Osw-1类似物和缀合物，及其用途

Osw-1类似物和缀合物，及其用途
【专利摘要】提供了与结合OSBP的天然化合物OSW-1结构相关的多种化合物。还提供了包含该OSW-1类似物的药物组合物，以及使用这些OSW-1类似物或其药学上可接受的盐、对映异构体或立体异构体治疗动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和癌症(包括p21-缺乏的癌症)的方法。还提供了OSW-1类似物与单克隆抗体(包括靶向癌细胞的单克隆抗体)的缀合物。还提供了包含该缀合物的药物组合物，以及使用这些缀合物用于治疗癌症(包括p21-缺乏的癌症)的方法。
【专利说明】osw-1类似物和缀合物，及其用途
[0001]相关申请
[0002]本申请在35U.S.C.§ 119(e)下要求于2011年5月19日申请的美国临时专利申请USSN61/488，023的优先权，其通过参照并入本文。
【背景技术】
[0003]在1980年代早期提出了胆固醇合成通过氧固醇结合蛋白(即，结合至氧固醇的胞质成分)调节的假说。现今已描述了两个已知结合氧固醇的蛋白家族:肝X受体(LXR)M及描述为细胞质氧固醇受体的蛋白家族，被称作氧固醇结合蛋白(OSBP)或OSBP相关蛋白(ORP)。
[0004]OSBP(氧固醇结合蛋白)是一种发现于真核细胞中的蛋白，其首先确认是基于其对于氧固醇，特别是25-羟基胆固醇的高亲和力(Kd=37nM)。其为进化保守蛋白家族的最初成员；在哺乳动物中现已知至少十二种，包括OSBP(还被称作0SBP1)、0RP1L、0RP1S、0RP2、0RP3、0RP4L、0RP4S、0RP5、0RP6、0RP7、0RP8、0RP9L、0RP9S、0RP10 和 ORPlI。Lehto等人(2003)Biochim Biophys Actal631:1-11 ;Yan等人(2008) Int Rev Cytol265:253-85 ；Fairn 等人(2008)Cell Mol Life Sci65:228-36。OSBPl 是一种 89kD 蛋白，包含固醇结合域以及若干涉及蛋白-蛋白和蛋白-脂质相互作用的其它域。这些域包括定位蛋白至含磷脂酰肌醇膜的同源结构(PH)域，以及FFAT域，FFAT域为内质网(ER)定位域。OSBPl不呈现酶活性。虽然对于其细胞功能的理解还不完全，但近几年的研究已显示OSBPl是可经关键信号通路施加控制的固醇传感器。
[0005]除了 OSBPl，哺乳动物还表达至少十一种称作ORP的其它OSBP相关蛋白。正如0SBP1，各ORP含有固醇结合域，但是除此之外在ORP结构中具有相当大的变异。大部分ORP除了固醇结合域外还包括PH域。十·二种蛋白家族间的0SBP/0RP固醇结合域是保守的，但与诸如LXR、Insig或NPC-1的其它蛋白的固醇结合域不相似。ORP不如OSBPl般充分表征，但它们已涉及脂质代谢、信号转导、囊泡运输、以及非囊泡固醇转运。目前未充分理解它们的细胞功能，但是据信它们发挥了重要的细胞作用，因为它们无所不在地表达以及它们是进化保守的。它们已涉及动脉粥样硬化并可能涉及癌症。例如，ORPlL过表达导致小鼠中动脉粥样硬化。此外，发现动脉粥样硬化包含上调的0RP8，且已确认0RP9为高密度脂蛋白(HDL)水平升高的治疗靶点。OSBPl或0RP8的敲减导致LXR激动后增强的胆固醇流出水平。增加的胆固醇流出是动脉粥样硬化治疗中的治疗途径，暗示ORP可为动脉粥样硬化药物靶点。在酵母中，具有7种Osh蛋白(0RP同系物)。有趣的是，删除这七种Osh蛋白中任意六种后酵母可存活，但删除全部七种后无法存活。
[0006]Cephalostatinl (I) > OSff-1 (2) > ritterazine B(3)> schweinfurthin A(4)和(-)-stellettin E(5)(参见图1)是对于选定人类癌细胞系具有强烈细胞毒性的半最大生长抑制浓度(GI50)为低纳摩尔范围的天然产物。美国国家癌症研究所(NC1-60)还评估这些分子对于六十种经培养人类癌细胞系具有高度类似的细胞毒性模式，强烈暗示它们共享一个细胞靶点或通过类似机制起效。通过COMPARE分析，皮尔逊相关系数大于0.6 (1.0是完美匹配)的化合物被认为机理上是相关的。先前已将这些化合物称作CRAM(Cephalostatin及相关抗增殖分子)。
[0007]WO 2010/068877公开了 CRAM及其某些合成类似物为氧固醇结合蛋白(OSBP)以及OSBP相关蛋白(ORP)(包括OSBPl和0RP4)，的高亲和力配体。
[0008]发明概述
[0009]本发明部分涉及多种与结合OSBP的天然化合物0SW-1结构相关的化合物。因为已显示OSBP对于动脉粥样硬化和阿尔茨海默病(AD)是不可或缺的，本发明的一方面涉及0SW-1类似物或其药学上可接受的盐、对映异构体或立体异构体在治疗和/或预防动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和癌症，包括P21-缺乏的癌症中的用途。本发明的另一方面涉及OSff-1类似物与包括靶向癌细胞的单克隆抗体在内的单克隆抗体的缀合物。本发明的进一步方面涉及使用本发明缀合物治疗癌症的方法。本发明的另一方面涉及含有本发明化合物和缀合物的药物组合物。
