结合整合素αVβ8的抗体的制作方法

结合整合素αVβ8的抗体的制作方法
【专利摘要】本文提供了对αvβ8的β8亚基具有高亲和力的抗体。
【专利说明】结合整合素Ct νβ 8的抗体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年8月17日递交的美国临时专利申请第61/524，708号和2012年5月11日递交的美国临时专利申请第61/646，111号的优先权，其公开内容通过引用完整并入。
[0003]关于以ASCII文本文件递交的“序列表”、表或计算机程序列表附录
[0004]文件81906-848664_ST25.TXT中写入的序列表于2012年8月17日创建，71，601字节，计算机格式为IBM-PC，MS-Windows操作系统，其在此通过引用并入本文。
[0005]对于在联邦政府资助的研究和开发下完成的发明的权益声明
[0006]在国立卫生研究院授予的资助号HL63993、NS-44155、U01A1075443下，通过政府的支持完成本发明。政府具有本发明的某些权利。
[0007]发明背景
[0008]多功能细胞因子转化生长因子_β (TGF-β)影响无脊椎动物和脊椎动物物种的发育和成年生活期间的免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞和间质细胞。在哺乳动物中，这些功能通过三种广泛表达的同种型，即TGF-β 1、2和3来介导。所有三种同种型与相同的细胞表面受体(TGFBR2和ALK5)相互作用，并通过相同的细胞内信号转导通路而进行信号转导，所述通路包括规范的(即SMAD)或非规范的(即MAPK、JUN、PI3K、PP2A、Rho、PAR6)信号转导效应器。在规范的TGF-β信号转导通路中，借此细胞质SMAD-2/3的磷酸化、与SMAD-4的复合物形成、SMAD-2/3/4复合物的核转运以及与位于纤维发生反应所涉及的许多基因的启动子区域的SMAD反应元件的结合，从TGF-β受体传播`信号转导。尽管TGF-β同种型具有相似的信号转导伴侣，但每一同种型提供独特的生物学功能。TGF-β同种型具有与TGF-β受体结合亲和力、激活机制、信号转导强度或持续时间，或者空间和/或时间分布的差异。
[0009]TGF-β同种型、受体和信号转导介体以及靶向所有TGF-β同种型的功能阻断剂的敲除和条件缺失模型已经揭露了 T细胞、心脏、肺、血管和腭部发育中TGF-β的重要作用。例如，TGF-β I缺陷型小鼠由于卵黄囊血管形成而在子宫内死亡，或者存活至成年，但具有严重的多器官自身免疫。TGF-β信号转导介体Smad2的基因缺失显示其在早期模式形成(patterning)和中胚层形成中至关重要。缺少Smad3的小鼠是有生命力并可育的，但表现出肢体畸形、免疫调节异常、结肠炎、结肠癌和齿槽肥大。在成年组织中，TGF-β通路参与免疫细胞、间质细胞和上皮细胞相互作用，以保持响应环境胁迫的内稳态。
[0010]由TGF-β介导的内稳通路在对长期重复损伤的反应中受到扰乱。对于损伤，TGF-β为响应损伤、延迟上皮创伤康复的主要的促纤维化细胞因子。TGF-β通过诱导纤维原细胞补充、纤维原细胞收缩和细胞外基质沉积，抑制上皮增殖和迁移、促进细胞死亡并扩张间质室。腺病毒重组体TGF-β I向啮齿动物肺部的气管内转移显著增加了气道周围和肺间质中的纤维原细胞积聚以及I型和III型胶原的表达。中和抗-TGF-β抗体能阻断博来霉素或辐射诱导的肺纤维化。
[0011]TGF-β的增加的活性可能在纤维化肺病、肾小球硬化症和心血管再狭窄中起作用，主要通过TGF-β I介导。人的TGF-β I功能是复杂的，如通过涉及TGF-β I自身或其信号转导效应器的遗传病症所示。增加TGF-β通路活性的突变导致骨代谢(即，Camurat1-Engelmann疾病)、结缔组织(即，Marfan综合征)以及主动脉瘤(即Loeys-Dietz综合征)的缺陷。导致TGF-β通路活性降低的突变与癌症相关。然而，TGF-β作为癌症的肿瘤抑制剂的作用并非明确的，因为TGF-β也能促进肿瘤生长和转移。
[0012]尽管TGF-β存在多种重要功能，但单一剂量或短期给予泛-TGF-β中和抗体能被很好地耐受。以抑制器官纤维化或癌细胞生长和转移的剂量在啮齿动物中未观察到副作用。该治疗还有效抑制实验性纤维化。由于这些有希望的结果，对于转移性肾细胞癌、黑素瘤、局灶性节段性肾小球硬化和特发性肺纤维化，正在进行使用中和泛-TGF-β抗体的单剂量 Ι/ΙΙ 期临床试验(Genzyme Corporation,网站为 genzymeclinicalresearch.com)。
[0013]发明概述
[0014]本文提供了可以用于诊断和治疗与由ανβ 8介导的与增加的TGF-β活性相关的病症的抗体组合物。在一些实施方案中，提供了特异性结合ανβ8的分离的抗体，其中所述分离的抗体抑制有活性的成熟TGF β肽的释放，但未显著抑制潜态TGF β与表达α V β 8的细胞上的ανβ 8的粘附，并且其中所述分离的抗体结合固定的表达ανβ8的细胞(例如，福尔马林固定的)。具有这些活性的抗体被称为11Ε8，该术语包括11Ε8抗体的亲和力成熟的、人源化的、嵌合的和有标记的形式，以及其ανβ8_结合片段。在一些实施方案中，所述分离的抗体特异性结合至SEQ ID NO:1内的β 8上的表位。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 10所示的重链CDR(SEQ ID NO:48、49和50)。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 11所示的轻链CDR(SEQ ID NO: 51、52和53)。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 10所示的重链⑶R和SEQ ID NO: 11所示的轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 10所示的重链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 11所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 10所示的重链可变区和SEQ ID NO: 11所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含llE8Mut28的重链⑶R和轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含llE8Mut28的重链重链序列和轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述抗体包含llE8Mut94的重链⑶R和轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含llE8Mut9`4的重链可变区序列和轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述抗体包含llE8Mut39的重链⑶R和轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含llE8Mut39的重链可变区序列和轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述分离的抗体结合至具有高亲和力的β 8表位，例如，相比抗-α V β 8抗体37Ε1具有更高的亲和力、具有纳摩尔或皮摩尔范围的亲和力，或具有10_7、10_8、10_9或更低的Kd。在一些实施方案中，所述分离的抗体小于50kD、小于25kD,或为单链抗体(例如，scFv)。在一些实施方案中，所述抗-α νβ8抗体37E1或37E1B5与11Ε8抗体竞争结合至表达α νβ8的细胞上的ανβ8。还提供了包含本文所述的分离的抗体和药学赋形剂的药物组合物。
[0015]还提供了特异性结合α νβ 8的人源化的抗体，其中所述分离的抗体抑制有活性的成熟TGF β肽的释放，但未显著抑制潜态TGF β与表达α V β 8的细胞上的α ν β 8的粘附。具有该活性的抗体被称为h37ElB5 (人源化的37E1B5或Hu37ElB5)，该术语指标记的h37ElB5及其ανβ8-结合片段。在一些实施方案中，所述人源化的抗体特异性结合至SEQID Ν0:1内的β 8上的表位。在一些实施方案中，所述人源化的抗体结合至具有高亲和力的β 8表位，例如，相比抗-α νβ 8抗体37Ε1具有更高的亲和力、具有纳摩尔或皮摩尔范围的亲和力，或具有10_7、10_8、10_9或更低的Kd。在一些实施方案中，所述分离的抗体小于50kD、小于25kD，或为单链抗体(例如，scFv)。在一些实施方案中，所述人源化的抗体包含SEQID NO:8的重链可变区，和SEQ ID NO:9的轻链可变区。在一些实施方案中，所述人源化的抗体具有SEQ ID NO:8的重链可变区和SEQ ID NO:9的轻链可变区。还提供了包含本文所述的人源化的抗体和药学赋形剂的药物组合物。
[0016]还提供了可以用于诊断与由ανβ 8介导的与增加的TGF-β活性相关的病症的抗体组合物。在一些实施方案中，提供了特异性结合ανβ 8的分离的抗体，其中所述抗体未抑制有活性的成熟TGF β肽的释放，或潜态TGF β与表达α V β 8的细胞上的α ν β 8的粘附，其中所述分离的抗体结合固定的(例如，福尔马林固定的)表达ανβ8的细胞或组织，并且其中所述抗体能辨别所述细胞或组织的ανβ8表达水平(例如，所述抗体可以用于比较不同细胞上的α V β 8表达水平)。具有这些活性的抗体被称为6Β9和4F1，其包括6Β9和4F1抗体的亲和力成熟的、人源化的、嵌合的和标记的形式，以及其α νβ 8-结合片段。在一些实施方案中，所述分离的抗体特异性结合至SEQ ID NO: 14内的β 8上的表位。在一些实施方案中，所述表位包括人β8的S95，其全长序列显示在SEQ ID Ν0:17中。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 18所示的重链CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 19所示的轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 18所示的重链⑶R和SEQ ID NO: 19所示的轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 18所示的重链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 19所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 18所示的重链可变区和SEQ ID NO: 19所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含6B9Mutl的重链⑶R和轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含6B9Mutl的重链可变区序列和轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID N0:20所示的重链CDR。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 21所示的轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 20所示的重链⑶R和SEQ ID NO: 21所示的轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 20所示的重链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID N0:21所示的轻链可变区。在一些实施方案 中，所述抗体包含SEQ ID NO:20所示的重链可变区和SEQ ID N0:21所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述分离的抗体结合至具有高亲和力的β8表位，例如，具有纳摩尔或皮摩尔范围的亲和力，或具有10_7、10_8、10_9或更低的Kd。在一些实施方案中，所述分离的抗体小于50kD、小于25kD，或为单链抗体(例如，scFv)。在一些实施方案中，所述抗-α νβ8抗体6B9或4F1不与37Ε1、37Ε1Β5或11Ε8抗体竞争结合，以结合至表达ανβ8的细胞上的ανβ8。还提供了包含本文所述分离的抗体和药学赋形剂的药物组合物。
[0017]本文提供了减少个体中TGF0信号转导(减少TGF0活性、减少成熟有活性的TGF β的释放)的方法，包括将包含11Ε8或h37ElB5抗体的药物组合物(如上所述)给予所述个体，从而减少个体中TGFii信号转导。在一些实施方案中，所述个体患有选自以下的至少一种病况(疾病、病症):炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、关节炎、肝纤维化、肺纤维化病症、炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病、神经炎症、肾病、腺癌、鳞状癌、胶质癌和乳腺癌；并且减少TGFii信号转导引起病况的改善。
[0018]还提供了诊断个体中ανβ 8相关病症的方法，包括使来自所述个体的细胞与如上所述的11E8、6B9或4F1抗体接触,并检测所述分离的抗体与所述细胞的结合,其中所述分离的抗体与所述细胞的结合表明该个体患有ανβ8相关病症。在一些实施方案中，所述ανβ8相关病症选自:炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、关节炎、肝纤维化、肺纤维化病症、炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病、神经炎症、肾病、腺癌、鳞状癌、胶质癌和乳腺癌。在一些实施方案(例如，体外诊断技术)中，所述细胞是固定的。在一些实施方案中，所述ανβ8相关病症为IBD，并且所述细胞获自所述个体的肠(例如，结肠或肠道)。在一些实施方案中，所述α V β 8相关病症为关节炎，并且所述细胞为来自个体的软骨组织或软骨细胞。在一些实施方案中，所述ανβ 8相关病症为肝纤维化，并且所述细胞为来自个体的肝星状细胞。在一些实施方案中，所述ανβ 8相关病症为哮喘、COPD或肺纤维化，并且所述细胞获自个体的气管。在一些实施方案中，所述方法还包括将药物组合物(包含11Ε8、37Ε1Β5或h37ElB5抗体)给予个体。
[0019]还提供了测定测试细胞的ανβ 8相对表达水平的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使测试细胞与6Β9抗体接触、检测结合至测试细胞的6Β9抗体，以及比较6Β9抗体结合水平与对照细胞6Β9抗体结合水平，从而确定测试细胞的ανβ8相对表达水平。在一些实施方案中，所述方法包括使测试细胞与4F1抗体接触、检测结合至测试细胞的4F1抗体，以及比较4F1抗体结合水平与对照细胞4F1抗体结合水平，从而确定测试细胞的α V β 8相对表达水平。在一些实施方案中，所述测试细胞是固定的(例如，福尔马林固定的)。在一些实施方案中，所述对照细胞是固定的。在一些实施方案中，所述对照细胞为野生型、非癌症细胞。在一些实施方案中，所述对照细胞为健康细胞(来自未患有ανβ8相关病症的个体)。在一些实施方案中，所述表达水平指示细胞中的基因组β 8拷贝数，例如，以致相比非癌症对照更高的相对表达水平表明测试细胞具有增加的基因组β8拷贝数。在一些实施方案中，所述测试细胞在来自个体的生物样品(例如，体外液体或组织样品)中。在一些实施方案中，所述测试细胞原位位于个体中。在一些实施方案中，当测试细胞中的ανβ8表达高于正常时，所述方法还包括诊断患有ανβ8相关病症(如本文所述)的个体。本领域技术人员应当理解对照细胞可以来自健康个体(例如，代表正常表达水平)，或可以为阳性对照，例如，已知具有增加的α V β 8表达，或来自患有α V β 8相关病症的个体。
[0020]另外还提供了 特异 性结合至ανβ 8的分离的抗体，其中所述抗体未抑制有活性的成熟TGFP肽的释放，或潜态TGFP与表达ανβ8的细胞上的ανβ8的粘附。在一些实施方案中，所述分离的抗体特异性结合至SEQ IDNOil内的β 8上的表位。具有这些活性的抗体被称为14Ε5，该术语包括14Ε5抗体的亲和力成熟的、人源化的、嵌合的和标记的形式，以及其ανβ 8-结合片段。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID Ν0:12所示的重链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID Ν0:13所示的轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 12所示的重链⑶R和SEQID NO: 13所示的轻链⑶R。在一些实施方案中，所述抗体包含选自以下的亲和力成熟的抗体的重链CDR和轻链CDR:14E5Mutll、14E5Mut42、14E5Mut54、14E5Mut68、14E5Mut65、14E5Mut83 和 14E5Mut95。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 12所示的重链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 13所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO: 12所示的重链可变区和SEQ ID NO: 13所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗体包含选自以下的亲和力成熟的抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列:14E5Mutll、14E5Mut42、14E5Mut54、14E5Mut68、14E5Mut65、14E5Mut83 和 14E5Mut95。在一些实施方案中，所述分离的抗体结合至具有高亲和力的β 8表位，例如，相比抗-α V β 8抗体37Ε1具有更高亲和力、具有纳摩尔或皮摩尔范围的亲和力，或具有10_7、10_8、10_9或更低的Kd。在一些实施方案中，所述分离的抗体小于50kD、小于25kD，或为单链抗体(例如，scFv)。在一些实施方案中，所述抗-α νβ8抗体37E1或37E1B5与14Ε5抗体竞争结合至表达α νβ8的细胞上的α V β 8。
[0021]提供了检测表达α νβ 8的细胞的存在的方法，包括使细胞与14Ε5抗体接触，以及测定抗体是否结合至所述细胞，其中抗体结合至所述细胞表明表达α νβ8的细胞的存在。在一些实施方案中，所述接触是体内的。在一些实施方案中，所述接触是体外的。
