素洗涤菌体沉淀，重复2次，再用水洗漆I次。加入适量20ml包涵体lysis buffer, 4°C裂解过夜,4°C离心，12000rpm> IOmin,弃去沉淀，将上清液稀释于IOOml蛋白复性液中，4°C、复性24h。将复性液用0. 45 y m滤膜过滤，装入处理过的透析袋中(在IOmM NaHCO3^lmM EDTA的溶液中煮沸lOmin)，透析袋两端用夹子夹好，将其放入透析液中，4°C、透析12 24h。期间需更换一次或两次透析液，以便完全除去尿素。经PEG20000浓缩后，4°C离心，12000rpm、10min，上清即为复性好的重组蛋白。用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。即得到纯化的TAT-GH蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO. 2。Ni-NTA Superflow柱亲和层析法进一步纯化重组蛋白，其步骤如下(I)用移液器吸取Iml Ni-NTA Agarose装入层析柱底部，用10倍柱体积的双蒸水洗涤柱子。(2)用10倍柱体积的Lysis Buffer平衡镍柱。(3)将复性好的蛋白溶液经0. 45 ii m的滤膜过滤后，用蠕动泵以lml/min的速率，加入到平衡好的镍柱子中，使蛋白前端的6-His与Ni2+充分结合。(4)依次用适量的含 2OmM Imidazole>40mM Imidazole>60mM Imidazole、80mMImidazole的Wash Buffer以lml/min的速率洗脱柱子，以洗脱下Ni2+柱上结合不牢固的或少量未与Ni2+结合的非目的蛋白。用核酸蛋白检测仪检测每次洗脱后的流出液的OD■，待OD28tl持续为0时停止洗涤。(5)用含 250mM Imidazole 的 Elution Buffer 以 200 u 1/min 的速率洗脱柱子，用Eppendorf管收集目的蛋白。取收集的蛋白进行12%SDS_PAGE检测纯化效果。(6)进行SDS-PAGE电泳，检测所收集的蛋白的纯化效果。一种黄鳝生长激素基因工程融合蛋白在促进黄鳝生长中的应用，其应用过程是A. ELISA-RA法检测基因工程融合蛋白TAT-GH的生物活性取新鲜处死的黄鳝肝脏剪碎，加5倍于肝重的膜受体缓冲液，4°C反复匀浆。4°C高速离心，15000rpm>30min,取上清。4°C超速离心，100000rpm>60min,弃上清，收集沉淀，以10mg/ml重悬于0. 05M Na2CO3-NaHCO3缓冲液。用该缓冲液以1:50稀释受体膜，使终浓度为200ii g/ml，添加到酶标板中，每孔100iU，4°C包被过夜。用5%BSA封闭96孔酶标板，每孔添加100 u 1，37°C封闭2h。甩干封闭液，每孔用300 u L PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。每孔加入IOOiU梯度稀释的蛋白溶液，每个浓度3个平行，37°C孵育2h。甩干封闭液，每孔用300 u L PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。每孔加入100 U I稀释400倍的GH抗体溶液，37°C孵育2h。甩干封闭液，每孔用300 u L PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。每孔加入100 ill稀释10000倍的HRP标记的羊抗兔IgG，37°C孵育2h。甩干封闭液，每孔用300 u L PBST缓冲液振荡洗涤5min，重复三次。每孔加入100 U I OPD显色液，37°C避光反应10-20min。每孔加入50 U I终止液，终止显色。用Bio_Rad450全自动酶标仪检测每孔在490nm波长下的吸光值。B.基因工程融合蛋白TAT-GH的促生长实验挑选健康鲜活且大小相近的黄鳝分成3组，每组20尾，平均20g/尾。饲养在同一 室内同样规格的塑料箱中，水温控制在22 25°C，24h通氧，饲喂时间为20天。实验组I 口头灌喂100 y g的GH纯化蛋白，实验组2 口头灌喂100 ii g的TAT-GH纯化蛋白，对照组口头灌喂等量的生理盐水。每天下午5 00投喂饵料，投喂量以喂饱为度，而后清走残留饵料。每天观察黄鳝生长状况并换水。称重前一天停止喂食，比较实验前和实验结束时黄鳝体重及体长的变化，分析是否有显著的差别。与现有技术相比，本发明具有以下特点(I)本发明所涉及的融合蛋白TAT-GH表达量大，为部分可溶蛋白，包涵体蛋白也容易复性，便于大规模生产，成本低廉，操作工艺简单；(2)本发明利用大肠杆菌表达TAT蛋白转导结构域和黄鳝GH的融合蛋白，意在采用口服方式到达促进黄鳝生长的目的。蛋白转导结构域多肽TAT目前还没有直接应用于养殖业，但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。本发明公开的基因工程菌株制备的TAT-GH重组蛋白，TAT可以携带GH蛋白不经口服而直接进入血液中，可以应用于大规模的养殖业，使其具有实际操作的可行性。