[0010]附图简述
[0011]通过参照下列附图和说明可更好地理解本发明。没有必要标量图中的组分，将重点代之以阐述本发明的原理。
[0012]图1A 描述了 cephalostatin (I) > OSff-1 (2) > ritterazine B (3) > schweinfurthinA(4a) >schweinfurthin B(4b)、stellettin E(5)、胆固醇(10)和25-羟基胆固醇(25-0HC ；11)的化学结构。
[0013]图1B描述了选定的0SW-1类似物。
[0014]图2A是描述化合物1-5和0SW-1类似物6_8对于缺乏p21的HCT-116 (人类结肠直肠癌)细胞的选择性生长抑制效应的图表。BFA:布雷菲德菌素A。
`[0015]图2B是在不存在(左道)及存在(右道)过量0SW-1的情况下使用6b的HeLa细胞细胞裂解产物的考马斯亮蓝-着色聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)色谱图像。箭头:确认为OSBPl的条带。
[0016]图2C是描述通过基于iTRAQ的定量蛋白质组学确认和量化的121种蛋白的散点图。在y轴上绘制10 μ MOSff-1相对于二甲基亚砜(DMSO)对照的1gltl倍数变化的竞争且在X轴上绘制代表统计显著性的P值。将P值任意设为I用于非显著性单一肽定量。VAP-A:囊泡相关膜相关蛋白Α。
[0017]图2D是描述[3Η]-25-0HC (20ηΜ)与化合物l_4a在由过表达OSBPliyc-his的HEK-293T细胞制备的SlOO细胞裂解产物中的竞争结合实验的图表。CPM:每分钟计数。
[0018]图2E是描述[3H]-25-0HC (20nM)与化合物l_4a在由过表达0RP4L-myc_his的HEK-293T细胞制备的SlOO细胞裂解产物中的竞争结合实验的图表。CPM:每分钟计数。
[0019]图3A是一系列描述采用OSBPl靶向shRNA (shOSBPl)或非靶向shRNA(shNT)稳定转染的HCT-116p21+细胞中敲减/剂量移动实验的四柱状图。柱代表三次或四次个体实验的标准偏差。相比于 shNT 细胞 *Ρ=0.0002 (η=3) ;**Ρ=0.0006 (η=4) ;***Ρ=0.0003 (n=3)(双尾学生t-检验)。
[0020]图3B是描述shNT和shOSBPl细胞中OSBPl水平的定量的柱状图和一对对应的蛋白免疫印迹(Western blot)。七次个体实验的平均值土标准偏差。相比于shNT细胞****p ( 0.0001 (n=7)(双尾学生t-检验)。WB:基于肌动蛋白显示相等加载的蛋白免疫印迹。
[0021]图3C是描述表达lacZ-、OSBPl-或0RP4L-myc_his的HeLa细胞细胞裂解产物的一对蛋白免疫印迹。
[0022]图3D是描述HeLa细胞中lacZ、OSBPl或ORP4L过表达对l、2、4a和紫杉醇⑧生长抑制活性(48h)的影响的一组四幅图。
[0023]图3E是描述HCT-116细胞中OSBPliyc-his结合亲和力(Ki)和生长抑制(GI50)之间相关性的图表。
[0024]图3F是描述HCT-116细胞中0RP4L-myc_his结合亲和力(Ki)和生长抑制(GI50)之间相关性的图表。
[0025]图4A是描述HCT-116中25-羟基胆固醇共同给药对cephalostatinl (I)(左)或0SW-2(2)(右)生长抑制活性(48h)的影响的一对图表。
[0026]图4B是描述从生长介质移除脂蛋白使得CH0-7细胞对25-0HC而非1、2或4a敏化的情况的柱状图。两次个体实验的平均值土标准偏差。Bref A，布雷菲德菌素A。
[0027]图4C是人类OSBPl和0RP4L域的图示描述。指示OSBPl点突变M446W和V582M。
[0028]图4D是3H-25-羟基胆固醇对于OSBP、0RP4L以及两种OSBP点突变体:OSBP(M446W)和 0SBP(V582M)的结合系数(KD)的列表。其还列出了 cephalostatinl、OSff-1 和 schweinfurthin A 抑制 20ηΜ3Η_25_ 羟基胆固醇结合 OSBP、0RP4L、OSBP (M446W)和0SBP(V582M)的抑制结合系数(Ki)值。
[0029]图4E是描述在HeLa细胞中48h后野生型(WT)OSBPl或点突变体M446W(上列)和V582M(下列)过表达对l、2、4a和紫杉醇(I)生长抑制活性的影响的8图面板。相对GI50值是来自两次个体实验的平 均值。
[0030]图5是10张免疫荧光显微照片的面板，描述了 HCT-116细胞中ORP亲和素诱导的OSBPl移位，其采用各照片左下所示试剂处理并采用各照片左上所示抗原的荧光标记抗体着色。