[0022]此类方法可以用于诊断个体的ανβ 8相关病症的方法，包括使来自个体的细胞与如上所述的14Ε5抗体接触，以及检测分离的抗体与所述细胞的结合，其中分离的抗体与所述细胞的结合表明该个体患有α V β 8相关病症。在一些实施方案中，所述α V β 8相关病症选自:炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、关节炎、肝纤维化、肺纤维化病症、炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病、神经炎症、肾病、腺癌、鳞状癌、胶质癌和乳腺癌。在一些实施方案中，所述ανβ8相关病症为IBD，并且所述细胞获自个体的肠(例如，结肠或肠道)。在一些实施方案中，所述ανβ 8相关病症为关节炎，并且所述细胞为来自个体的软骨组织或软骨细胞。在一些实施方案中，所述ανβ 8相关病症为肝纤维化，并且所述细胞为来自个体的肝星状细胞。在一些实施方案中，所述ανβ 8相关病症为哮喘、COPD或肺纤维化，并且所述细胞获自个体的气道。在一些实施方案中，所述方法还包括将药物组合物(包含11Ε8、37Ε1Β5或h37ElB5抗体)给予所述个体。
【专利附图】

【附图说明】
[0023]图1显示了 37E1、37E1B5和人源化的37E1B5抗体的重链和轻链可变区的比对。指示了 CDR和框架序列。
[0024]图2显示了人β8在ITGB8转基因小鼠的肝星`状细胞上的表达。上图显示了同种型对照，而下图显示了利用14Ε5抗体测得的β8表达。
[0025]图3显示了肺肺泡巨噬细胞、树状细胞、纵膈淋巴结细胞、T和B细胞上β 8的表达，并且提供过了其他器官中的染色数据的概要。Α)肺巨噬细胞:自发荧光+、⑶llChi+、F480+、CD8+、CDlIB-、Ly6G_、CD103-、Ly6C+/-、TCR- ；B)肺树状细胞:自发荧光 _、CDllCintermed+、F480 (mostly negative)、CD8+、CDlIB+、CD103-/+、Ly6C+/-、TCR-、Ly6G_、GR-1-C)C)肺 T 细胞-TCRa β +、CD3+、B220-、I1-类、CD19-、非自发荧光；D)肺 B 细胞-TCRa β-、CD3-、Β220+、11+类、CD19+、非自发荧光；E)MLN树状细胞:自发荧光_、CDllC intermed+、CDlIB+、II 类 MHC h1、F480-、Ly6C+/-、Ly6G_(可能为 CD8+、CD103+/-、GR-1+/-) ；F)MLN B 细胞-TCR α β-、CD3-、B220+、11+类、CD19+、非自发荧光；G)多个器官中的染色数据的概要表。利用杂种瘤克隆14E5进行染色。
[0026]图4显示了 37E1B5给药对BACtg小鼠中的小肠大小(炎症)的影响。
[0027]图5显示了对照(未处理的)和37E1B5处理的BACtg小鼠的小肠切片的图。
[0028]图6表明抗体4F1和6B9特异性结合至并着染福尔马林固定的表达β 8的293细胞(293Β8)，而非未转染的293细胞(293WT)。该抗体还着染福尔马林固定的、来自整合素β 8转基因小鼠(ITGB8BAC)的脑切片。
[0029]图7:杂种瘤克隆4F1特异性着染福尔马林固定的、石蜡包埋的TGB8BAC转基因(Tg)小鼠的脑和肺。将ITGB8BAC Tg或野生型(WT)小鼠的脑或肺在10%缓冲的福尔马林中固定过夜，并进行组织处理、石蜡包埋和切片。利用与上述相同的抗原热修复进行免疫染色，并利用商品化试剂盒(Dako)检测抗体。
[0030]图8:杂种瘤克隆6Β9可以检测拷贝数变化，如通过福尔马林固定的、石蜡包埋的ITGB8BAC转基因(Tg)小鼠脑的免疫染色所示。显示了相比WT(下图)的Tg小鼠的3个系(B、C和D)。拷贝数如下:I个拷贝(D—-系BAC/WT)、2个拷贝(B和C—-系BAC/WT ；D—-系 BAC/BAC)或 4 个拷贝(B 和 C—-系 BAC/BAC)。
[0031]图9:源自克隆4F1的可变域的重组单克隆兔IgG可以检测拷贝数变化，如通过福尔马林固定的、石蜡包埋的ITGB8BAC转基因(Tg)小鼠肺的免疫染色所示。显示了相比WT(下图)的Tg小鼠的3个系(B、C和D)。拷贝数如下:1个拷贝(D—-系BAC/WT)、2个拷贝(B 和 C—-系 BAC/WT ；D—-系 BAC/BAC)或 4 个拷贝(B 和 C—-系 BAC/BAC)。
[0032]图10:通过福尔马林固定的、石蜡包埋的人纤维化肺的免疫染色，源自克隆4F1的可变域的重组单克隆兔IgG可以检测ανβ8表达。箭头所示为梭形细胞的染色，代表了包埋在稠密的纤维结缔组织中的纤维原细胞。
[0033]图1lA-B:多种发现的抗体和随后的亲和力成熟的变体(名称为“Mut”)的重链可变区序列。粗体和下划线氨基酸指与原始(“被”)抗体重链可变区序列的变化。
[0034]图12A-B:多种发现的抗体和随后的亲和力成熟的变体(称为“Mut”)的轻链可变区序列。。粗体和下划线氨基酸指与原始(“wt”)抗体轻链可变区序列的变化。
[0035]发明的详细描述
[0036]1.前言
[0037]转化生长因子β (TGFii)初始表征为能将转化的表型引入非瘤细胞的癌基因。基于类似氨基酸结构域的存在，已经表征了多种TGFii家族成员。
[0038]一些TGF-β同种型在哺乳动物中普遍表达(TGF-β 1-3)，但通过与前肽——TGF-β的潜态相关结构域(LAP)非共价相互作用保持为失活形式。对于信号转导的TGFβ，其必须通过称为TGFii激活的过程从其失活复合物中释放。潜态TGF复合物包含3种组分:有活性的(成熟的)TGFii 二聚体(dimmer)、LAP (潜态相关的肽)和LTBP (潜态TGF β结合蛋白)。LAP是通过二硫键连接的二聚体，其代表了 TGFii前体蛋白的N末端。成熟TGF3蛋白代表了前体的C末端(约25kD)。TGFii和LAP之间的键在高尔基体内被解蛋白切割，但TGF-β前肽通过非共价相互作用保持与TGFii的结合。TGF^和LAP的复合物称为小潜态复合物(SLC)。LAP和TGFii的关联赋予潜态。LAP-TGFP结合是可逆的，并且分离的纯化组分能重组以形成失活的SLC。SLC和更大的复合物在本文均被称为潜态TGF β，因为他们均为失活的。
[0039]一般来说，整合素为粘附分子并且介导细胞与细胞外基质蛋白的连接。整合素 ανβ8 结合至 TGF- β 的 LAP，并介导 TGF- β I 和 3 的活化(Mu etal.(2002) J.CellBiol.159:493)。整合素 α ν β 8-介导的TGF-β活化对TGF-β的体内活化(即，成熟TGF-β多肽的释放)是必需的，因此，功能的守门者。整合素ανβ8表达于正常上皮细胞(例如，气道上皮细胞)、间质细胞和神经元组织。本文所示的结果表明TGF-β的整合素α V β 8-介导的激活可以引起COPD、肺纤维化、关节炎、炎症性肠病、肝和肾纤维化、炎症性脑自身免疫病和脱髓鞘疾病(例如，MS、横贯性脊髓炎、德维克病、格林-巴利综合征)、神经炎症、肾病以及癌症生长和转移。
[0040]I1.定义
[0041]除非另有定义，本文所用的技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的具有相同的含义。参见，例如，Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULARBIOLOGY, Elsevier(4th ed.2007);Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING, A LABORATORYMANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY1989)。类似或等同于本文描述的那些的任何方法、装置和物质都可以用于实施本发明。提供以下定义以帮助理解某些本文常用的术语，并且不打算限制本公开的范围。
[0042]本文所用的术语“抗- α νβ 8抗体”、“ ανβ8特异性抗体”、“ ανβ8抗体”和“抗-ανβ8”为同义的，指特异性结合至ανβ8的抗体。类似地，抗_β8抗体(及同类项)指特异性结合至β 8的抗体。本文所述的抗-α V β 8抗体和抗-β 8抗体结合至表达ανβ 8的细胞上表达的蛋白。
[0043]固定的细胞是经处理以抑制细胞代谢并保存细胞用于表征的细胞。固定在本领域在常规实施，例如，以通过组织学观察细胞学特征，或通过免疫染色和/或流式细胞术观察细胞表面标志物表达。本领域技术人员应当理解细胞可以以多种已知的固定溶液中的任何一种固定，包括，例如，福尔马林、甲醛、多聚甲醛、甲醇、丙酮等。组织可以以类似的形式固定。
[0044]α V β 8-相关病症为以存在表达α ν β 8的细胞为特征的病况，所述细胞相对于正常、未病对照，表达增加水平的ανβ 8，或增加数目的表达ανβ8的细胞。TGFF相关病症(以高于正常TGFβ活性为特征的病症)包括ανβ8_相关病症，因为ανβ8在某些情形下参与TGF0激活，如本文所述。
`[0045]“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物以及它们的补体。术语"多核苷酸"指核苷酸线性序列。术语“核苷酸”通常指多核苷酸的单一单元，gp，单体。核苷酸可以为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰的形式。本文涉及的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA (包括siRNA)，和具有混合的单链和双链DNA和RNA的杂交分子。
[0046]词语〃互补〃或〃互补性〃指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T与序列T-C-A互补。互补可以为部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或完全的，其中所有核酸都根据碱基配对匹配。
[0047]本领域技术人员已知多种利用核酸杂交技术测量特定DNA和RNA的方法(参见，Sambrook, Id.)。一些方法包括电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但也可以在无电泳分离的情形下进行DNA和RNA的测量(例如，定量PCR、斑点杂交或阵列)。
[0048]词语〃蛋白〃、〃肽〃和〃多肽〃可交换地使用，表示氨基酸聚合物或一组两个或更多个相互作用的或结合的氨基酸聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物的人工化学模拟物，其含有修饰的残基和非天然存在的氨基酸聚合物。[0049]术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的那些，以及后来修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、Y -羧基谷氨酸酯和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构的化合物，例如与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但与天然存在的氨基酸功能类似的化学化合物。
[0050]本文可以通过IUPAC-1UB生化命名委员会推荐的、通常已知的、氨基酸的三字母符或单字母符来提及氨基酸。同样地，可以通过核苷酸的通常接受的单字母代码来提及核苷酸。
[0051 ] “保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码与基本相同或相关的例如天然连续的序列相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸未编码氨基酸序列。由于基因密码的简并性，多数的蛋白由大量的功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个被密码子指定为丙氨酸的位置，该密码子都能改变为另一所述相应的密码子，而不改变编码的多肽。这类核酸变化为“沉默变化”，其为一类保守修饰的变化。本文的编码多肽的每个核酸序列还描述了该核酸的沉默变化。本领域技术人员应认识到在某些情形下，核酸中的每一密码子(除了 AUG，其通常为蛋氨酸的唯一密码子，以及TGG，其通常为色氨酸的唯一密码子)都能被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的沉默变化隐含在描述的关于表达广物但不关于实际探针序列的序列中。
[0052]对于氨基酸序列，本领域技术人员应认识到改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸的、对核酸、肽、多肽或者蛋白序列进行的个别取代、缺失或添加为“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能类似的氨基酸的保守 取代表为本领域熟知。这类保守修饰的变体增添至且不排斥本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。以下氨基酸通常为彼此的保守取代:1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，赖氨酸⑷；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);以及8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见，例如Creighton, Proteins(1984))。
[0053]在两个或更多个核酸或者两个或更多个多肽的语境中，术语“同一的”或“百分比同一性”是指相同的或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸(即，当在比较窗或指定区域上比较或比对最大一致性时，为约60%同一性，优选65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)的两个或更多个序列或子序列，如使用BLAST或BLAST2.0序列比较算法、利用默认参数，或通过手动比对和目测测定的。参见，例如NCBI网址ncb1.nlm.nih.gov/BLAST等)。于是将这类序列称为“基本同一的”。该定义还指或可以适用于称呼核苷酸测试序列的互补体。该定义还包括具有缺失和/或删除的序列，以及具有取代的那些。如下所述，该算法可以列入空位等。通常，同一性存在于包含抗体表位的区域，或至少约25个氨基酸或核苷酸长度的序列，或50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域，或所引序列的全长上。
[0054]术语“重组”当对于例如细胞或核酸、蛋白或载体而使用时，表示所述细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源性核酸或蛋白或者改变天然核酸或蛋白而修饰，或者表示细胞源自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或表达以其他方式异常表达、过低表达或根本不表达的天然基因。
[0055]术语“异源性”当对于核酸而使用时，表示该核酸包含两个或更多个天然下未发现彼此具有相同关联的子序列。例如，该核酸通常通过重组产生，具有两个或更多个来自设置以产生新功能核酸的不相关基因的序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。同样，异源性蛋白表示该蛋白包含两个或更多个天然下未发现彼此具有相同关联的子序列(例如，融合蛋白)。
[0056]术语“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，所述免疫球蛋白基因或其片段特异地结合并识别抗原，例如，β 8、特定细胞表面标记或任何期望的靶标。通常，“可变区”含有抗体(或其功能等同物)的抗原-结合区，并且在结合特异性和亲和力中最至关重要。参见 Paul, Fundamental Immunology (2OO3)。
[0057]示例性的免疫蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每一链的N端界定了约100-110个或更多个主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。术语可变区轻链(')和可变区重链(Vh)分别是指这些轻链和重链。
[0058]“同种型”是一类由重链恒定区界定的抗体。免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Y、δ、ε和μ恒定区基因。轻链分类为K或λ。重链分类为Y、μ、α、δ或ε ,其反过来分别定义同种型种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0059]抗体可以作为包含·特定抗原-结合活性的完整的免疫球蛋白或作为多种特征清楚的片段中的任何一种存在。此类片段可以通过用不同的肽酶消化产生。胃蛋白酶在铰链区中的二硫键以外消化抗体，以产生F(ab)’ 2，即Fab的二聚体，其自身为通过二硫键与Vh-ChI连接的轻链。可以在温和条件下将F(ab) ’ 2还原，以破坏铰链区中的二硫键，由此将F (ab) ’2 二聚体转化为Fab单体。Fab单体基本为具有部分铰链区的Fab (参见FundamentalImmunology (Paul编辑，第三版.1993))。尽管根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，本领域技术人员应认识到可以以化学方法或通过使用重组DNA方法重新合成这类片段。因此，如本文所用，术语抗体还包括通过修饰整个抗体而产生的抗体片段，或使用重组DNA方法重新合成的那些(例如，单链Fv)，或使用噬菌体显示文库确定的那些(参见，例如McCafferty 等人，Nature348:552-554 (1990))。
[0060]“单克隆抗体”指对抗原上的给定表位具有单一结合特异性和亲和力的抗体克隆制备物。“多克隆抗体”指针对单一抗原产生的抗体制备物，但具有不同的结合特异性和亲和力。
[0061]如本文所示用，“V区”指抗体可变区结构域，包含框架1、⑶R1、框架2、⑶R2、框架
3、CDR3和框架4的片段。这些片段包含在V-片段中起因于B细胞分化期间重链和轻链V区基因的重排。
[0062]如本文所示用，“互补决定区(OTR) ”指每条链中由轻链和重链可变区确立的插入4个“框架”区的3个高变区。⑶R主要负责结合至抗原表位。每条链的⑶R通常称为⑶R1、⑶R2和⑶R3，从N端开始顺序编号，并且通常还通过特定⑶R所处于的链确定。因此，VhCDR3位于发现其的抗体的重链的可变域，而' CDRl为来自发现其的抗体的轻链的可变域的 CDRl。
[0063]物种内不同轻链或重链的框架区序列是相对保守的。抗体的框架区为组合的组成性轻链和重链的框架区，用于在3维空间中定位和排列CDR。