图I为一种重组表达质粒pET_32a ( + ) -TAT-GH的构建过程示意图。图2A为一种重组表达质粒pET_32a ( + ) -TAT-GH的PCR示意图。通过PCR重叠延伸技术分3次PCR合成TAT-GH。即以人工合成的黄鳝GH基因为模板，通过搭桥的方法在GH序列的前端加上TAT序列。图2B为一种重组表达质粒pET_32a ( + ) -TAT-GH的酶切鉴定示意图。从LB (Amp+)平板上挑取白色的单菌落进行扩大培养，对菌液进行小量提取质粒进行BamH I/EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测鉴定阳性重组子。M DL2000泳道I :PET32a-TAT_GH BamH I/EcoR I 双酶切泳道2 PET32a-TAT-GH 质粒图3为一种重组蛋白TAT-GH经IPTG诱导表达示意图。
M :蛋白 Maker泳道I :IPTG 诱导前 BL21/PET_32a 空载泳道2 IPTG 诱导前 BL21/PET-32a_GH泳道3 IPTG 诱导前 BL21/PET-32a_TGH泳道4 =IPTG诱导后破碎上清BL21/PET_32a空载泳道5 =IPTG诱导后破碎上清BL21/PET-32a_GH泳道6 =IPTG 诱导后破碎上清 BL21/PET-32a_TGH泳道7 =IPTG诱导后破碎沉淀BL21/PET_32a空载
泳道8 =IPTG诱导后破碎沉淀BL21/PET-32a_GH泳道9 =IPTG 诱导后破碎沉淀 BL21/PET-32a_TGH泳道10 =IPTG诱导后破碎全菌体BL21/PET_32a空载泳道11 =IPTG诱导后破碎全菌体BL21/PET-32a_GH泳道12 =IPTG诱导后破碎全菌体BL21/PET-32a_TGHM :蛋白 Maker图4为一种鱼肝膜受体与TAT-GH结合曲线示意图。ELISA-RA检测表明，黄鳝肝膜受体和TAT-GH重组蛋白能够发生特异性结合。当肝膜受体浓度一定时，随着黄鳝生长激素浓度的提高，光密度值会相应升高；当以加热失活的黄鳝生长激素和肝膜受体结合时，光密度值有显著下降；当黄鳝生长激素和肝膜受体同时失活时，光密度值进一步降低。当黄鳝生长激素浓度一定时，随着肝膜受体浓度的降低，光密度值会相应下降。
具体实施例方式下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。实施例I :黄鳝GH基因的制备人工合成黄鳝GH基因根据GeneBank中已经发表的GH (GeneBank AY265351. I)的序列人工合成黄鳝GH基因，并设计PCR引物。GH的上游引物Pl :5’-GGCGGATCCATGGACAAAGTCGTCCTCCTG-3’ (划线处为 BamH I 位点)，即为 SEQ ID NO. 3，GH 的下游引物 P2 :5，_GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3 (划线处为 EcoR I 位点)，即为 SEQ ID NO. 4。以人工合成的黄鳝GH基因为模板，PCR扩增目的基因GH。GH基因的PCR反应条件为①94°C 2分钟，②(94°C 30秒一560C 40秒一68°C 40秒)共32个循环，③68°C 5分钟。将反应后的产物贮于_20°C备用。PCR反应体系
权利要求
1.一种分离重组的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。
2.一种分离重组的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
3.—种表达权利要求2所述融合蛋白的基因工程菌株，其特征在干大肠杆菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-maGH, ompT hsdSB (rBmB)gal dcm (DE3)；CCTCC NO M2012147o