[0031]图6A是描述采用所示浓度的所示试剂处理的HCT-116细胞中的OSBPl蛋白水平时间依赖性减小的柱状图及相关蛋白免疫印迹。**P〈0.01(n=3) ;***P〈0.001(n=3)；****Ρ〈0.0001 (η=3)，相对于经媒剂处理的细胞(双尾学生t-检验)。
[0032]图6B是描述在存在所示浓度的蛋白酶体抑制剂MG-132或乳胞素的情况下抑制OSBPl蛋白水平(在24h时间点)减少的柱状图。
[0033]图6C是描述schweinfurthin A(4a)和25-0HC在所不浓度下处理24h后未诱导OSBPl水平减小，但可阻断0SW-1所诱导的减小的柱状图。
[0034]图7是描述通过所示浓度的所示ORP亲和素抑制CHO-Kl细胞中鞘磷脂生物合成的图表。插入:阴性对照。所有数据为来自三次个体实验的平均值土标准偏差。*Ρ〈0.05 (η=3) ;**Ρ〈0.01 (η=3)。***Ρ〈0.001 (η=3)，****Ρ〈0.0001 (η=3)，相对于经媒剂处理细胞(双尾学生t-检验)。DPM:每分钟衰减。
[0035]发明详述
[0036]人类OSBPl是一种具有上述特定结构和功能特性的807-氨基酸蛋白。人类OSBPl的核苷酸和氨基酸序列是公开可获得的，例如，GenBank登记号分别为NM_002556和NP_002547。包括小鼠和大鼠的多种其它物种的相应核苷酸和氨基酸序列也是可获得的。[0037]已知OSBPl通过活化神经酰胺转运蛋白(CERT)涉及25-羟基胆固醇(25-0HC)介导的鞘磷脂合成增加。鞘磷脂是一种合成自神经酰胺和磷脂酰胆碱的细胞膜磷脂成分。一些凋亡诱导物，例如Fas配体通过活化引起鞘磷脂水解和神经酰胺生成的鞘磷脂酶(已知其引起凋亡)达到同样作用。结合25-0HC至OSBPl间接引起神经酰胺从ER至鞘磷脂合成酶I定位的高尔基体的转运增加。这导致鞘磷脂合成增加。据认为OSBPl和CERT —齐作用协调细胞中胆固醇和鞘磷脂水平，其对于维持适当的膜结构是重要的。重要地是，报道了OSBPl敲除老鼠的胚致死。这暗示虽然OSBPl对于动物发育是必需的，但OSBPl表达消除的细胞系可存活。
[0038]当发现质膜微囊丧失胆固醇或用25-0HC处理引起ERKl/2(胞外信号调节激酶I和2)的差别化磷酸化态时揭示了 OSBPl的第二活性。OSBPl被发现是介导此事件的固醇受体。一旦结合胆固醇，OSBPl与两种磷酸酯酶PP2A (—种丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶)和HePTP (一种酪氨酸磷酸酯酶)形成三元复合物，其接着通过去磷酸化灭活ERK1/2。相反地，加入25-羟基胆固醇(25-0HC)或损耗胆固醇解聚此复合物，导致ERK1/2过磷酸化。ERKI/2是MAPK/ERK信号通路的组分，该通路负责联系生长因子信号与细胞响应，包括细胞分裂。观察到OSBPl可控制ERK1/2活化是值得注意的，因为其显示OSBPl可使固醇结合与细胞内关键信号通路发生关联。
[0039]还已报道了 OSBPl通过活化JAK-STAT通路(响应于25-0HC和7_酮基胆固醇)可控制抑制蛋白-1的上调。然而，这些效应仅已在特定内皮细胞中观察到，其不能代表OSBPl在癌细胞中的作用。
[0040]人类0RP4，又称作0SBP2，因为源自0SBP2基因的选择性转录起始位点而以不同亚型表达。特别地，已在人类中表征了 916个氨基酸的长版本(0RP4L)以及461个氨基酸的短版本(0RP4S)。人类0RP4L的核苷酸和氨基酸序列是公开可获得的，例如，GenBank登记号分别为AF125185和AAD21618。人类0RP4S的核苷酸和氨基酸序列是公开可获得的，例如，GenBank 登记号分别为 NM_030758 和 NP_110385。
[0041]因为0SBP/0RP家族已涉及脂质转`运和代谢、囊泡运输和细胞信号传导，此蛋白家族含有用于治疗一系列症状的有吸引力的靶点，包括但非必要限于癌症、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病。
[0042]ORP 亲和素(ORPphilin)
[0043]OSBPl 和 0RP4L 是 cephalostatinl (I)、0SW-1 (2)、ritterazine B (3),schweinfurthin A(4a)和(-)-stellettin E(5)的祀点。这些天然产物，之前称作CRAM (Cephalostatin及相关抗增殖分子)，在本文中被称作ORP亲和素。之前已报道这些化合物发挥抗癌效应。化合物I通过非典型机制介导凋亡。化合物2对于成胶质细胞瘤和白血病细胞相比于非转变星形细胞和淋巴细胞的细胞毒性分别高30-150倍。化合物4a和5分别选择性抑制缺乏抑癌基因多发性神经纤维瘤I (NFl)和p21的肿瘤细胞的生长。已知抑制p21表达并丧失NFl对于一些癌症的进展是重要的。因此，选择性抑制具有这些遗传变异的癌细胞生长的小分子是癌症特异性治疗的有吸引力候选。