[0064]可以利用本领域各种熟知的定义确定CDR和框架区的氨基酸序列，例如，Kabat, Chothia,国际免疫遗传学数据库(MGT)和AbM (参见，例如，Johnson etal.,同上;Chothia&Lesk, (1987)J.Mol.Biol.196, 901-917;Chothia et al.(1989)Nature342, 877-883;Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227, 799-817;Al-Lazikaniet al.，J.Mol.Biol 1997，273 (4))。抗原结合位点的定义还描述于以下中:Ruiz etal.Nucleic Acids Res., 28, 219 - 221 (2000);和 Lefranc Nucleic Acids Res.Janl;29(l):207-9(2001) ;MacCallum et al.，J.Mol.Biol.，262: 732-745 (1996);和Martin et al, Proc.Natl Acad.Sc1.USA,86, 9268 - 9272(1989);Martin, et al, MethodsEnzymo1., 203:121 - 153, (1991);Pedersen et al, Immunomethods, I, 126, (1992);和 Reeset al, Sternberg M.J.E.(ed.), Protein Structure Prediction.0xford UniversityPress, Oxford, 141 - 1721996)。
[0065]“嵌合抗体”为抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、取代或交换，以使抗原结合位点(可变区、CDR或其部分)连接至类型、效应功能和/或种类不同或改变的恒定区，或赋予新性质至嵌合抗体的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或者(b)可变区或其一部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区(例如，来自不同物种的CDR和框架区)改变、取代或交换。本发明的优选抗体及其用途包括人源化和/或嵌合单克隆抗体。
[0066]抗体结合至抗原上的“表位”。表位为抗原上的特异性抗体结合相互作用位点，并且可以包含少量氨基酸或少量氨基酸部分，例如5或6个或更多个，例如20个或更多个氨基酸，或那些氨基酸的部分。在某些情况下，表`位包含例如来自碳水化合物、核酸或脂质的非蛋白组分。在某些情况下，表位为三维部分。因此，例如，当靶标为蛋白时，表位能由连续的氨基酸或来自蛋白不同部分的氨基酸组成，所述蛋白的不同部分通过蛋白折叠而使其接近(例如，不连续的表位)。对于其他类型的形成三维结构的靶分子同样如此。
[0067]术语“特异性结合”指以相比非靶标化合物的至少2倍大的亲和力结合至靶标的分子(例如，抗体或抗体片段)，例如，至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍大的亲和力。例如，特异性结合β 8的抗体通常以相比非β8靶标(例如，不同的整合素亚基，例如，β6)的至少2倍大的亲和力结合至β8。
[0068]关于细胞类型，术语“结合”(例如，结合纤维化细胞、肝细胞、软骨细胞等的抗体)通常指能结合那些细胞的纯群体中的大多数细胞的试剂。例如，结合给定细胞类型的抗体通常结合至所示细胞群中的至少2/3的细胞(例如，75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。本领域技术人员应当认可取决于测定结合的方法和/或阈值，一些变化性会上升。
[0069]如本文所使用，当相比不存在第一抗体下的第二抗体的结合，存在第一抗体下第二抗体与靶标的结合可检测地降低时，第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分“竞争”结合至靶标。可选地，第二抗体存在下第一抗体与靶标的结合也可检测地降低的情况可以存在，但不必如此。即，第二抗体能抑制第一抗体与靶标的结合，而无需第一抗体抑制第二抗体与靶标的结合。然而，当每一抗体可检测地抑制其它抗体与其同源表位或配体的结合时，无论为相同、更大或更小的程度，抗体均被称为彼此“交叉竞争”结合它们各自的表位。竞争和交叉竞争的抗体包括在本发明中。如本领域技术人员能确定的，术语“竞争者”抗体可以适用于第一或第二抗体。在一些情况下，竞争者抗体(例如，第一抗体)的存在将第二抗体与靶标的结合减少至少10%，例如，20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多，例如，以便在存在第一(竞争者)抗体下检测不到第二抗体与靶标的结合。
[0070]术语“差异化表达的”或“差异化调控的”通常指相比至少一个其他样品，一个样品中的过表达的(上调的)或过低表达的(下调的)蛋白或核酸生物标志。在本发明情形下，该术语通常指相比正常细胞，患病细胞上生物标志(例如，ανβ8)的过表达。
[0071]例如，术语“过表达的”或“上调的”可交换地指以可检测地高于对照水平转录或翻译的蛋白或核酸，通常为生物标志。该术语包括由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如，细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)及RNA和蛋白质稳定性引起的过表达。可以利用用于检测生物标志的常规技术，不论是mRNA( 即，RT-PCR、杂交)或是蛋白(即，流式细胞术、成像、ELISA、免疫组织化学技术)，检测过表达。相比正常细胞，过表达可以为 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。
[0072]术语“激动剂”、“活化剂”、“诱导物”等术语指相比对照能增加活性或表达的分子。激动剂为例如结合至靶标、刺激靶标、增加靶标、激活靶标、提升靶标活化、致敏靶标或上调靶标活性的试剂。相比对照，表达或活性可以增加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多。在某些情形下，相比对照，活化为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍。
[0073]术语“抑制剂”、“阻遏物”或“拮抗剂”或“下调剂”可交换地指相比对照，引起可检测地降低的表达 或活性水平的物质。相比对照，抑制的表达或活性可以为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更少。在某些情形下，相比对照，抑制为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
[0074]“对照”样品或值指用作用于比较测试样品参照(通常为已知的参照)的样品。例如，测试样品可以取自测试病况，例如，在测试化合物存在下，并且相比来自已知病况的样品，例如，在测试化合物(阴性对照)存在下，或在已知化合物(阳性对照)存在下。对照还可以代表从多个测试或结果得出的平均值。本领域技术人员应当认可可以设计对照，用于评估任何数目的参数。例如，可以基于药理数据(例如，半衰期)或治疗措施(例如，t匕较效益和/或副作用)设计对照来比较治疗效益。可以设计对照用于体外应用。本领域技术人员应当理解那些对照在给定情形下有价值，并能基于与对照值的比较分析数据。对照还对测定数据的显著性有价值。例如，如果对照中给定参数的值存在广泛变异，则测试样品中的变化将不被认为具有显著性。
[0075]“标记”或“可检测部分”为通过广谱学、光化学、生物学、免疫化学、化学或其他物理方法可检测的组合物。例如，可用的标记包括32P、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白，或可以例如通过将放射标记整合至与靶肽特异性反应的肽或抗体使得其可检测的其他实体。可以采用本领域已知的任何用于将抗体缀合至标记的方法，例如，利用Hermanson, BioconiuRateTechniguesl996.Academic Press, Inc., San Diego 中描述的方法。
[0076]“标记的”分子(例如，核酸、蛋白或抗体)是与标记通过连接臂或化学键共价，或通过离子、范德瓦尔斯力、静电或氢键非共价结合的分子，以便可以通过检测结合至分子的标记的存在检测该分子的存在。
[0077]术语“诊断”指病症如癌症或炎症性病况存在于对象中的相对可能性。类似地，术语“预后”指对象中某些未来结果可能发生的相对可能性。例如，预后可以指个体发展TGF3或ανβ 8相关病症、具有复发的可能性，或疾病可能的严重性(例如，症状的严重性、功能下降率、存活等)。该术语不试图为绝对的，如医学诊断领域任何技术人员所理解的。
[0078]如本文使用的“活检”或“来自患者的生物样品”指获自患有或怀疑患有TGF3或ανβ8相关病症的患者的样品。在一些实施方案中，样品可以为组织活检，如穿刺活检、细针活检、手术活检等。样品还可以为血液样品或血液部分，例如，白细胞部分、血清或血浆。样品可以包含具有病灶或疑似病灶的组织样品，尽管该生物样品还可以源自另一位点，例如，疑似转移的位点、淋巴结或来自血液。在一些情形下，所述生物样品还可以来自邻近病灶或疑似病灶的区域。
[0079]“生物样品”可以获自患者例如活检、动物如动物模型，或培养细胞，例如，取自患者和培养物中生长用于观察的细胞系或细胞。生物样品包括组织和体液，例如，血液、血液部分、淋巴、唾液、尿、粪便等。
[0080]术语“治疗(therapy) ”、“治疗(treatment) ”和“改善”指症状严重性的任何减少。在治疗炎症性病况的情形下，治疗可以给予例如炎症性细胞因子的血液水平、有活性的成熟TGF的血液水平、疼痛、肿胀、免疫细胞募集等的减少。在治疗癌症的倾向下，治疗可以给予例如肿瘤大小、癌细胞细胞、生长速率、转移活性、非症细胞的细胞死亡等的减少。如本文所示用，术语“治疗”和“预防”不试图为绝对术语。治疗和预防可以给予任何起始延迟、症状改善、患者存活的改善、存活时间或存活率的增加等。治疗和预防可以为完整的(无可检测的症状残留)或部分的，以便症状比`未接受本文所述治疗的患者内的具有更少频率的严重性。可以将治疗效果与未接受治疗的个体或个体库，或治疗前的或治疗期间不同时间的相同患者比较。在一些方面，相比例如给药前的个体或未经历治疗的对照个体，疾病严重性减少了至少10%。在一些方面，疾病严重性减少了至少25%、50%、75%、80%或90%，或者在一些情形下，利用标准诊断技术不再能检测到。
[0081]术语“有效量”、“有效剂量”、“治疗有效量”等指治疗剂的量足以改善病症，如上所述。例如，对于给定参数，治疗有效量显示治疗效果至少5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90%或至少100%的增加或减少。治疗效果还可以表示为倍”增加或减少，例如，治疗有效量相比对照可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多的效果。
[0082]如本文所使用，术语“药学可接受的”与生理上可接受的和药学可接受的同义使用。药物组合物通常包含储存中用于缓冲和保存的试剂，并且取决于给药途径，可以包含用于适当递送的缓冲剂和载体。
[0083]术语“剂量(dose) ”和“剂量(dosage) ”在本文中可交换使用。剂量指每次给药时给予个体的有活性成分的量。对于本发明，剂量可以指抗体或相关组分的浓度，例如，治疗剂的量或放射标记的剂量。剂量随多种因素发生变化，包括给药频率；个体的大小和耐受性；病况的严重性；副作用风险；给药途径；和可检测部分(若存在)的成像模式。本领域技术人员应当认可取决于上述因素或基于治疗过程，可以修改剂量。术语“剂型”指药物的具体形式，并且取决于给药途径。例如，剂型可以为液体，例如，用于注射的盐溶液。
[0084]“对象”、“患者”、“个体”等术语可交换地使用，并且指除非有指示外，哺乳动物如人和非人灵长类，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳类物种。该术语不一定表明对象诊断患有特定疾病，但通常指医疗监督下的个体。患者可以为寻求治疗、监测、存在的治疗方案的调整或修改等的个体。
[0085]“炎症性病况”指个体的任何炎症，且可以为瞬时的(例如，响应病原体或过敏原暴露)或慢性的。炎症特征为募集和激活巨噬细胞和其他细胞因子的炎症性细胞因子如
。在一些情形下，炎症可以发展为慢性、有害的病况或自身免疫病况(例如，MS、狼疮、风湿性关节炎、克罗恩氏病)。炎症可以局部显现(例如，处于感染或暴露的局部位点)或全身显现(例如，粥样硬化、高血压)。在一些实施方案中，本文所述的抗体组合物和方法可以用于治疗炎症性病况。
[0086]“癌症”、“肿瘤”、“转移的”等术语包括癌症前期的、肿瘤、转移的和癌症细胞，并且可以指实体瘤，或非实体性癌症(参见，例如，Edge et al.ATCC Cancer Staging Manual (7thed.2009) ;Cibas and Ducatman Cytology:Diagnostic principles and clinicalcorrelates (3rd ed.2009))。癌症包括良性和恶性的(异常生长)。“转移”指自发性或诱导的表型变化，例如，细胞永生化、形态变化、异常细胞增生、减少的接触抑制和锚固，和/或恶性疾病(参见,Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rded.1994))。尽管转移可以由转化性病毒感染和新基因组DNA并入，或外源DNA摄取引起，其还可以自发引起或暴露至致癌物后引起。
[0087]术语“癌症”可以指癌、恶性肿瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病、实体癌和淋巴癌等。不同类型的癌症实例包括但不限·于:肺癌(例如，非小细胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(即，肝癌(hepatocarcinoma))、肾癌(即，肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、胸膜癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胰腺癌、胆管癌、胃肠类癌瘤、食管癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃(胃(gastric))癌、中枢神经系统癌、皮肤癌、绒毛膜癌；头颈癌、血液癌症、骨源性肉瘤、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、胶质癌、黑素瘤、B细胞淋巴癌、非霍奇金淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt’ s lymphoma)、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核细胞性白血病、粒细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，本文所述的抗体组合物和方法可以用于治疗癌症。
[0088]II1.ανβ 8特异性抗体
[0089]Α.人源化的 37Ε1Β5
[0090]小鼠单克隆抗体37El(IgG2a)选择性阻止人整合素ανβ8与其配体——转化生长因子-β (TGF-β)的相互作用。该抗体的独特之处在于选择性阻止ανβ8-介导的TGF-β激活(成熟TGF-β 多肽的释放)，但不防止ανβ8结合至固定的或分泌的TGF-β。这提供了仅干扰TGF-β激活的高度选择性，而不干扰α νβ 8的细胞粘附性质。另外，TGF-β的全身激活在一些情形下是不可取的。37Ε1抗体的特异性活性提供了用于减少TGF-β水平的靶标治疗工具。[0091]改善了 37E1的重链和轻链可变区以产生较高亲和力的抗体。图1显示了给予对相同表位on β 8的较高亲和力的特异性氨基酸取代。改进的(较高亲和力)抗体称为37Ε1Β5。其在培养细胞中显示增加的体外亲和力和增强的抑制整合素ανβ8-介导的TGF-β激活的功效。37Ε1Β5抗体体外有效的治疗剂量为皮摩尔范围。产生了保留β 8的高亲和力结合的37Ε1Β5人源化形式，如图1所示。与亲本37Ε1和37Ε1Β5抗体一样，人源化的37Ε1Β5阻止ανβ8介导的TGF-β激活,但不防止α νβ 8结合至固定的或分泌的TGF-β。
[0092]因此，提供的抗体具有重链⑶R1-3，其发现于SEQ ID NO:4、6和8的可变区重链序列。重链CDR1-3的序列分别为RYWMS(SEQ ID NO:94) ,EINPDSSTINYTSSLKD(SEQ ID NO:95)和LITTEDY (SEQ ID NO: 96)。进一步提供的抗体具有轻链CDR1-3，其发现于轻链序列SEQ IDΝ0:5 或 SEQ ID Ν0:7 和 9。来自 SEQ ID NO:5 的轻链 CDR1-3 的序列为 KASQDINSYL(SEQ IDNO:97)、RANRLVD(SEQ ID NO:98)和 LQYDEFPYT(SEQ ID NO:99)。轻链可变区序列 SEQ IDΝ0:7和 9 与 SEQ ID NO:5 具有相同的 CDRl 和 CDR3 序列，但CDR2 (YANRLVD, SEQ ID NO: 100)不同。
[0093]在一些实施方案中，提供的抗体包含:
[0094]包含SEQ ID Ν0:94、95和96的重链可变区序列，以及包含SEQ ID Ν0:97、98和99
的轻链可变区序列；
[0095]包含SEQ ID Ν0:94、95和96的重链可变区序列，以及包含SEQ ID Ν0:97、100和99的轻链可变区序列；或
[0096]选自SEQ ID Ν0:4、6和8的重链可变区序列，以及选自SEQ ID Ν0:5、7和9的轻链可变区序列，这些序列可以为任何组合。
[0097]在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:8的重链可变区序列和SEQ ID NO:9的轻链可变区序列。
[0098]B.11Ε8
[0099]11Ε8抗体结合α νβ8上的与37Ε1Β5类似的表位，但还结合固定的细胞(例如，用福尔马林固定的)。类似于37Ε1Β5，11Ε8特异性结合α ν β 8，并抑制有活性的成熟TGF β肽的释放，而不抑制潜态TGF3与ανβ8的粘附。因为11Ε8可以结合未固定的和福尔马林固定的细胞上的α V β 8，并且可以减少成熟TGFP的释放，11Ε8可用于检测(例如，诊断或监测)、治疗和组合的检测/治疗应用。
[0100]抗体11Ε8的重链和轻链可变区(⑶R划有下划线)如下所示:
[0101]SEQ ID NO: 10 - 11Ε8的重链可变区(CDR1-3划有下划线；分别为SEQ IDNO:48-50)
[0102]EVQLQQSGPELMKTGASVKISCKATGYTFSSYfflEffVKQRPGHGLEfflGDILPGSGTTNYNEKFKGRATVTADRSSNTAYMQLSSLTYGDSAVYYCATWGWDTYWDQGTSVTVSS
[0103]SEQ ID NO: 11 - 11E8的轻链可变区(CDR1-3划有下划线；分别为SEQ IDNO:51-53)