4.一种权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其步骤为 黄鳝GH基因的制备根据GeneBank中已经发表的GH的序列GeneBank AY265351. I人工合成黄鳝GH基因，并设计PCR引物，以人工合成的黄鳝GH基因为模板，PCR扩增目的基因GH;GH 的上游引物 Pl :5’ -GGCGGATCCATGGACAAAGTCGTCCTCCTG-3’ ；GH 的下游引物 P2 :5’ - GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG -3’ ； TAT-GH融合基因的制备通过PCR的方法扩增蛋白转导结构域多肽TAT，并将其与GH基因融合，其具体步骤是 以人工合成的黄鳝GH基因为模板，上游引物 P3: 5 ’ -CAGCGTCGTCGTGGATCCATGGACAAAGTCGTCC-3，； 下游引物 P4: 5’ -GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’ .划线处为 EcoR I 位点，退火温度为55°C，PCR扩增目的片段，电泳并作回收； 以上一歩回收产物为模板，上游引物 P5: 5 ’ -CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC-3，；下游引物 P4: 5’ -GCCGAAITCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’ ； 退火温度55°C做PCR，电泳并作回收； 以上一歩回收产物为模板， 上游引物 P6: 5’ -GGCGGATCCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT-3’ ,划线处为 BamH I 位点，下游引物 P4: 5’ -GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’ ,划线处为 EcoR I 位点，退火温度55°C，PCR扩增目的基因TAT-GH ； PCR反应条件为①94°C 2分钟，②94°C 30秒一56°C 40秒一68°C 40秒，共32个循环，③68°C 5分钟，将反应后的产物贮于-20°C备用； 融合基因表达载体的构建首先双酶切TAT-GH融合基因和质粒pET-32a ( + )，胶回收含TAT-GH基因的片段和开环pET-32a( + )片段，22°C连接两小时后转化到感受态万.coh'中，所得到的阳性克隆子是TAT-GH融合基因的大肠杆菌，该质粒命名为pET-32a ( + )_TAT_GH ； D.大肠杆菌基因工程菌的制备将质粒pET-32a(+ )-TAT-GH转化到感受态BL2KDE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株； E.基因工程融合蛋白的制备将步骤D中获得的基因工程菌转接到LB液体培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达。
5.权利要求2所述的融合蛋白在促进黄鳝生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白TAT-GH及制备方法和应用。一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白的制备方法，其步骤是A、根据已知序列人工合成黄鳝GH基因；B、通过PCR的方法扩增蛋白转导结构域多肽TAT，并将其与GH基因融合；C、双酶切TAT-GH融合基因和质粒，胶回收含TAT-GH基因的片段和开环片段，得到TAT-GH质粒；D、将质粒转化到感受态BL21(DE3)中，所得阳性克隆即为目的菌株。E、分离纯化目的菌株表达的蛋白。纯化后的TAT-GH重组蛋白经口服方式能有效促进黄鳝生长，为制备TAT介导的口服重组蛋白制剂提供了依据。
文档编号C07K19/00GK102766645SQ201210190098
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者周莉, 孟小林, 徐进平, 王健 申请人:武汉凯肽来生物科技有限公司