[0044]癌症
[0045]癌症是哺乳动物中熟知的疾病，特征为不受外部信号控制的异常细胞增殖，以及在许多而非所有实例中，入侵组织并转移至远处位点的能力。癌症通过其破坏正常细胞和组织功能引起显著的患病率和死亡率。多种癌症进一步表征为体细胞基因突变、分化丧失和/或任意多种肿瘤抑制基因的异常表达，肿瘤抑制基因包括例如P53、p21和多发性神经纤维瘤I (NFl)。p53和/或p21丧失表达导致细胞复制失去控制且经常是抵抗常规抗癌疗法的癌症的特性。
[0046]p21蛋白，也称作P21/WAF1蛋白以及细胞周期素依赖性激酶(⑶K)抑制剂1，还在本文中简单称作P21，结合并抑制细胞周期素-CDK2或-CDK4复合物的活性，并因而用作细胞周期进程在G1期的调节物。通常此基因的表达通过肿瘤抑制蛋白p53受到紧密控制，由此蛋白响应于多种压力刺激而介导P53依赖性细胞周期G1期抑制。
[0047]p21蛋白经常不在晚期肿瘤中表达，表明ORP亲和素若对缺乏p21的细胞是致命的，则可在晚期、难治性肿瘤患者中具有优异的治疗窗。因为极少小分子已被报道对于缺乏P21的同基因细胞系具有高度选择性，所以此特性表明ORP亲和素是具有不寻常细胞靶点和作用机制的化合物，这使得它们在癌症治疗中有用。
[0048]动脉粥样硬化
[0049]动脉粥样硬化源自导致胆固醇在动脉壁中蓄积的高血清胆固醇水平(高胆固醇血症)。表现为动脉粥样硬化的斑块抑制血流并促进血块形成，并可通过血栓形成或缺血性心肌梗死(心脏病发作)和/或中风最终引起死亡或严重残疾。
[0050]可使用OSBP治疗动脉粥样硬化。例如，众所周知哺乳动物氧固醇结合蛋白-1 (OSBPl)结合胆固醇的氧化衍生物并介导固醇和磷脂合成。此外，近来已显示哺乳动物氧固醇结合蛋白相关蛋白8(0RP8)用作ABCAl表达和巨噬细胞胆固醇流出的负调控因子，并因而可调节动脉粥样硬化的进展。Yan等人(2008) JBiol Chem283:332-40。
[0051]阿尔茨海默病
[0052]阿尔茨海默病是一种·经常导致痴呆和死亡的常见的、慢性神经退行性疾病，其特征为记忆进展性丧失和有时严重的行为异常，以及其它认知功能的损伤。它在心脏病、癌症和中风之后，排在工业化社会中主导致死的第四位。阿尔茨海默病的发病率高，预估在美国感染250万-400万患者并可能在世界范围内感染1700万-2500万患者。此外，预期患者数量随着人口老龄化而增加。阿尔茨海默病的一个特异性特征是在患者脑中存在大量不溶性沉积，称作淀粉样斑块。验尸已显示淀粉样斑块发现在几乎所有阿尔茨海默病患者的脑中且淀粉样斑块沉积的程度经常与痴呆程度相关。虽然一些观点认为淀粉样斑块是该疾病进程的晚期附加结果，但大多数人的观点是淀粉样斑块和/或淀粉样蛋白的溶性聚合物有可能更密切、以及可能与阿尔茨海默病有因果关系。因为无法治愈阿尔茨海默病，疾病管理通常涉及药物治疗以控制症状，联合各种非药物策略设计以缓解受折磨患者以及他或她的家庭和照顾者的痛苦。不幸的是，不是所有阿尔茨海默病患者都响应现行疗法。
[0053]已显示OSBPl调节淀粉样前体蛋白的处理和运输。Laitinen等人(2002) J LipidRes43:245-55ο这些结果暗示OSBPl可在联系胆固醇代谢与胞内淀粉样产生中发挥作用，并且，更重要的是，表明OSBPl可提供用于直接治疗包括阿尔茨海默病和动脉粥样硬化的人类疾病的供选择靶标。
[0054]Cephalostatinl和 Ritterazine B
[0055]Cephalostatin 是一组首先分离自海洋螺虫 Cephalodiscus gilchristi 的复杂的甾族吡嗪生物碱。它们代表高度有效抗PS细胞系(ED5tl为10_7-10_9μ g/mL)的细胞毒素并且为抗肿瘤剂。它们是极少出现的天然海洋产物，并且仅可以极少量被获取。例如，从166kgCephalodiscus gilchristi (5mm 长管状螺虫)中仅可分离 139mg cephalostatinl 以及总共 272mg 其它 cephalostatin。意图包括所有 cephalostatin(例如 cephalostatinl、cephalostatin2、 cephalostatin3、 cephalostatin4、 cephalostatin5、 cephalostatin6、cephalostatin7>25'-ep1-cephalostatin7、20-epi_cephalostatin7、 cephalostatin8、cephalostatin9、cephalostatin10、cephalostat in 11、cephalostat in 12、cephalostat in I 3、cephalostatinl4、cephalostatinl5、cephalostat in 16、cephalostatinl7、cephalostatinl8 和 cephalostatinl9)。