[0104]DIVMTQSPSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNffYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSNLPYTFGGGTKLEIKR
[0105]因此，提供的抗体包含重链CDR SEQ ID NO:48、49和50，以及轻链CDR SEQ IDNO:51、52和53。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区SEQ ID NO: 10和/或轻链可变区 SEQ ID NO:11。
[0106]如图1lA-B和12A-B所示，已经发现了亲和力成熟的11E8抗体，并指定为llE8Mut28、llE8Mut94 和 11E839。
[0107]llE8Mut28亲和力成熟的抗体具有重链CDR3变化(WGWDSY;SEQ ID N0:54)和轻链CDR3变化(QQFSNLPYT;SEQ ID N0:55)。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含:
[0108]重链CDR SEQ ID NO:48、49 和 54，以及轻链 CDR SEQ ID NO: 51、52 和 53 ;或
[0109]重链CDR SEQ ID NO:48、49 和 50，以及轻链 CDR SEQ ID NO: 51、52 和 55 ;或
[0110]重链CDR SEQ ID NO:48、49 和 54，以及轻链 CDR SEQ ID N0:51、52 和 55。
[0111]IlE8Mut28还具有重链FR3 (KAAITADTSSNTSYLQLSSLTSEDSAVYYCAR; SEQ ID NO: 56)和重链FR4(W￡QGTLVTVSS;SEQ ID N0:57)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO: 56或57 (例如，SEQ ID NO: 32)的重链可变区，以及任选地含有SEQ ID NO: 23的轻链可变区。
[0112]llE8Mut94亲和力成熟的抗体具有重链⑶R2和⑶R3 (分别为DILPGSGTTNYNEKFEG, SEQ ID NO: 90 和 WGWDSY, SEQ ID NO: 54)变化。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含:
[0113]重链CDR SEQ ID NO:48、90 和 54，以及轻链 CDR SEQ ID N0:51、52 和 53。
[0114]llE8Mut94 还具有重链 FR2 (ffVKQRPGHGFEfflG.SEQ ID NO: 91)、重链 FR3 (RAAITADTSSNTSYMQLSSLTSEDSAVYYCAR, SEQ ID NO:92)和重链 FR4 (WQQGTLVTVSS; SEQ ID NO:57)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID N0:91、92或57的重链可变区(例如，SEQ ID NO: 88)，以及任 选地含有SEQ ID NO: 89的轻链可变区。llE8Mut94还具有轻链FRl变化(DIKMTQTPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID N0:93)。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQID N0:93的轻链可变区例如，SEQ ID NO:89，以及任选地SEQ ID NO:88的重链。
[0115]llE8Mut39亲和力成熟的抗体具有重链CDR1(TYWIE;SEQ ID NO: 112)、重链CDR2 (HTLPGSGTTNYNEKFKG; SEQ ID NO: 113)、轻链CDRl (STSQDVSSYLN; SEQ ID NO: 105)和轻链⑶R2(YASNLHS;SEQ ID NO: 107)变化。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含:
[0116]重链CDR SEQ ID NO: 112、113 和 50，以及轻链 CDR SEQ ID N0:51、52 和 53;
[0117]重链CDR SEQ ID NO:48、49 和 50，以及轻链 CDR SEQ ID NO: 105、107 和 53 ;或
[0118]重链CDR SEQ ID NO: 112、113、50，以及轻链 CDR SEQ ID NO: 105、107 和 53。
[0119]llE8Mut39 还具有重链 FRl(gVQLQQSGPELMKTGASVKISCKATGYTFS;SEQ ID NO: 106),重链 FR3 (RATHADRESNT§_YMQLSSLTY迎SAV^YCAT ; SEQ IDNO: 114)和重链 FR4 (WDHGTSVTVSS; SEQ ID NO: 108)变化。llE8Mut39 具有轻链FRl(DIMMTQIPSSLSASL⑶RVTISC;SEQ ID NO:115)和轻链 FR4(FGGGTKLEIKA;SEQ IDN0:111)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO: 106、114或108的重链可变区(例如，SEQ ID NO: 102)，以及任选地含有SEQ ID NO: 104的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体具有包含SEQ ID NO: 115或111的轻链可变区(例如，SEQ ID NO: 104)，以及任选地包含SEQ ID NO: 102的重链可变区。
[0120]C.14E5
[0121]14E5抗体结合ανβ8上与37E1B5类似的表位。如同37Ε1Β5，14Ε8特异性结合ανβ8，但不同于37Ε1Β5，14Ε5不抑制有活性的成熟TGF0肽的释放，或潜态TGF^与ανβ8的粘附。因为14Ε5为α ν β 8特异性的，但不阻止活性，其可用于检测，例如，体内诊断或监测应用。
[0122]抗体14Ε5的重链和轻链可变区(CDR划有下划线)如下所示:
[0123]SEQ ID NO: 12 - 14Ε5的重链可变区(CDR1-3划有下划线；分别为SEQ IDNO:58-60)
[0124]EVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSTYfflEfflKQRPGHGLEfflGHILPGSVITNYNEKFKGKAAITADTSSNTSYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGWDSYWGQGTLVTVSS
[0125]SEQ ID NO: 13 - 14E5的轻链可变区(CDR1-3划有下划线；分别为SEQ IDNO:61-63)
[0126]DIEMTQSPSSLSASLGDRVTISCSTSQDISSSLNffYQQKPDGTVTLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKR
[0127]因此，提供的抗体包含重链CDR SEQ ID NO: 58、59和60，以及轻链CDR SEQ IDN0:61、62和63。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区SEQ ID NO: 12和/或轻链可变区 SEQ ID NO:13。
[0128]如图1IA-B和12A-B所示，发现了 14E5的7个亲和力成熟的抗体，称为14E5Mutll、14E5Mut42、14E5Mut54、14E5Mut68、14E5Mut65、14E5Mut83 和 14E5Mut95。3 个亲和力成熟的抗体具有如下所示的⑶R和FR序列变化。在一些实施方案中，提供的抗体包含来自14E5的⑶R和FRs，以及各种组合的亲和力成熟形式的14E5。
[0129]14E5Mutll 具有重链 CDRl 变化(TNWIE, SEQ ID NO:64),轻链 CDRl 变化(SASQGISKYLN, SEQ ID N0:6·5)、轻链 CDR2 变化(YTSSLHS, SEQ ID NO:66)和轻链 CDR3 变化(QQYSNLPYT，SEQ ID N0:67)。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含来自14E5和14E5Mutll的CDR的组合，例如:
[0130]重链CDR SEQ ID NO:64、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:61、62 和 63 ;或
[0131]重链CDR SEQ ID NO: 58、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID NO:65、66 和 67 ;或
[0132]重链CDR SEQ ID NO:64、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:65、66 和 67。
[0133]14E5Mutll 还具有轻链 FRl 和 FR2 变化(分别为 DILMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQID N0:68和WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID N0:69)。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID N0:68或69(例如，SEQ ID NO:24)的轻链可变区，以及任选地含有SEQ ID NO:33的重链可变区。
[0134]14E5Mut42 具有轻链 CDRl 变化(SASQGISNYLN, SEQ ID NO:70)、轻链 CDR2 变化(YTSSLHS, SEQ ID NO:66)和轻链 CDR3 变化(QQYSDLPYT, SEQ ID N0:71)。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含来自14E5和14E5Mut42的⑶R的组合，例如:
[0135]重链CDR SEQ ID NO: 58、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:70、66 和 71。
[0136]14E5Mut42 还具有重链 FRl (EVPLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFS, SEQ ID NO: 72)、轻链FRl和FR2(分别为DIVMTQTPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO:73和WYQQKPDGTVKLLTY, SEQID NO:69)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID N0:72的重链可变区(例如，SEQ ID NO:34)，任选地具有含有SEQ ID N0:25的轻链。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO: 73或69的轻链可变区(例如，SEQ ID NO: 25)，以及任选地含有SEQ IDNO:34的重链可变区。[0137]14E5Mut54 具有重链 CDRl 变化(TNWIE, SEQ ID NO:64)、轻链 CDRl 变化(SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70)、轻链 CDR2 变化(YTSSLHS, SEQ ID NO:66)和轻链 CDR3 变化(QQYSNLPYT，SEQ ID N0:67)。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含来自14E5和14E5Mut54的CDR的组合，例如:
[0138]重链CDR SEQ ID NO:64、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:61、62 和 63 ;或
[0139]重链CDR SEQ ID NO: 58、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID NO: 70、66 和 67 ;或
[0140]重链CDR SEQ ID NO:64、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:70、66 和 67。
[0141]14E5Mut54 还具有重链 FR3(KAAITADTSSNTSYMQLTSLTSEDSAVYYCAR, SEQ IDNO:74)以及轻链 FRl 和 FR2(分别为 DILMTQTPSSLSASLGDRVTIRC, SEQ ID NO:75 和WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO:69)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ IDN0:74的重链可变区(例如，SEQ ID NO:35)，任选地具有包含SEQ ID N0:26的轻链。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO: 75或69 (例如，SEQ ID NO: 26)的轻链可变区，以及任选地包含SEQ ID N0:35的重链可变区。
[0142]14E5Mut68 具有重链 CDR2 变化(DILPGSGTTNYNEKFKG, SEQ ID NO: 76)、轻链 CDRl变化(SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70)、轻链 CDR2 变化(YTSSLHS, SEQ ID NO: 66)和轻链 CDR3变化(QQYSELPYT，SEQ ID N0:77)。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含来自14E5和14E5Mut68的⑶R的组合，例如:
[0143]重链CDR SEQ ID NO:58、76 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:61、62 和 63 ;或
[0144]重链CDR SEQ ID NO: 58、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID NO: 70、66 和 77 ;或
[0145]重链CDR SEQ ID NO: 58、76 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID NO: 70、66 和 77。
[0146]14E5Mut68 还具有重链 FR3(R`ATVTADRSSNTSYMQLSSLTSEDSAVYYCAR, SEQ IDNO:78)以及轻链 FRl 和 FR2(分别为 DIKMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO:79 和WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO:69)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ IDN0:78的重链可变区(例如，SEQ ID NO:36)，任选地具有含有SEQ ID N0:27的轻链。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO: 79或69的轻链可变区(例如，SEQ ID NO: 27)，以及任选地含有SEQ ID NO:36的重链可变区。
[0147]14E5Mut65 具有重链 CDRl 变化(TNWIE, SEQ ID NO:64)、轻链 CDRl 变化(SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70)、轻链 CDR2 变化(YTSSLHS, SEQ ID NO:66)和轻链 CDR3 变化(QQFSNLPYT，SEQ ID N0:80)。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含来自14E5和14E5Mut65的CDR的组合，例如:
[0148]重链CDR SEQ ID NO:64、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:61、62 和 63 ;或
[0149]重链CDR SEQ ID NO: 58、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID NO: 70、66 和 80 ;或
[0150]重链CDR SEQ ID NO:64、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:70、66 和 80。
[0151 ] 14E5Mut65 还具有重链 FRl 和 FR3 (QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYSFS, SEQ IDNO: 81 和 KAAITADTSSNTSYMQLSSLTSDDSAVYYCAR, SEQ ID NO: 82)以及轻链 FRl 和 FR2 (分别为 DIKMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO: 79 和 WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO:69)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID N0:81或82的重链可变区(例如，SEQ IDNO:37)，任选地具有含有SEQ ID N0:28的轻链。在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ IDNO:79或69的轻链可变区(例如，SEQ ID NO:28)，以及任选地包含SEQ ID N0:37的重链可变区。
[0152]14E5Mut83 具有重链 CDRl 变化(THWIE, SEQ ID NO:83)、轻链 CDRl 变化(SASQGISNYLN, SEQ ID NO: 70)、轻链 CDR2 变化(YTSSLHS, SEQ ID NO:66)和轻链 CDR3 变化(QQYSDLPYT, SEQ ID N0:71)。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含来自14E5和14E5Mut83的CDR的组合，例如:
[0153]重链CDR SEQ ID NO:83、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:61、62 和 63 ;或