[0056]除了其不寻常的COMPARE性质以外，cephalostatinl (I)以及很可能所有ORP亲和素的细胞祀点和机制的另一独一无二之处在于cephalostatinl诱导凋亡而不形成凋亡体且不从线粒体释放细胞色素C，而大多数细胞毒性抗癌小分子发生以上两项事件的报道。用cephalostatinl处理J16Jurkat细胞系导致活化半胱天冬酶_4和半胱天冬酶_2以及从线粒体释放Smac (半胱天冬酶的第二线粒体衍生活化剂)。在小分子诱导的凋亡中很少观察到此特殊的事件顺序，暗示cephalostatinl的机制研究可能揭开新的凋亡信号机制。因此，cephalostatinl可被用于治疗已变为抵抗常规癌症疗法的肿瘤。
[0057]显不cephalostatinl还导致形成被称作PIDD体(PIDDosome)(包含蛋白PIDD、RAIDD和半胱天冬酶-2)的多蛋白复合体。组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A是唯一已知诱导形成PIDD体的其它小分子。还显示Cephalostatinl诱导ER应激反应。
[0058]ritterazine B和cephalostatinl的高度类似结构及它们几乎相同的COMPARE皮尔逊相关系数(p=0.93)暗示这些化合物很可能共享细胞靶点。
[0059]一些合成产生的cephalostatin类似物、制备该cephalostatin类似物的合成方法、包含该类似物的药物组合物以及使用该类似物作为药物应用中活性剂的方法，描述在美国专利第5，708，164号(Winterfeldt，E.等人)中；其全部内容在此通过参照并入，例如如本文所述的cephalostatin类似物及它们的制备。
`[0060]OSff-1
[0061]0SW-1 (2)相比cephalostatinl更为丰富，其已能进行一些体内研究。0SW-1抗NC1-60的平均GI5tl为0.78nM。OSff-1的体内研究受到限制，但皮下植入P388肿瘤细胞的裸鼠证明单次腹腔注射0.01mg/kg OSff-1治疗后寿命增加59%。OSff-1还显示对于恶性细胞在非恶性细胞之上的选择性。0SW-1在白血病细胞(HL-60，GI5tl=0.04nM)中相比正常淋巴细胞(GI5tl=L 73nM)更为有效40倍，且在恶性大脑肿瘤细胞中选择性增加至150倍(U87-MG，GI50=0.047nM相比于正常星形细胞GI5(i=7.13nM)。最后，采自耐受氟达拉滨(一种治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)及其它白血病的常用化疗药)的患者的CLL细胞对0SW-1高度敏感(GI5tl=0.3nM)。这些研究尽管有限，但证明0SW-1在体内抑制一些肿瘤生长时是很有选择性的。
[0062]OSff-1及其类似物用于治疗胰腺癌、白血病、结肠癌、胶质瘤及其它脑部肿瘤、以及卵巢癌的用途描述在美国专利申请公开第2005/0004044号(Huang，P.等人)中；其全部内容在此通过参照并入，例如用于制备0SW-1类似物。
[0063]Schweinfurthin
[0064]被称作schweinfurthin的天然产物家族当前包括四种分离自非洲植物Macaranga schweinfurthii Pax 的化合物。Schweinfurthin A(4a)(对 NC1-60 的平均GI50=360nM)呈现出类似于c印halostatinl (ρ=(λ 59，I)和其它ORP亲和素的细胞毒性性质。Schweinfurthin B和D在NCI60细胞系抗癌试验中也显示出显著活性,平均GI5tl值小于ΙμΜ。它们的生物学活性已吸引了兴趣，因为一些中枢神经系统(CNS)、肾脏和乳腺癌细胞系属于对这些化合物最为敏感的类型。活性谱检验显示不与任意当前所使用药剂相关，暗示这些化合物可能作用于之前不为所知的靶点或是通过一种新的机制产生作用。
[0065]类似于cephalostatinl,从天然来源仅可获得少量schweinfurthin A,其受限于体内研究。从天然来源分离更大样本的schweinfurthin的重复尝试尚未见成效。schweinfurthin A的合成尚未实现，虽然Wiemer团队已实现了 schweinfurthin B、E和F的全合成。另见，US专利申请公开第2008/0227852号，Wiemer，D.等人；其全部内容在此通过参照并入。一些相关二苯乙烯衍生物的制备参见美国专利第7，321，050号，Chen，G.等人；其全部内容在此通过参照并入。
[0066]在一项单独报道的鼠异种移植实验中，采用schweinfurthin A腹腔注射给药9.3mg/kg(Q2Dx4)导致“相比于无明显毒性的媒剂治疗对照的肿瘤体积减小”。Beutler等人(2006)The schweinfurthins:1ssues in development of a plant-derivedanticancer lead，In:Bogers RJC，Craker L.E., Lange, D.编。Medicinal and AromaticPlants ;Springer，Dordrecht，The Netherlands，p.301—9。