[0154]重链CDR SEQ ID NO: 58、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:70、66 和 71 ;或
[0155]重链CDR SEQ ID NO:83、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:70、66 和 71。
[0156]14E5Mut83 还具有重链 FRl(EVQLQQSGAVLMKPGASVKISCKATGYTFS, SEQ IDNO:84)以及轻链 FRl 和 FR2(分别为 DILMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO:68 和WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID NO:69)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ IDN0:84的重链可变区(例如，SEQ ID NO:38)，任选地具有包含SEQID N0:29的轻链。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO: 68或69 (例如，SEQ ID NO: 29)的轻链可变区，以及任选地含有SEQ ID N0:38的重链可变区。
[0157]14E5Mut95 具有轻链 CDRl 变化(SASQGISNYLN, SEQ ID NO:70)、轻链CDR2 (YTSSLHS, SEQ ID NO:66)变化和轻链 CDR3 变化(QQYSDLPYT, SEQ ID N0:71)。另外，在一些实施方案中，提供的抗体包含来自14E5和14E5Mut95的⑶R的组合，例如:
[0158]重链CDR SEQ ID NO: 58、59 和 60，以及轻链 CDR SEQ ID N0:70、66 和 71。
[0159]14E5Mut95 还具有重链 FRl 和 FR3 (EVQLQQTGAELMKPGASVKISCKATGYTFS, SEQ IDNO: 85 和 KA VITADTSSNTSYMQLSSLTSEDSAVYYCAR, SEQ ID NO: 86)以及轻链 FRl 和 FR2 (分别为 DIEMTQSPSSLSASLGDRVTISC, SEQ ID NO:87 和 WYQQKPDGTVKLLTY, SEQ ID N0:69)变化。因此，在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID N0:86(例如，SEQ ID NO: 39)的重链可变区，任选地具有含有SEQ ID N0:30的轻链。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:87或69(例如，SEQ ID NO: 30)的轻链可变区，以及任选地含有SEQ ID N0:29的重链可变区。
[0160]D.6B9
[0161]6B9抗体结合包含在人β 8的氨基酸61-105(相对于SEQ ID N0:17所示的全长β 8序列的氨基酸位置)中的β 8上的表位，并且不与鼠β 8显著性相互作用。如实施例中所示，丝氨酸95包含在表位中(直接结合或间接包含于表位结构)，因为在那一位置用脯氨酸取代丝氨酸能基本上消除结合。6Β9抗体与37Ε1Β5、11Ε8或14Ε5竞争结合。另外，6Β9抗体可以检测未固定的和福尔马林固定的细胞和组织上的β 8，并区分例如表达不同水平的β 8的细胞(见实施例，及图6和8)上的β 8表达水平。表达水平还可以指示细胞中β8的基因组拷贝数以及发病机制。
[0162]抗体6Β9的重链和轻链可变区(⑶R划有下划线)如下所示:
[0163]SEQ ID NO: 18 - 6Β9的重链可变区(CDR1-3划有下划线，分别为SEQ ID NO:40-42)
[0164]QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTDYLIEffVKQRPGQGLEfflGVINPETGGTNYNAKFKGKATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAREAGNYIYAMDYffGQGTSVTVSS
[0165]SEQ ID NO: 19 - 6B9的轻链可变区(CDR1-3划有下划线，分别为SEQ ID NO:43-45)
[0166]PIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASVNIYSYLVffYQQKQGKSPQLLVHNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHHGTPYTFGGGTKLEIKR[0167]因此，提供的抗体包含重链CDR SEQ ID NO:40、41和42，以及轻链CDR SEQ IDNO:43、44和45。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区SEQ ID NO: 18和/或轻链可变区 SEQ ID NO:19。
[0168]如图1lA-B和12-A-B所示，发现了 6B9的亲和力成熟的抗体，称为6B9Mutl。显然该亲和力成熟的抗体重链CDR2变化(VINPETGGTNYNAKFEG;SEQ ID N0:46)。因此，在一些实施方案中，提供的抗体包含重链CDR SEQ ID NO:40、46和42，以及轻链CDR SEQ ID N0:43、44 和 45。
[0169]6B9Mutl 还具有轻链 FRl 变化(DIYMTQSPASLSASVGETVTITC; SEQ ID N0:47)。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID N0:47的轻链可变区(例如，可变区可以含有SEQ IDNO:23)以及任选地含有SEQ ID NO: 18的重链可变区。
[0170]E.4F1
[0171]4F1抗体还结合包含在β 8的氨基酸61-105(相对于SEQ ID N0:17中显示的全长β 8序列的氨基酸位置)中的β 8上的表位，并且不与鼠β 8显著性相互作用。如实施例中所示，丝氨酸95包含在表位中，因为在那一位置用脯氨酸取代丝氨酸能本质上消除结合。4F1抗体不与37Ε1Β5、11Ε8或14Ε5竞争结合。另外，4F1抗体可以检测未固定的和福尔马林固定的细胞和组织上的β 8，并区分例如表达不同水平的β8的细胞(实施例和图
6、7、9和10)上的β 8表达水平。表达水平还可以指示细胞中β 8的基因组拷贝数和致病机理。
[0172]抗体4F1的重链和轻链可变区(CDR划有下划线)如下所示:
[0173]SEQ ID NO:20 - 4F1的重链可变区(CDR1-3划有下划线，分别为SEQ IDNO:116-118)·
[0174]QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTDYLIEffVKQRPGQGLEfflGVINPETGGTNYNAKFKGKATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAREAGNYIYAMDYffGQGTSVTVSS
[0175]SEQ ID NO:21 - 4F1的轻链可变区(CDR1-3划有下划线，分别为SEQ IDNO:119-121)
[0176]PIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASVNIYSYLVffYQQKQGKSPQLLVHNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHHGTPYTFGGGTKLEIKR
[0177]因此，提供的抗体包含重链CDR SEQ ID NO: 116、117和118，以及轻链CDR SEQ IDN0:119、120和121。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区SEQ ID N0:20和/或轻链可变区 SEQ ID NO:21。
[0178]F.抗 _ανβ8 抗体
[0179]本文提供的抗体特异性结合至整合素ανβ 8，但不显著结合至其他整合素(例如，ανβ6、ανβ3等)。本抗体结合至α ν β 8内的特定表位或表位区。表位可以诶构象性(非线性)或非构象性表位。此类抗体可以单独结合至β 8，即，表位位于β8内，或结合至包含两种亚基的部分的非线性表位，或依赖于αν和β8的相互作用的表位。本抗体包括上述的ανβ 8特异性抗体，以及其人源化的、嵌合的和/或标记的形式，以及ανβ8结合片段和/或其变体。
[0180]在一些实施方案中，抗体结合至β8并抑制TGF0激活，例如，相比无抗体存在时的TGF0激活。在一些实施方案中，抗体不减少表达ανβ 8的细胞与TGF0的粘附，即，抗体不减少ανβ 8-介导细胞粘附至TGFii。在一些实施方案中，相比无抗体存在时的ανβ8结合，抗体可以减少可溶性ανβ8与TGFP的结合。在一些实施方案中，抗体可以结合至SEQ ID NO: 11中的β 8上的表位。在一些实施方案中，所述表位包含选自以下氨基酸中的至少一个氨基酸:人 β 8 的 R79、185、S95、Ρ100、1108、Ρ109、R128、Η140 和 F179。在一些实施方案中，所述表位包含选自以下氨基酸中的至少一个氨基酸:人β 8的Ι74、Ν88、Ι107、T110、I125、R175和F180。在一些实施方案中，所述表位包含选自以下氨基酸中的至少一个氨基酸:人β8的I125、R128、R175、F179和F180。在一些实施方案中，抗体结合人β8，但不结合小鼠β 8。
[0181]可以利用本领域已知的方法测定针对给定抗原产生的抗体的结合位点即表位。例如，可以利用具有已知表位的抗体进行竞争性测定(例如，竞争性ELISA)。如果测试抗体竞争抗原结合，则其可能共用至少部分的相同表位。还可以利用抗原的结构域交换或选择性突变定位表位。即，可以用氨基酸或已知不与测试抗体相互作用的组分“置换”出或取代抗原的每个区域或每个氨基酸。如果相比未取代的抗原，给定区域或氨基酸的取代减少测试抗体与取代的抗原的结合，则该区域或氨基酸可能包含在表位中。
[0182]在一些实施方案中，抗体为人源化的37Ε1Β5抗体，其具有含有SEQ ID Ν0:8的重链可变区和含有SEQ ID Ν0:9的轻链可变区。抗体的同种型可以为IgGl、IgG2、IgG2a、IgG3或 IgG4。
[0183]本发明描述的抗体可以为多克隆的或单克隆的。多克隆血清通常含有混合的抗体群，其特异性结合至沿ανβ8长度的几个表位。然而，多克隆血清可能对特定ανβ8片段具有特异性。在一些实施方案中，抗体为嵌合的、人源化的(参见 Queen et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:10029-10033 (1989)和 W090/07861、US5693762、US5693761、US5585089、US5530101 和 Winter, US5225539)，或人的(Lonberget al.,W093/12227(1993) ;US5877397、US5874299、US5814318、US5789650、US5770429、US5661016、US5633425、US5625126、US5569825、US5545806、Nature 148, 1547-1553 (1994)、Nature Biotechnologyl4,826 (1996)、Kucherlapati，W091/10741 (1991)EP1481008,BIeck, Bioprocessing Jo`urnal I(Sept/Oct.2005)、US2004132066、US2005008625、TO2004072266、TO2005065348、TO2005069970 和 TO2006055778)。在一些实施方案中，抗体为人源化或嵌合形式的37E1B5U1E8或14E5。人同种型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4可以用于人源化的或嵌合的抗体。一些抗体以大于或等于约17UO8UO9UOiciUO11或IO12M-1的结合亲和力(例如，以微摩尔(10-6)、纳摩尔(10-9)、皮摩尔(10-12)或更低值域的Kd)特异性结合至α V β 8。
[0184]G.TGFβ活性检测及抗-ανβ 8抗体影响
[0185]为了确定抗体对TGF0活性的影响，可利用多个TGF0生物测定。例如，可以在共培养测定中测试TGF0激活。将表达ανβ 8的测试细胞与TMLC细胞，即，用驱动荧光素酶基因的TGF-β响应性启动子片段稳定转染的貂肺上皮细胞共培养(Abe et al.(1994)Annal Biochem216:276)。TMLC细胞对TGFP具有高度响应性，并具有非常低背景的TGFβ激活。因此，TMLC细胞可以用于与其他细胞系或无细胞部分共培养，以利用荧光作为读出测试有活性的TGFP的存在。可以在抗TGF0-封闭性抗体(10μ g/ml，1D11;R&D Systems)、抗-β 8 (20 μ g/ml, 37Ε1Β5)或抗-β 6 (150 μ g/ml, 10D5)存在或不存在下进行测定，如(Abe (1994) ;Munger (1999))所述。
[0186]为了测定肿瘤组织中有活性的TGFi3，可以将等重的肿瘤组织切碎并于4°C下在无菌DME中孵育30min。可以在4°C离心(20g)后收获含有有活性的TGFβ的上清液。然后可以于80°C下将细胞团在无血清的DME中孵育20min，以激活SLC，之后可以收获上清液。然后将含有有活性的或热激活的(潜在的)TGFii的上清液加入至预接种的有或无IDll的TMLC细胞。对于蛋白酶抑制或测定，在共培养开始时加入抑制剂。最大剂量的每种抑制剂规定为不抑制TMLC细胞响应重组有活性的TGFii的能力的最高浓度。为了从培养细胞测定可溶性TGF β活性，37°C下，将细胞于温和旋转下在100 μ I的有或无37Ε1或10D5的完全培养基中孵育lh。通过在4°C离心(20g)5min收获无细胞的上清液，然后加入至预接种的存在或不存在IDll的TMLC细胞。对于可溶性受体测定，使用获自过夜培养的细胞的条件培养基。相对荧光素酶单位规定为活性减去TMLC报道子细胞的背景活性。
[0187]IV.产生抗体的方法
[0188]为了制备和使用如本文所述的合适的抗体，例如，重组单克隆或多克隆抗体，可以使用本领域已知的许多技术(参见，例如，Kohler&Milstein, Nature256:495-497 (1975);Kozbor et al., Immunology Today4:72(1983);Cole et al., pp.77-96MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc.(1985);Coligan, Current Protocolsin Immunology(1991);Harlow&Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988);和Goding, Monoclonal Antibodies !Principles and Practice (2d ed.1986))。可以从细胞克隆编码目标抗体的重链和轻链的基因，例如，可以从杂交瘤克隆编码单克隆抗体的基因并用来产生重组单克隆抗体。还可以从杂交瘤或血浆细胞制作编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的大抗体库(参见，例如，Kuby, Immunology (3rd ed.1997))。产生单链抗体或重组抗体的技术(美国专利4，946，778、美国专利第4，816，567号)可能适合产生本发明多肽的抗体。而且，转基因小鼠或其他生物体如其他哺乳动物可以用于表达人源化的或人抗体(参见，例如，美国专利第 5，545 ，807 号?’第 5，545，806 号?’第 5，569，825 号?’第 5，625，126 号?’第 5，633，425号；第 5，661，016 号，Marks et al., Bio/TechnologylO: 779-783 (1992) ; Lonberg et al.,Nature368:856-859(1994);Morrison, Nature368:812-13(1994);Fishwild et al., NatureBiotechnologyl4:845-51 (1996);Neuberger, Nature Biotechnology14:826(1996);和 Lonberg&Huszar, Intern.Rev.1mmunol.13:65-93 (1995))。可选地，卩遼菌体展示技术可以用于确定特异性结合至选定抗原的抗体和杂聚Fab片段(参见，例如，McCafferty et al.,Nature348:552-554(1990);Marks et al.,BiotechnologylO:779-783(1992))。还可以将抗体制成双特异性的，即，能识别两种不同的抗原(参见，例如，W093/08829, Traunecker et al., EMBO J.10:3655-3659(1991);和 Suresh et al., Methodsin Enzymologyl21:210 (1986))。抗体还可以为杂缀合物(heteroconjugates),例如，两种共价连接的抗体或免疫毒素(参见，例如，美国专利第4，676，980号、W091/00360 ；W092/200373 ;和 EP03089)。
[0189]可以利用任何数量的表达系统包括原核和真核表达系统制造抗体。在一些实施方案中，表达系统为哺乳动物细胞表达系统，如杂交瘤或CHO细胞表达系统。许多此类系统可广泛地从供应商获得。在抗体包含Vh和\区的实施方案中，可以利用单个载体表达Vh和'区，例如，在双顺反子表达单元中，或置于不同启动子的控制下。在其他实施方案中，可以利用不同的载体表达Vh和 '区。如本文所述的Vh或\区可以任选地在N端包含蛋氨酸。
[0190]还可以以各种模式制备如本文所述的抗体，包括作为Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或dAB。可以通过多种方法获得抗体片段，包括用酶如胃蛋白酶(以产生(Fab’)2片段)或木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)消化完整抗体；或从头合成。还可以利用重组DNA方法合成抗体片段。在一些实施方案中，抗_β8抗体包含特异性结合β8的F(ab’)2片段。本发明的抗体还可以包含人恒定区。参见，例如，Fundamental Immunology (Paul ed., 4ded.1999) ; Bird, et al., Science242:423 (1988) j[IHuston，et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879(1988)。