[0067](-)-Stellettin E
[0068](-)-Stellettin E(5)是一种也报道具有类似于cephalostatinl的细胞毒性模式的海洋天然产物(未报道P)。(_)-Stellettin E是一种仅少量被分离的光敏性化合物，使得难以详尽地进行基于细胞的研究以及体内实验。然而，(-)-Stellettin E(以及通过类比ORP亲和素)的细胞靶点甚至更为吸引人，通过发现该化合物对于经设计不表达P21-CDKN1A(在此称作“p21”)抑癌基因的HCT-116结肠癌细胞系的细胞毒性相比对于亲本 HCT-116 细胞系的细胞毒性高 117 倍(HCT-116p21+ 中 GI5(l=39nM，对比 HCT-116p21+/+ 中GI50=4.57 μΜ)。这些结 果暗示(-)-stellettin E (以及可能所有ORP亲和素)可致死缺乏P21的细胞。
[0069]根据本发明，发明人已确认0SBP1及其最接近的横向同源0RP4L是cephalostatinl (I) > OSff-1 (2) > ritterazine B(3)和 schweinfurthin A/B(4a/4b)的高亲和力受体。本文揭示这些化合物改变了 0SBP1细胞活性的若干方面，揭示了很大程度上神秘的0SBP/0RP蛋白的新活性。例如，I诱导0SBP1部分定位至质膜(图5E)，I和2引起0SBP1降解(图6)，以及所有研究的ORP亲和素诱导了鞘磷脂生物合成率的减小(图7)。
[0070]在本发明之前未充分理解0SBP1及其横向同源ORP的功能，部分因为缺乏可改变细胞中这些蛋白功能的试剂。通过给药25-0HC小分子干扰0SBP/0RP或改变细胞胆固醇水平可能影响0SBP/0RP以外的许多蛋白。进一步复杂化其用途的是25-0HC是细胞中胆固醇生物合成的强力抑制剂。因此，25-0HC对于0SBP1活性的影响可能是基于25-0HC结合至0SBP1或基于细胞胆固醇损耗。
[0071]确认0SBP1和0RP4L是ORP亲和素的靶点，为这些蛋白提供了新的高亲和力小分子探针。此外，ORP亲和素相比25-0HC对于0SBP1和0RP4L很可能更具特异性，因为本文揭示的结果显示25-0HC的两种细胞受体NPC-1或Insig均未涉及这些化合物的活性。所有ORP亲和素似乎与25-0HC竞争性结合OSBPl和0RP4L。对此观察结果最简单的解释是ORP亲和素从存在于所有0SBP/0RP蛋白C末端的高度保守的脂质结合域置换了 25-0HC。0sh4(—种与OSBPl同源的酵母蛋白)的晶体结构显示脂质结合域是包含部分β桶状的疏水性大空腔。Im等人(2005)Nature437:154-8。可以想到此空腔可以容纳ORP亲和素。
[0072]ORP亲和素在NC1-60细胞系板中相似的生长抑制模式提供了这些化合物可能具有相同作用机制的指示，ORP亲和素在相同的蛋白靶点的汇合确认了该指示。然而，令人惊奇的是本文揭示的发现显示ORP亲和素在靶向OSBPl和0RP4L中具有各不相同的活性。例如，cephalostatinl (I)和 OSff-1 (2)诱导细胞中 OSBPl 降解而 schweinfurthin A(4a)未诱导该降解。免疫荧光显微镜术显示不同的ORP亲和素以不同的方式影响OSBPl定位以及高尔基体的完整性。此外，I和2结合OSBPl和0RP4L仅具有轻微的亲和力改变。而Schweinfurthin A(4a)结合OSBPl的亲和力是结合0RP4L亲和力的约40倍高，考虑到0RP4L和OSBPl之间的高蛋白序列同源性,这个结果是令人惊奇。schweinfurthin A(4a)对于0RP4L相比对于OSBPl的低亲和力，可能是其细胞毒性比其它ORP亲和素小约100-300倍的原因，也可能是4a的0RP4L结合/细胞毒性相关性下降的原因。此schweinfurthin A对于OSBPl和0RP4L结合亲和力的大的差异暗示，发现选择性与0SBP/0RP超家族的个体成员或子集相互作用的小分子是可行的。
[0073]多线证据表明OSBPl和0RP4L介导ORP亲和素的抗增殖活性。证实OSBPl和0RP4L介导ORP亲和素的抗增殖活性更富挑战性，因为缺乏这些蛋白的酶活性以及其知之甚少的功能。首先，下列实施例显示OSBPl水平敲减使得细胞对于ORP亲和素敏化(图3A)，而OSBPl或0RP4L过表达则使得细胞对于这些化合物脱敏(图3D)。这些结果与ORP亲和素诱导OSBPl和0RP4L功能丧失(其导致所观察到的抗增殖效应)相一致。然而，这些结果不能排除OSBPl和0RP4L是“诱饵蛋白”(即阻止小分子到达引起抗增殖效应的实际功效靶点的高亲和力受体)的可能性。