[0191]用于人源化或灵长化(primatizing)非人抗体的方法也为本领域已知。通常，人源化的抗体具有一个或多个从非人来源引入至其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为引入(import)残基，其通常取自引入可变域。人源化基本上可以根据Winter和合作者的方法进行(参见，例如，Jones et al., Nature321:522-525 (1986) ; Riechmannet al., Nature332:323-327(1988);Verhoeyen et al.，Science239:1534-1536 (1988)和Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992))，所述方法通过将啮齿类 CDR 或 CDR 序列取代为对应的人抗体序列。此类人源化的抗体为嵌合的抗体(美国专利第4，816，567号)，其中大幅小于完整的人可变域被来自非人物种的对应的序列取代。在实施中，人源化的抗体通常为人抗体，其中一些CDR残基以及可能地一些FR残基被来自啮齿类抗体的相似位点的残基取代。
[0192]在一些情形下，可以将抗体或抗体片段缀合至另一分子，例如，聚乙二醇(PEG化)或血清白蛋白，以提供延长的体内半衰期。抗体片段的PEG化的实例提供于 Knight et al.Plateletsl5:409，2004 (对于阿昔单抗)；Pedley etal.,Br.J.Cancer70:1126, 1994(对于抗-CEA 抗体)；Chapman et al., NatureBiotech.17:780, 1999;和 Humphreys, et al., Protein Eng.Des.20:227, 2007)。还可以将抗体或抗体片段标记，或缀合`至如下所述的治疗剂。
[0193]通常可以根据靶标(例如β 8)的抗体相比对于抗体和环境中的其他物质或无关分子的解离常数的比较性解离常数(Kd)定义抗体结合特异性。通常相比对于靶标的Kd，抗体对于无关物质的Kd为至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍或更闻。
[0194]取决于是否用作诊断或治疗剂,抗体的所需的亲和力例如高(pM至低nM)、中(低nM至IOOnM)或低(约IOOnM或更高)可以不同。例如，相比具有高亲和力的抗体，具有中亲和力的抗体在定位至期望组织中可能更成功。因此，具有不同亲和力的抗体可以用于诊断和治疗应用。
[0195]靶向部分通常以小于约1000nM例如小于250、100、50、20或nM更少nM的Kd结合。在一些实施方案中，亲和剂的Kd小于15、10、5或InM。在一些实施方案中，Kd为1-lOOnM、
0.l-50nM、0.1-1OnM或1-20ηΜ。可以通过熟知的方法测定解离常数(Kd)的值，并且甚至对于复杂混合物，可以通过例如Caceci et al., Byte (1984) 9:340-362中公开的方法用计算机计算。
[0196]可以根据本领域已知的方法测定抗体或任何靶向剂对靶标的亲和力，例如，如Ernst et al.Determination of Equilibrium Dissociation Constants,TherapeuticMonoclonal Antibodies (ffiley&Sons ed.2009)中所综述。
[0197]可以使用定量ELISA和类似的基于测定的亲和力方法。ELISA(酶联免疫吸附信号转导测定)为一种基于抗体的方法。在一些情形下，将目标靶标特异性的抗体粘附在基质上，并与怀疑含有所述靶标的样品接触。然后清洗表面以去除未结合的物质。可以以多种方式检测靶标结合，例如，利用与标记抗体的第二步骤、靶标的直接标记或用抗原结合后可检测的标记标记一抗。在一些情形下，将抗原粘附至基质(例如，利用对白蛋具有高亲和力的基质或链霉亲和素-生物书相互作用)，并利用标记的抗体(或其他靶向部分)检测。已经开发出了原始ELISA方法的几种排列，并且为本领域已知(参见Lequin(2005)Clin.Chem.51:2415-18 的综述)。
[0198]还可以利用表面等离子体共振(SPR)测定KcU Kon和Koff，例如，如通过利用Biacore TlOO系统所测定的。SPR技术的综述参见,例如,Hahnfeld et al.Determinationof Kinetic Data Using SPR Biosensors, Molecular Diagnosis of InfectiousDiseases (2004)。在典型的SPR实验中，一个相互作用物(靶标或靶向剂)被固定在流通池中的SPR-活性的、镀金的玻璃片上，并且含有另一相互作用物的样品被引向流过表面。当表面上发出给定频率的光时，金的光反射率的变化指示结合和结合动力学。
[0199]还可以通过将生物素化的相互作用物锚定至链霉亲和素(SA)感应芯片测定结合亲和力。然后将另一相互作用物与芯片接触，并检测，例如，如Abdessamad et al.(2002)Nuc.Acids Res.30: e45 中所述。
[0200]V.药物应用和组合物
[0201]本文所述的抗-α V β 8抗体(包括其α V β 8结合片段、标记的抗体、免疫缀合物、药物组合物等)可以用于检测、治疗、改善或预防慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。
[0202]本文所述的抗-α V β 8抗体(包括其α ν β 8结合片段、标记的抗体、免疫缀合物、药物组合物等)可以用于检测、治疗、改善或预防炎症性肠病。
[0203]本文所述的抗-α V β 8抗体(包括其α ν β 8结合片段、标记的抗体、免疫缀合物、药物组合物等)可以用于检测、治疗、改善或预防炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病病(例如，横贯性脊髓炎、德维克病、格林-巴利综合征)、神经炎症、肾病或胶质癌。
[0204]本文所述的抗-α V β 8抗体(包括其α ν β 8结合片段、标记的抗体、免疫缀合物、药物组合物等)可以用于检测、治疗、改善或预防关节炎。
[0205]本文所述的抗-α V β 8抗体(包括其α ν β 8结合片段、标记的抗体、免疫缀合物、药物组合物等)可以用于检测、治疗、改善或预防各种纤维化病症，如气道纤维化、自发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、感染后肺纤维化、弥漫性肺泡损伤、胶原-血管疾病相关肺纤维化、药物诱导的肺纤维化、硅肺、石棉相关的肺纤维化、呼吸性细支气管炎、呼吸性细支气管炎间质性肺病、脱屑性间质性纤维化、隐源性迁延性肺炎、慢性超敏性肺炎、药物相关的肺或肝纤维化、肾纤维化和肝纤维化(例如，由酒精、药物使用、脂肪型肝炎、病毒性感染(例如，乙型肝炎或丙型肝炎)、胆汁淤积(choleostasis)等诱导的)。
[0206] 本文所述的抗-α V β 8抗体(包括其α ν β 8结合片段、标记的抗体、免疫缀合物、药物组合物等)可以用于检测、治疗、改善或预防腺癌、鳞状癌、乳腺癌和癌症生长与转移。
[0207]本领域技术人员应当理解药物组合物的性质和给药途径部分取决于治疗的病况。[0208]适合经口给药的制剂可由以下物质组成:(a)液体溶液，如悬浮于稀释剂如水、盐水或PEG400中的有效量的封装的核酸；(b)胶囊、小袋或片剂，每个含有预定量的有活性的成分，如液体、固体、颗粒或明胶；(c)合适液体中的悬浮液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可以包含一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸以及其他的赋形剂、着色剂、填充剂、粘结剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂以及药物相容的载体。锭剂形式可以包含诸如蔗糖的香味剂中的活性成分，以及包含惰性基质中的活性成分的糖锭剂，例如除了活性成分还包含本领域已知的载体的明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂、明胶等。锭剂形式可以包含风味剂中的活性成分例如蔗糖，以及糖锭剂，所述糖锭剂包含惰性基质中的活性成分，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂、凝胶，以及除所述活性成分外还含有本领域已知的载体的类似物。
[0209]包含本文所述抗体(或其α V β 8结合片段)的药物组合物可以单独或与其他合适的成分一起给药，可以制成用于通过吸入给药的气雾剂剂型(“喷洒的”)。可以将气溶胶剂型放置在加压的可接受的推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等中。
[0210]用于直肠给药的合适制剂包括例如栓剂，其由用栓剂基质封装的核酸组成。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，还可能使用明胶直肠胶囊，其由所选化合物与基质的组合组成，所述基质包括例如液态甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃。
[0211]适于肠胃外给药的制剂包括等渗无菌注射水溶液或非水溶液以及无菌悬浮水溶液或非水溶液，其中所述非肠道给药为例如通过关节内途径(在关节中)、静脉内途径、肌肉内途径、瘤内途径、皮肤内途径、腹膜内途径和皮下途径给药，所述无菌注射溶液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，所述无菌悬浮液可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实施中，可以例如通过静脉内输注、经口、局部、腹腔内、膀胱内或鞘内给予组合物。通常通过肠胃外或静脉内给药给予抗体。可以以单位剂量或多剂量密封容器如安瓿和小瓶提供化合物制剂。
[0212]可以由前 述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备注射溶液和悬浮液。制备可经肠胃外给药的组合物的方法为本领域技术人员已知或显而易见，并且在出版物中有更详细的描述，如 Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack PublishingCompany, Easton, Pa.(1980)。
[0213]用于给药的组合物通常包含溶解于药学可接受的载体例如含水载体中的如本文所述的抗体(例如，抗-α νβ8抗体或其ανβ8结合片段或免疫缀合物)。可以使用多种含水载体，例如，缓冲盐水。这些溶液为无菌的且通常无不需要的物质。可以通过常规的、熟知的灭菌技术对这些组合物消毒。组合物可以含有所需的接近生理条件的、药学可接受的辅助性物质如PH调节剂和缓冲剂，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的有活性的试剂的浓度可以存在广泛差异，并且根据所选的特定给药模式以及患者的需求主要基于流体体积、粘性、体重等选择。
[0214]制剂还可以包含其他有活性的化合物，包括化疗剂、细胞毒素剂、细胞因子、生长抑制剂和抗-激素剂。可以将活性成分制成缓释制剂(例如，半渗透的固态疏水性聚合物基质(例如，聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸。还可以将抗体和免疫缀合物封埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊中，例如，分别为胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳剂中的羟甲纤维素或明胶微囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微囊。
[0215]V1.诊断组合物及应用
[0216]整合素avb8表达于纤维原细胞、星状细胞、软骨细胞、活化的巨噬细胞及T和B细胞子集上。COPD和肺纤维化中的纤维原细胞的整合素avb8表达增加，并且可以用作增加的纤维原细胞细胞团的替代标记。因此，本公开的抗体可以广泛地适用于用于检测纤维炎症性(fibroinfIammatory)过程的生物成像策略。本发明描述的治疗和诊断抗体可以适用于:炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、关节炎、肝纤维炎症性病症、酒精诱导的肝损伤、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病毒性肝炎和原发性胆汁性肝硬变(PBC)、肝脏移植后的移植排斥、自身免疫性肝炎、自身免疫性病症、红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎、大疱性类天疱疮、寻常天胞疮、肺纤维化病症、炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病、神经炎症、肾病、肾小球性肾炎、肝细胞癌(HCC)、腺癌、鳞状癌、胶质癌、黑素瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌和乳腺癌。
[0217]如上文解释，本文所述的抗-ανβ 8抗体(包括其α ν β 8结合片段、亲和力成熟的变体和小于50或25kD的抗体变体或scFvs)可以用于体内或体外诊断(例如，利用获自个体的生物样品)。抗体通常与可检测标记缀合或以其他方式连接。连接可以为直接的，例如，共价键，或间接的，例如，利用第二结合剂、螯合剂或连接部分。
[0218]可以提供标记的抗体至个体，以测定所需治疗的适用性。例如，标记的抗体可以用于检测患病区域中的整合素β8密度。对于旨在靶向TGFP或ανβ8活性的治疗(以减少TGFii或ανβ8活性)，β 8的密度相对于未患病组织通常要高。标记的抗体还可以指示患病区域能接受治疗。因此，可以基于成像结果挑选患者用于治疗。可以利用标准成像技术(例如，CT扫描、MR1、PET扫描等)完成解剖学特征的测定如测定癌症的精确范围。可以利用本公开的抗体中的任何一种进行此类体内方法。在一些实施方案中，使用了标记的14E5，因为其不影响TGFP水平。`
[0219]本公开的抗体中的任何一种都还可以用于体外诊断或监测方法，例如，利用来自患者样品的细胞和或组织。在一些实施方案中，使用了标记的11E8(或β8结合片段或亲和力成熟的变体)，因为其可以结合固定的细胞以及未固定的细胞。在一些实施方案中，使用了标记的6Β9 (或β 8结合片段或亲和力成熟的变体)，因为其可以结合固定的细胞以及未固定的细胞，并且其不与治疗性抗体如11Ε8、37Ε1或37Ε1Β5竞争结合β 8。在一些实施方案中，使用了标记的4F1或β 8结合片段或亲和力成熟的变体)，因为其可以结合固定的细胞以及未固定的细胞，并且其不与治疗性抗体如11Ε8、37Ε1或37Ε1Β5竞争结合β8。
[0220]在一些实施方案中，诊断性抗体为单链可变区片段(scFv)。完整的抗体(例如，IgG)可以用于放射治疗或治疗剂的靶向递送，因为它们展现高摄取和保留。在一些情形下，完整的mAb在循环中的存留可以引起高背景(Olafsen et al.(2012)TumourBiol.33:669-77; Cai et al.(2007) J Nucl Med.48:304-10)。ScFv 通常具有约 25kD 的分子量，由肾快速分泌，但为单价的，并且可能具有低亲和力。可以利用先进的抗体工程(如本文所示)克服单价问题，其中可以将亲和力提升至低nM至pM范围。此类抗体具有具有足够端的半衰期以用作成像剂，并具有合适的结合组织祀向特性(Cortez-Retamozo etal.(2004) Cancer Res.64:2853-7)。如本文所示，我们制造了多种非常高亲和力的4F1、6B9和14E5的scFV抗体衍生物，其可以转化为人源化的scFV平台。这些改善的抗体不具阻止作用，并因此可用于与靶向β8的治疗剂组合。
[0221]包含本文所述抗体的诊断剂可以包含本领域已知的任何诊断剂，参见例如以下参考文献:Armstrong et al., Diagnostic Imaging, 5th Ed., BlackwellPublishing(2004);Torchilin, V.P., Ed., Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press(1995);Vallabhajosula, S., Molecular Imaging:Radiopharmaceuticals for PET andSPECT, Springer (2009)。术语“可检测的试剂”、“可检测的部分”、“标记”、“成像剂”等术语在本文中作为同义词使用。可以通过多种方法检测诊断剂，包括作为提供和/或增强可检测信号的试剂。可检测信号包括但不限于Y-发射、放射活性、回波、光、荧光、吸收、磁或断层摄影信号。用于成像诊断剂的技术可以包括但不限于单光子发射计算机断层摄影(SPECT)、磁共振成像(MRI)、光学成像、正电子发射断层摄影(PET)、计算机断层摄影(CT)、X-射线成像、Y-射线成像等。PET尤其具有灵敏性和定量性，并因此对表征体内纤维化过程具有价值(Olafsen et al.(2012) Tumour Biol.33:669-77; Cai et al.(2007) JNuclMed.48:304-10)。其用处超过伴随诊断(companion diagnostic),并且通常可用于诊断、临床阶段以及跟踪任何治疗方案期间的纤维化患者。
[0222]可以将放射性同位素整合到本文所述的诊断剂中，并且可以包括发射Y-射线、正电子、β和α粒子以及X-射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于225Ac、72As、211At,nB,128Ba,212Bi,75Br,77Br,14C,109Cd,62Cu,64Cu,67Cu,18F,67Ga,68Ga,3H,166Ho, 1231 , 1241 , 125I,1301,1311,111In,177Lu,13N,150 , 32P,33P,212Pb,103Pd^186Re,188Re^47Sc,153Sm,89Sr,"mTc,88YiP 90Y。在某些实施方案中，放射性活性试剂可以包含mIn-DTPA、"mTc (CO) 3_DTPA、"mTc (CO) 3_ENPy2、62/64/67Cu-TETA,99mTc (CO) 3-1DA和99niTc (CO) 3三胺(环型或线型)。在其他的实施方案中，试剂可以包含DOTA及其具有mIn、177Lu、153Sm、88/90Y、62/64/67Cu或67768Ga的各种类似物。在一些实施方案中，可以通过整合连接至螯合物的脂质如DTPA-脂质标记纳米粒子，参见以下参考文献:Philli ps et al., Wiley Interdisciplinary Reviews:Nanomedicine and Nanobiotechnology, I(I):69-83(2008);Torchilin, V.P.&ffeissig, V., Eds.Liposomes2ndEd.: Oxford Univ.Press (2003) ; Elbayoumi, T.A.&Torchilin, V.P., Eur.J.Nucl.Med.Mol.1maging33:1196 - 1205(2006);Mougin-Degraef, M.et al.，Int，I J.Pharmaceutics344:110-117(2007)。
[0223]在一些实施方案中，诊断剂可以包含结合至例如用于多种诊断成像技术的金属离子的螯合剂。示例性的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、[4-(1，4，8，11_四氮杂环十四烷-1-基)甲基]苯甲酸(CPTA)、环己二胺四乙酸(⑶TA)、亚乙基双(氧基亚乙基氮基)四乙酸(EGTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸、羟乙基乙二胺四乙酸(HEDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)、三乙四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(亚甲基膦酸)(D0TP)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA) ,1, 4, 7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)'N1，N1-双(吡啶_2_基甲基)乙烷-1，2-二胺(ENPy2)以及它们的衍生物。
[0224]在一些实施方案中，诊断剂可以与第二结合配体或在与显色底物接触后生成有色产物的酶(酶标签)连接。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。第二结合配体包括，例如生物素和卵白素或者本领域已知的链霉亲和素化合物。
[0225]在一些实施方案中，诊断剂可以包括光学试剂如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。许多试剂(例如，染料、探针、标记或指示剂)在本领域中已知，并且能用于本发明。(参见，例如 Invitrogen, The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies, Tenth Edition(2005))。突光剂可以包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可以包括但不限于青色素、酞菁、叶啉、靛青、若丹明、吩噁嗪、苯基氧杂蒽、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素、苯并卟啉、方酸、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、口丫唳酮、菲唆、若丹明、H丫唆、蒽醌、硫属元素的吡喃盐(chalcogenopyrylium)类似物、二氢卟吩、萘酞菁、甲川染料、吲哚啉染料、偶氮化合物、奥、氮杂奥、三苯基甲烷染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青以及B0DIPY?衍生物。
[0226]VI1.治疗方法
[0227]可以利用已知的方法将本发明描述的抗-ανβ 8抗体和其ανβ8_结合片段或免疫缀合物给予个体，如静脉内给药，例如，作为大药丸或通过一段时间的连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内、囊内、经口、局部(例如，经皮)或吸入途径。给药可以为局部的或全身的。
[0228]可以给予组合物用于治疗性或预防性治疗。在治疗性治疗中，以“治疗有效量”给予组合物至患有疾病(例如，IBD、癌症、纤维化(肺或肝)、C0PD、哮喘、关节炎等)的患者。对该用途有效的量取决于治疗的病症、给药途径、病况的严重性和患者的整体健康状态。取决于患者所需的和耐受的剂量和频率，可以单次或多次给予组合物给药。可以将本发明描述的组合物给予人和其他动物，特别是哺乳动物。因此，所述方法适用于人治疗和兽医应用。其他已知的癌症疗法可以结合本发明方法使用。例如，例如，根据本发明使用的组合物还可以用于将细胞靶向或敏化至其他癌症治疗剂，如5FU、长春花碱、放线菌素D、顺钼、氨甲蝶呤等。本发明描述的组合·物还可以结合放射疗法或免疫疗法以及当前开发的疗法。
[0229]组合疗法包括利用单独的制剂或单一药剂共给药，以及以其中一种方式连续给药。
[0230]为了测定治疗有效剂量，起初可以将低剂量的抗-ανβ 8抗体(或其α ν β 8结合片段或免疫缀合物)给予个体，并可以逐渐增加剂量直到个体病况开始改善。例如，初始剂量可以为每天约0.001mg/kg至约lmg/kg。如果个体的病况在最低剂量下未改变,可以在较晚的时间点使用约0.0 lmg/kg至约500mg/kg,或约0.lmg/kg至约200mg/kg,或约Img/kg至约100mg/kg,或约10mg/kg至约50mg/kg的每天剂量范围。如上所示，本领域技术人员应当理解在测定治疗有效剂量时必须考虑多个变量。给予患者的剂量应当随时间在患者中足以产生治疗有利的反应。还可以通过特定患者中伴随特定组合物(或组合疗法)给药的任何不利的副作用的存在、性质和程度测定剂量大小。
实施例
[0231]A.实施例1:37E1B5 抗体
[0232]37EU37E1B5和人源化的37E1B5 (h37ElB5或Hu37ElB5)的重链和轻链V区序列显示在图1中。指示了框架和⑶R区。人源化的37E1B5抗体保留了 37E1B5的高亲和力和活性。
[0233]在体外培养中，约200μ g/ml浓度的37E1抑制有活性的成熟TGF^肽的释放。如上文所解释，37E1B5具有高得多的亲和力，并且在皮摩尔范围内具有活性。10μ g/m的37E1B5在体外培养中对抑制有活性的成熟TGFii肽的释放非常有效。
[0234]B.实施例2:11E8和14E5抗体的产生
[0235]11E8和14E5抗体在杂交瘤细胞中产生，通过将SP2/0骨髓瘤细胞与来自特异性免疫的小鼠的淋巴球融合产生所述杂交瘤细胞。通过皮下注射改造形式的分泌的、纯化的整合素α νβ 8免疫小鼠。
[0236]C.实施例3: β 8表位的表征
[0237]将小鼠序列置换入人ITGB8的嵌合整合素β 8构建物被用于定位37Ε1Β5、11Ε8和14Ε5抗体的结合表位。通过抗体结合、细胞表面染色和通过流式细胞术检测定位表位。表位包含在人整合素β 8的氨基酸121-180(相对于SEQ ID NO: 17所示的β 8序列)中。所有3种抗体都结合至人β 8，但未结合至小鼠β8。因此，9个非保守氨基酸差异或7个微小氨基酸差异(在序列的中线中通过+表示的)中的至少一个包含在结合表位中，或以这样的方式影响结构域的3-维结构，以区分小鼠和人蛋白。表位落入整合素β8亚基的β-Ι结构域的称为Psi杂合物和α I螺旋和α I连接臂区域的区域中，并被发现于分子表面上。
[0238]M itgb8 121 GEVSVQLHPGAEANRMVRPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSKKMALY 180
[0239]GEVS碟 PGAEAMMJiV PLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLS+KMA +
[0240]H ITGB8 121 GEVSIQLRPGAEAMMJ(VHPIj(KYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSRKMAFF 180
[0241]SEQ ID N O:1表示人整合素β 8区，其包含37E1B5表位(氨基酸121-180)。SEQID Ν0:2表示同源性鼠序列，其未被37Ε1Β5抗体结合。鼠序列的140位置处的R为多态的，并且还可以为H。比对序列表示为SEQ ID Ν0:3。
[0242]进行了该区域中取代鼠序列为人序列的其他结构域交换研究，以测定那些氨基酸包含在37Ε1Β5表位中。取代整合素β 8的鼠氨基酸125-180显著减少了 37Ε1Β5结合。因此，人整合素β 8上的表位包含选自I125、R128、R175、F179和F180的至少一个氨基酸。
[0243]D.实施例4:11E8抗体的表征
[0244]11E8抗体免疫沉淀分泌的α V β 8，并识别β 8亚基的表位，所述亚基存在于β 8转染的人293胚胎肾细胞和SW480结肠癌细胞上，但未存在与mock-转染的细胞上。
[0245]11E8在ITGB8转染的SW480细胞中特异性阻止α ν β 8_介导的TGF- β激活。如同37Ε1Β5，11Ε8为高亲和力的抗体，并且在非常低的浓度(体外40 μ g/ml为最低测试浓度)下具有TGFii阻止活性。11E8不阻止其他非-β8介导的机制介导的TGF-β激活。
[0246]另外，11Ε8识别存在于福尔马林固定的细胞上的β 8表位，使得其非常适合人组织的定位研究。11Ε8抗体在体外和体内为有活性的，并且可以用作治疗剂，以诱导ανβ8_介导的TGF0活性。11Ε8结合至固定的细胞的能力对以下有用:加速调控认可和挑选患者群(例如，以在开始治疗前确认目标组织中的ανβ8表达)、表征患者群(例如，根据α V β 8表达的定位、对各种治疗剂的反应等)，以及检测疾病进展(例如，在用11Ε8抗体或另一治疗剂治疗的过程中)。
[0247]为了更好地确定11Ε8的表位，用37Ε1Β5进行了竞争性测定。加入未标记的37Ε1Β5抑制结合至ITGB8 (人整合素 β 8)转染的SW480细胞和表达α ν β 8的puro细胞的标记的11E8抗体的结合。结果表明这些抗体的表位显著性重叠。
[0248]获得了 11E8的可变区序列，如SEQ ID NO: 10和11所示。11E8重链的⑶R1-3分别为:SYWIE、DILPGSGTTNYNEKFKG 和 WGWDTY。11E8 轻链的 CDR1-3 分别为:SASQGISNYLN、YTSSLHS、QQYSNLPYT。
[0249]E.实施例5:14E5抗体的表征
[0250]如上文所公开的，14E5抗体识别人而非小鼠整合素β 8，并结合氨基酸120-180中的表位。14Ε5抗体在体外和体内结合表达α V β 8的细胞上的α ν β 8，但不抑制成熟有活性的TGFii的释放。14Ε5抗体可用于诊断应用或患者群体挑选，因为其在FACS测定中以高亲和力结合且效果良好。
[0251]为了更好地界定14Ε5抗体的表位，用37Ε1Β5进行了竞争性测定。加入未标记的37Ε1Β5抗体抑制了结合至ITGB8转染的SW480细胞和表达α νβ 8的puro细胞的标记的14E5抗体的结合。结果表明这些抗体的表位重叠。
[0252]获得了 14E5的可变区序列，如SEQ ID N0:12和13所示。14E5重链的CDR1-3分别为:TYWIE、HILPGSVITNYNEKFKG、WGWDSY。14E5 轻链的 CDR1-3 分别为:STSQDISSSLN、YTSNLHS、QQYSKLPYT。
[0253]F.实施例6:整合素α V β 8在气道重建中的作用
[0254]TGF-β参与炎症和纤维化反应。IL-1 β上调β 8的表达，其在CCffD患者的气道中过表达。设计了 β 8-介导的气道重建的小鼠模型，以测定体内i3 8、TGF-13和IL-1 β的相互作用。结果表明IL-1-β诱导的、β 8-介导的TGF-β激活在气道重建中起关键作用。
`[0255]利用Cre/LoxP系统删除了 C57BL/6小鼠的β 8。气管内的IL-1 β被用作具有一个敲入的(floxed)整合素β 8等位基因和一个敲除的等位基因(Floxed/-)的6_9周大小鼠的炎症模型。经气管内给予有或无Ad-Cre的腺病毒人IL-1 β (Ad-hIL-1 β )或对照腺病毒。
[0256]在胶原I α 2启动子的控制下表达Cre-ER(T)融合重组酶的小鼠被用来证明纤维原细胞在博来霉素诱导的肺纤维化、卵清蛋白诱导的气道重建和Ad-1LlP诱导的气道重建中的ανβ8-介导的TGF-β激活中起主要作用。通过组织学评估气道形态变化。几种炎症性细胞因子在Ad-hIL-Ιβ给予后多个时间点的基因表达揭示出基因的连续诱导，其为炎症反应的特征。
[0257]来自β 8条件性敲除小鼠的结果表明β 8为IL-1 β诱导的瞬时气道炎症和纤维化所必需。在表达β 8的小鼠中给予人IL-1 β引起β8-介导的TGF-β激活、小鼠ccl2和ccl20基因(CC趋化因子配体2和20，其涉及炎症反应)的诱导、树状细胞的补充以及适应性免疫反应的起始和永生化。
[0258]来自条件性整合素β8敲除的数据表明对Ad-hIL-Ιβ和卵清蛋白的减少的炎症和纤维化反应,其导致免于气道重建。因此,靶向β 8减少了气道重建中IL-1 β诱导的和卵清蛋白诱导的TGF-β激活，以及博来霉素诱导的急性肺损伤。
[0259]G.实施例7:抗-整合素β 8减少ColI表达
[0260]减少的ECM产生和增加的纤维原细胞收缩性是气道壁增厚中见到的纤维化反应，以及增加的I型胶原(ColI)和平滑肌肌动蛋白(C1-SMA)的标志。中和性抗_β8被用于评估自分泌ανβ8_介导的TGF-β激活对促纤维化反应的贡献。用阻止抗体的β8处理气道纤维原细胞抑制了 a-SMA表达和ColI分泌，表明α ν β 8_介导的TGF-β激活影响肌成纤维细胞表型。气道纤维原细胞与鳞状化生性人细支气管上皮细胞的共培养引起气道纤维原细胞的ColI蛋白表达的增加，其为IL-Ιβ-和纤维原细胞β8-依赖性的。ColI表达的增加几乎能被使用PSsiRNA进行的气道纤维原细胞转染完全抑制，表明抑制β 8介导的TGF^激活可以减少促纤维化反应和改善纤维化病况。
[0261]H.实施例8 =COPD纤维原细胞的整合素β 8表达
[0262]利用组织染色和原代培养在来自人CCffD患者的肺的纤维原细胞中检测到了整合素β 8表达，并且高于非CCffD组织中的表达。相比来自正常患者的纤维原细胞，从患有特发性肺纤维化的患者分离的纤维原细胞中的整合素β8表达也显著增加。相比正常肺纤维原细胞，COPD纤维原细胞还具有增加的IL-1 β -依赖性整合素α νβ 8蛋白表达。这些数据表明avi3 8SlL-li3活性的下游靶标和病理性介导物。
[0263]本文所述的抗_β 8抗体(例如，37Ε1Β5、14Ε5和11Ε8)可以治疗性和/或诊断性用于其中整合素β 8表达，且IL-1 β和/或TGF-β起病理性作用的疾病。
[0264]1.实施例9:整合素β 8中和抗体减少诱导的气道炎症
[0265]人BAC克隆RP11-431K20被用于产生表达人整合素0 8(ITGB8)的转基因小鼠。使这些小鼠与具有小鼠itgb8的一个功能性等位基因的小鼠繁殖，以产生具有人ITGB8和小鼠itgb8的一个功能性拷贝的小鼠的Fl代。使这些小鼠交叉繁殖以产生F2代，其导致存活的BAC ITGB8,即仅具有人基因拷贝、展示具有人ITGB8的itgb8_/_致死性解救的itgb8-/_ 小鼠。
[0266]这些小鼠被用于诱导利用气管内腺病毒-1L-1 β递送模型的气道重建。在该模型中，具有类似于人慢性阻塞性肺病(COPD)的免疫谱的强大的气道重建被可再生地诱导。 [0267]7mg/kg剂量的37E1B5抗体显著阻止气道炎症，其中支气管肺泡灌洗的中性粒细胞显著减少。组织学上，气道壁炎症和纤维化被37E1B5显著减少。另外，itgb8的纤维原细胞特异性缺失可以显著抑制腺病毒-1L-1 β诱导的气道重建。
[0268]具有itgb8的纤维原细胞-特异性缺失的小鼠还被用于研究过敏性气道重建(卵清蛋白诱导的气道炎症、纤维化和黏液化生)。相比野生型，在itgb8-/_小鼠中重建被极大减少。过敏性模型还依赖于IL-1 β和TGF-β。这些数据表明itgb8在IL-1 β和TGF-β介导的先天性和适应性免疫反应中起作用。IL-1 β造成包括来自气道和肺的纤维原细胞以及星形胶质细胞的多种细胞类型的整合素β 8的增加，并且在小鼠和人中都观察到了 IL-Ιβ诱导的β8表达。
[0269]J.实施例10:人关节软骨细胞表达整合素α V β 8
[0270]从经历慢性骨关节炎的膝盖选择性修复的患者的膝盖关节间隙收获成人关节软骨。使初生软骨组织生长至70%汇合，并通过细胞染色和流式细胞术测定整合素受体表达。使用的抗体为抗-β8(37Ε1Β5)和抗-β6(Ε7Ρ6)的。用37E1B5R检测到了强力染色，且利用Ε7Ρ6未检测到。在TGFP生物测定中，在存在或无抗_β8(37Ε1Β5)或抗-β6下，将初生软骨组织与 TMLC TGFβ 报道子细胞(Annes et al.(2004) J.Cell Biol.165:723)共培养。抗_β8产生了 TGFii激活的强力阻止，而抗-β 6没有产生此类影响。
[0271]结果表明不仅ανβ 8表达于软骨组织中，而且该表达还引起TGF0激活。因此，ανβ 8的抑制可以用于治疗与活化的TGF0相关的软骨病症，如关节炎和滑液纤维化(参见，例如，Bakker et al.(2001)Osteoarthritis andCartilage9:128)。
[0272]K.实施例11:肝星状细胞表达α V β 8
[0273]肝星状细胞为能响应激活的TGF0而产生胶原的可收缩的细胞，以及涉及肝纤维化的薄壁组织细胞类型。肝纤维化具有多个引发子，包括酒精、药物和麻醉药、感染(例如，肝炎B和C)、自身免疫、胆汁淤积(胆汁过剩)，以及非酒精性脂肪型肝炎。
[0274]在上述转基因小鼠(人IGTB8，而非小鼠igtb8)中检测了整合素β 8表达，以确定是否可以利用本文所述的β 8特异性抗体靶向肝中的TGFii活性。
[0275]图2表明显著百分比的肝星状细胞表达β 8，如利用14Ε5抗体所测得的。
[0276]L.实施例12:抗-β 8抗体减少小肠炎症
[0277]在上述表达人IGTB8的转基因小鼠而非小鼠igtb8中观察到炎症性肠病(IBD)症状。症状包括体重减轻和小肠肿大及炎症，以及脊柱侧凸。图3显示了这些小鼠的肠中的免疫细胞的设门筛选(gating)。图3A显示了一般设门筛选参数，而图3B-3E分别显示了⑶4+、⑶8+、B细胞和NK细胞上β 8的表达谱。NK细胞未以可检测的水平表达β 8。来自IGTB8小鼠的肠的树状细胞也显示了 β 8表达。
[0278]因此，IGTB8小鼠被用于测定抗-β 8抗体37Ε1Β5在体内的效应。用3mg37ElB5/kg处理IGTB8转基因小鼠，每周经IP给药两次，给药8周。图4表明用37E1B5抗体处理显著减少与炎症相关的小肠肿大。图5还阐述了抗体治疗的效应，其将取自IGTB8——对照(未处理的)小鼠的肠段与抗体处理的(B5)小鼠的肠段比较。
[0279]M.实施例13:4F1和6B9抗体结合固定的细胞和组织上的人β 8·[0280]杂种瘤克隆4F1和6Β9特异性着染ITGB8BAC转基因(Tg)小鼠的用ITGB8转染的、福尔马林固定的、石蜡包埋的293人胚胎肾细胞和脑。在10%缓冲性福尔马林中将表达人整合素ανβ8的(293Β8)或不表达的(293WT)稳定转染的293细胞固定过夜，使其成团，然后包埋在琼脂糖块(plugs)中，并用于常规组织处理、石蜡包埋和切片。以类似的方式处理来自ITGB8BAC Tg小鼠的脑样品。利用抗原热修复进行免疫染色，并用商品化试剂盒(Dako)检测抗体。使用25 μ g/ml的6B9与102C抗原热修复10分钟。使用50-100 μ g/ml的4F1与95C抗原热修复10分钟。图6的结果表明抗体为β 8特异性的，且能结合固定的组织上的β8。