[0074]获得了三条证据线共同强力支持OSBPl和0RP4L是ORP亲和素的功效靶点。首先，确定l_4a以及2的四种类似物的构效关系(SAR)呈现出其OSBPl亲和力与其生长抑制效力间的显著的正相关性(图3E)。除了 schweinf`urthin A(4a)以外，使用0RP4L的相同分析提供了类似的强相关(图3F)。此外，当在三个细胞系中评价时，不结合OSBPl或0RP4L的0SW-1 (2)类似物化合物9的细胞生长抑制相比2小700至2100倍。这些结果与OSBPl和0RP4L作为功效靶点相符。如果相反地OSBPl和0RP4L是诱饵蛋白的话，则将预期Ki和GI50间的负相关。
[0075]其次，通过采用亚致死剂量的已知为OSBPl和0RP4L的高亲和力配体25-0HC共孵育细胞显著抑制了 ORP亲和素的生长抑制活性。25-0HC与ORP亲和素在细胞中竞争结合OSBPl的独立证据，来自对25-0HC抑制0SW-1 (2)诱导的OSBPl降解的观察。如果OSBPl和0RP4L为诱饵蛋白，则通过25-0HC取代ORP亲和素将释放更多的化合物以与实际功效靶点相互作用。预期这将使细胞敏化于ORP亲和素，而非如观察到的使细胞脱敏。
[0076]最后，确认了 OSBPl的两种显性耐药等位基因。OSBPl (M446W)过表达使得细胞脱敏于1、2和4a，且0SBP1(V582M)过表达使得细胞脱敏于I。有趣的是，这些突变体未显示改变的1、2或4a结合。使过表达这些OSBPl突变体的细胞脱敏的一种可能解释是这些突变体影响蛋白-蛋白相互作用，以及OSBPl与其它蛋白的相互作用涉及ORP亲和素的抗增殖活性。甲状腺激素β受体的突变体提供了此种可能性的先例，因为此种蛋白的突变体通过干扰蛋白-蛋白相互作用抑制配体诱导的反式激活而非影响配体结合。Collingwood等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:248-53。OSBPl具有数种已知相互作用伴侣并已报道了作为固醇传感支架蛋白的作用，可以以配体结合依赖性方式形成多蛋白复合体。由此可以合理地推测:0RP亲和素的活性依赖于OSBPl与其它蛋白的相互作用，且改变OSBPl蛋白-蛋白相互作用的突变体可调节这些化合物的活性。
[0077]总而言之，前述结果强烈支持OSBPl和0RP4L为功效靶点。然而，看起来好奇的是ORP亲和素似乎引起OSBPl功能丧失，而OSBPlshRNA敲减本身未引起生长抑制。对此一种解释是，完全或接近完全切除OSBPl表达对于抑制细胞生长是必需的，且OSBPlshRNA敲减实验仅减小了 OSBPl水平约85%。相反，强化小分子效应物的能力的ORP亲和素可抑制细胞中全部的OSBPl功能。这对于cephalostatinl (I)和0SW-1 (2)来说格外如此，其具有干扰OSBPl功能的双重手段。即，两种化合物都是OSBPl的高亲和力配体HSnM Ki)，且两种化合物都诱导OSBPl降解。
[0078]第二种解释是，共切除OSBPl和0RP4L 二者对于表型模拟化合物处理的效果是必需的。在缺乏有效的0RP4L抗体的情况下未实现两种蛋白的同时敲减。
[0079]第三种解释是ORP亲和素扰乱了 OSBPl和0RP4L以外多个0SBP/0RP超家族成员的细胞功能，且这些其它0SBP/0RP的抑制造就了 ORP亲和素的抗增殖活性。若具有由多种0SBP/0RP多余进行的关键性细胞功能，则这种解释将更为可能，其将反映酵母中的情形。酵母拥有7种Osh蛋白，这些蛋白是0SBP/0RP的酵母同族体。报道了酵母在丧失七种Osh蛋白中的任意六种的情况下可存活，但丧失所有七种蛋白后无法存活。此外，0SBP/0RP在脂质结合域中呈现出显著的序列同源性且大多数已显示结合25-0HC。考虑到ORP亲和素与25-0HC竞争结合OSBPl和0RP4L，其它0SBP/0RP可能结合这些化合物。通过加入25-0HC实现的显著脱敏(图4A)，这可能是由于除OSBPl和0RP4L以外的其它ORP取代ORP亲和素。0SBP/0RP超家族范围的抑制或`者这些细胞存活必需蛋白子集的抑制，还可解释基因扰乱法为何未能揭示个体ORP在除了 0RP9S的诱导型表达(其被报道为具有细胞毒性)之外的细胞增殖中的作用。
[0080]因为ORP亲和素选择性抑制p21缺乏肿瘤细胞的生长(图2A)，且4a选择性针对缺乏NFl的肿瘤细胞，本文揭示的结果明显提示了这些肿瘤抑制蛋白的缺失使得细胞对于OSBPl和0RP4L的干扰高度敏感。因此，本文揭示的发现表明OSBPl和0RP4L是用NFl和P21实现合成致死的新靶点，该合成致死可导致肿瘤选择性癌症治疗。
[0081]已报道了在转移性乳腺癌肿瘤中0RP4L mRNA水平相比在局部肿瘤中增加，预示0RP4L在转移阶梯反应早期步骤中的可能作用。Fournier等人(1999) CancerRes.59:3748-53。因此，ORP亲和素将是进一步探索0RP4L在癌症转移中作用的有用试剂。
[0082]发现cephalostatinl (I)和0SW-1 (2)介导OSBPl水平的显著降低将有用于研究它们的抗肿瘤活性，因为此效应可用于确定化合物是否已到达特定组织。此外，化合物I和2可被用于在动物疾病模型中降低OSBPl蛋白水平。
[0083]本发明的各方面涉及0SW-1类似物、这些类似物形成的抗体缀合物、包含该类似物或缀合物的药物组合物，以及该类似物、缀合物和药物组合物用于治疗氧固醇结合蛋白(OSBPl)相关的疾病或病状(特别包括癌症)的用途。[0084]本发明的一方面是式(I)化合物或其药学上可接受的盐:
[0085]
【权利要求】
1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐:

2.权利要求1的化合物，其中R4是氢。
3.权利要求1或2的化合物，其中R5是乙酰基。
4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中R6是对甲氧基苯甲酰基。
5.权利要求1-3中任一项的化合物，其中R6是3-苯基丙酰基。
6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中Z是O。
7.权利要求6的化合物，其中R选自烷基和4-硝基苯基。
8.权利要求6或7的化合物，其中η是O。
9.权利要求1-5中任一项的化合物，其中Z是NH。
10.权利要求9的化合物，其中R是氨基。
11.权利要求10的化合物，其中该氨基是alloc-或FmocW-取代的氨基。
12.权利要求10或11的化合物，其中η是6。
13.权利要求9的化合物，其中R是对氨基烷基芳基。
14.权利要求13的化合物，其中该对氨基烷基芳基是alloc-或Fmoc-N'-取代的对氨基甲基苯基。
15.权利要求13或14的化合物，其中η是I。
16.权利要求9的化合物，其中η是I;且R是苯基。
17.权利要求1-5中任一项的化合物，其中Z不存在。
18.权利要求17的化合物，其中R是氨基。
19.权利要求18的化合物，其中该氨基是alloc-或Fmoc-取代的氨基。
20.权利要求18或19的化合物，其中η是2。
21.权利要求17的化合物，其中R是1-咪唑基。
22.权利要求21的化合物，其中η是O。··
23.权利要求1-5中任一项的化合物，其中R1，R2和R3中至少一个是叔丁基二甲基硅基。
24.权利要求23的化合物，其中R1是叔丁基二甲基硅基。
25.权利要求23的化合物，其中R1和R2二者均是叔丁基二甲基硅基。
26.选自下列的化合物:
27.药物组合物，其包含权利要求1-26中任一项的化合物；以及药学上可接受的载体。
28.杀死哺乳动物细胞的方法，其包括使哺乳动物细胞与有效量的权利要求1-26中任一项的化合物接触。
29.权利要求28的方法，其中该细胞是癌细胞。
30.权利要求29的方法，其中该癌细胞为p21-缺乏。
31.治疗氧固醇结合蛋白(OSBP)相关的疾病或病状的方法，其包括给药至有需要的受试者有效量的权利要求1-26中任一项的化合物，从而增加与OSBP相关的疾病或病状有关的OSBP表达细胞的凋亡。
32.权利要求31的方法，其中该OSBP相关的疾病或病状是癌症；且该OSBP表达细胞是癌细胞。
33.权利要求32的方法，其中该癌细胞为p21-缺乏。
34.式(II)化合物或其药学上可接受的盐:
35.权利要求34的化合物，其中X是O。
36.权利要求35的化合物，其中各R1，R2，R3和R4选自氢和R20。
37.权利要求34的化合物，其中X是N0R2°。
38.权利要求37的化合物，其中各R1，R2，R3和R4是氢。
39.权利要求34-38中任一项的化合物，其中R2°是
40.权利要求34-38中任一项的化合物，其中R2°是
41.权利要求34-38中任一项的化合物，其中R2°是
42.包含共价结合至权利要求1-26中任一项的化合物的单克隆抗体的缀合物。
43.包含共价结合至权利要求34-41中任一项的化合物的单克隆抗体的缀合物。
44.权利要求42或43的缀合物，其中该单克隆抗体和该化合物通过半胱氨酸巯基-马来酰亚胺迈克尔加成产物、缬氨酸-瓜氨酸对氨基苄基连接基或缬氨酸-瓜氨酸对氨基苄基氨基甲酸酯连接基共价结合。
45.权利要求42-44中任一项的缀合物，其中该单克隆抗体特异性结合至在癌细胞上表达的抗原。
46.权利要求45的缀合物，其中该癌细胞为ρ21-缺乏。
47.药物组合物，其包含权利要求42-46中任一项的缀合物；以及药学上可接受的载体。
48.杀死癌细胞的方法,其包括使癌细胞与有效量的权利要求42-46中任一项的缀合物接触。
49.权利要求48的方法，其中该癌细胞为ρ21-缺乏。
50.治疗癌症的方法，其包括给药至有需要的受试者有效量的权利要求42-46中任一项的缀合物。
51.权利要求50的方法，其中癌细胞为ρ21-缺乏。
【文档编号】C07C13/66GK103857689SQ201280035918
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年5月18日 优先权日:2011年5月19日
【发明者】M.D.沙伊尔 申请人:哈佛大学的校长及成员们