[0281]对于杂种瘤克隆4F1，将ITGB8BAC Tg或野生型(WT)小鼠的脑或肺在10%缓冲性福尔马林中固定过夜，并用于组织处理、石蜡包埋和切片。利用与上述相同的抗原热修复进行免疫染色，并使用商品化试剂盒检测抗体。结果显示在图7中。
[0282]N.实施例14:抗体6Β9和4F1能够区分具有β 8的不同基因组拷贝数的细胞
[0283]杂种瘤克隆6Β9能够结合至固定的组织上的β 8，并检测拷贝数变化。图8显示了福尔马林固定的、石蜡包埋的ITGB8BAC转基因(Tg)小鼠脑的免疫染色。将ITGB8BAC Tg或WT小鼠的脑在10%缓冲性福尔马林中固定过夜，并用于常规组织处理、石蜡包埋和切片。按上述进行免疫染色。显示了相比WT的Tg小鼠的3个系(B、C和D)，其表达I个拷贝(D--系BAC/WT)、2个拷贝(B和C—-系BAC/WT ;D—-系BAC/BAC)或4个拷贝(B和C—-系BAC/BAC)。
[0284]类似地，源自4F1的可变域的重组单克隆兔IgG能够检测拷贝数变化。图9显示了福尔马林固定的、石蜡包埋的ITGB8BAC转基因(Tg)小鼠肺的免疫染色结果。将ITGB8BACTg或WT小鼠的肺在10%缓冲性福尔马林中固定过夜，并用于组织处理、石蜡包埋和切片。按上述进行免疫染色。显示了相比WT的Tg小鼠的3个系(B、C和D)，其表达I个拷贝(D--系BAC/WT)、2个拷贝(B和C—-系BAC/WT ；D—-系BAC/BAC)或4个拷贝(B和C—-系BAC/BAC)。
[0285]抗体4F1和6B9能够检测分离自BAC ITGB8小鼠的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织中ITGB8的一个和两个拷贝的表达间的差异。因此，这些抗体可潜在地用作诊断剂，以作为治疗性抗体(例如，37E1B5U1E8以及其b8_结合片段和亲和力成熟的变体)的伴侣诊断剂检测增加的b8表达。
[0286]0.实施例15:固定的人病理性肺组织上的β 8的检测
[0287]通过福尔马林固定的、石蜡包埋的人纤维化肺的免疫染色，源自克隆4F1可变域的重组单克隆兔IgG能够检测ανβ8表达。人肺样本获自来自患有气肿和胸膜下瘢痕形成的患者的外科病理学组织。将组织在10%缓冲性福尔马林中固定过夜，并用于组织处理、石蜡包埋和切片。按上述进行免疫染色。结果显示在图10中。箭头所指为梭形细胞的染色，其代表了包埋于密集纤维化结缔组织中的纤维原细胞。
[0288]P.实施例16:6Β9和4F1抗体的表位绘图
[0289]将小鼠序列置换入人ITGB8的嵌合的整合素β 8构建物被用于定位6Β9和4F1抗体的结合表位。通过抗体结合、细胞表面染色和流式细胞术检测定位表位。表位包含在人整合素β 8的氨基酸61-105中。6Β9和4F1抗体结合至人而非小鼠β8。3个非保守基酸差异或2个微小氨基酸差异(在比对序列中通过+指示)中的至少一个包含在结合表位中，或以此类方式影响结构域的3-维结构，以区分小鼠和人蛋白。
[0290]小鼠61 LGPECGWCVQEDFVSGGSGSERCDTVSSLISKGCPVDSIEYLSVH 105
[0291]LGPECGWCVQEDF+SGGS SERCD VS+LISKGC VDSIEY SVH`[0292]人61 LGPECGWCVQEDFISGGSRSERCDIVSNLISKGCSVDSIEYPSVH 105
[0293]SEQ ID NO: 14代表了人整合素β 8区域，其包含所述表位(氨基酸61-105)。SEQID NO: 15代表了同源鼠序列，其不被4F1或6Β9抗体结合。比对序列表示为SEQ ID NO: 16。
[0294]在该区域中进行了氨基酸交换，以确定哪些氨基酸包含在β 8表位中。下表表明人β 8序列的位置95处的丝氨酸残基包含在6Β9和4F1表位中。
[0295]
【权利要求】
1.特异性结合ανβ8的分离的抗体， 其中所述分离的抗体抑制有活性的成熟TGF β肽的释放，但未显著抑制潜态TGF与表达α V β 8的细胞上的α V β 8的粘附；并且 其中所述分离的抗体结合福尔马林固定的表达α νβ8的细胞。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体特异性结合至SEQID NO: KGEVSIQLRPGAEANFMLKVHPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSRKMAFF)内的 β 8 上的表位。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗体，其连接至可检测标记。
4.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体包含:
重链 CDR SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49 和 SEQ ID NO: 50 ;及轻链 CDR SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO:52 和 SEQ ID NO:53 ；
重链 CDR SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:49 和 SEQ ID NO:54;及轻链 CDR SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52 和 SEQ ID NO:55 ；
重链 CDR SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:90 和 SEQ ID NO:54，及轻链 CDR SEQ ID NO:51、52和53 ;或
重链CDR SEQ ID NO: 112,SEQ ID NO: 113和SEQ ID N0:50，及轻链CDR SEQ ID NO: 105、107 和 53。
5.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体为人源化的。
6.特异性结合ανβ8的人源化的抗体， 其中所述抗体抑制有活性的成熟TGFii肽的释放，但未显著抑制潜态TGF与表达ανβ 8的细胞上的ανβ 8的粘附，并且其中所述抗体具有SEQ ID ΝΟ:8的重链可变区和SEQ ID NO:9的轻链可变区。
7.如前述权利要求中任一项所述的分离的或人源化的抗体，其中所述抗体为scFv抗体。
8.药物组合物，其包含处于药学可接受的赋形剂中的前述权利要求中任一项所述的分离的或人源化的抗体。
9.减少个体中TGFii信号转导的方法，包括将权利要求8所述的药物组合物给予个体，从而减少个体中TGFii信号转导。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述个体患有选自以下的至少一种病况:炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、关节炎、肝纤维化、肺纤维化病症、炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病、神经炎症、肾病、腺癌、鳞状癌、胶质癌和乳腺癌，并且其中减少TGFii信号转导引起所述病况的改善。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述个体患有炎症性肠病(IBD)，并且其中减少TGF^信号转导引起IBD的改善。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述个体患有慢性阻塞性肺病(COPD)和/或纤维化肺病，并且其中减少TGFii信号转导引起COD和/或纤维化肺病的改善。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述个体患有关节炎，并且其中减少TGFii信号转导引起关节炎的改善。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述个体患有哮喘，并且其中减少TGFii信号转导引起哮喘的改善。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述个体患有肝纤维化病症，并且其中减少TGFβ信号转导引起肝纤维化的改善。
16.诊断个体中ανβ8相关病症的方法，包括 使来自所述个体的细胞与权利要求1-7中任一项所述的分离的抗体接触，和 检测所述分离的抗体与所述细胞的结合， 其中所述ανβ8相关病症选自:炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、关节炎、肝纤维化、肺纤维化病症、炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病、神经炎症、肾病、腺癌、鳞状癌、胶质癌和乳腺癌，并且 其中所述分离的抗体与所述细胞的结合表明所述个体患有α νβ 8相关病症。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞为固定的。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述接触为体外的。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述接触为体内的。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为炎症性肠病。
21.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述ανβ 8相关病症为关节炎。
22.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述ανβ 8相关病症为肝纤维化。
23.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述ανβ 8相关病症为慢性阻塞性肺病(COPD)和/或纤维化肺病·。
24.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述ανβ 8相关病症为哮喘。
25.如权利要求16-24中任一项所述的方法，还包括将权利要求8所述的药物组合物给予所述个体。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述药物组合物包含权利要求1-5中任一项所述的分离的抗体。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述药物组合物包含权利要求5或6所述的人源化的抗体。
28.特异性结合至ανβ8的分离的抗体，其中所述抗体不抑制有活性的成熟TGFP肽的释放，或潜态TGF β与表达α V β 8的细胞上的α V β 8的粘附。
29.如权利要求28所述的分离的抗体，其中所述抗体特异性结合至SEQID NO: 1(GEVSIQLRPGAEANFMLKVHPLKKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSRKMAFF)中的 β 8 上的表位。
30.如权利要求28或29所述的分离的抗体，其连接至可检测标记。
31.如权利要求28-30中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体为人源化的。
32.如权利要求28-31中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体为scFv抗体。
33.如权利要求28-32中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含:
重链 CDR 序列 SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59 和 SEQ ID NO:60，及轻链 CDR 序列 SEQ IDN0:61、SEQ ID N0:62 和 SEQ ID NO:63 ； 重链 CDR 序列 SEQ ID NO:64、SEQ ID NO: 59 和 SEQ ID NO:60，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:67 ；
重链 CDR 序列 SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59 和 SEQ ID NO:60，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:63 ； 重链 CDR 序列 SEQ ID NO:64、SEQ ID NO: 59 和 SEQ ID NO:60，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:67 ； 重链 CDR 序列 SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO:76 和 SEQ ID NO:60，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:77 ； 重链 CDR 序列 SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:59 和 SEQ ID NO:60，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:80 ；
重链 CDR 序列 SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO:59 和 SEQ ID NO: 60，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:71;或
重链 CDR 序列 SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59 和 SEQ ID NO:60，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:66 和 SEQ ID NO:71。
34.检测表达ανβ 8的细胞的存在的方法，包括使细胞与权利要求28-33中任一项所述的抗体接触，以及测定所述抗体是否结合至所述细胞，其中抗体结合至所述细胞表明表达α νβ8的细胞存在。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述接触为体内的。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述接触为体外的。
37.诊断个体中ανβ8相关病症的方法，包括 使来自所述个体的细胞与权利要求28-33中任一项所述的分离的抗体接触，和 检测所述分离的抗体与所述细胞的结合， 其中所述ανβ8相关病症选自:炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、关节炎、肝纤维化、肺纤维化病症、炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病、神经炎症、肾病、腺癌、鳞状癌、胶质癌和乳腺癌，并且 其中所述分离的抗体与所述细胞的结合表明所述个体患有α νβ 8相关病症。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述接触为体内的。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述接触为体外的。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为炎症性肠病。
41.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为关节炎。
42.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为肝纤维化。
43.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为哮喘。
44.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为慢性阻塞性肺病(COPD)和/或纤维化肺病。
45.如权利要求37-44中任一项所述的方法，还包括将权利要求8所述的药物组合物给予所述个体。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述药物组合物包含权利要求1-5中任一项所述的分离的抗体。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述药物组合物包含权利要求6所述的人源化的抗体。
48.特异性结合至ανβ8的分离的抗体，其中所述抗体不抑制有活性的成熟TGFβ肽的释放，或潜态TGF β与表达α V β 8的细胞上的α V β 8的粘附，并且其中所述抗体结合福尔马林固定的表达ανβ8的细胞。
49.如权利要求48所述的分离的抗体，其中所述抗体特异性结合至SEQID NO: 14内的β 8上的表位。
50.如权利要求48或49所述的分离的抗体，其连接至可检测标记。
51.如权利要求48-50中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体为人源化的。
52.如权利要求48-51中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体为scFv抗体。
53.如权利要求48-52中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含: 重链 CDR 序列 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44 和 SEQ ID NO:45 ； 重链 CDR 序列 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:46 和 SEQ ID NO:42，及轻链 CDR 序列 SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44 和 SEQ ID NO:45 ；
重链 CDR 序列 SEQ ID NO: 116,SEQ ID NO: 117 和 SEQ ID NO: 118，及轻链 CDR 序列 SEQID NO:119、SEQ ID NO:120 和 SEQ ID NO:121。
54.检测表达ανβ 8的细胞的存在的方法，包括使细胞与权利要求48-53中任一项所述的抗体接触，以及测定所述抗体是否结合至所述细胞，其中抗体结合至所述细胞表明表达α νβ8的细胞存在。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述接触为体内的。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述接触为体外的。
57.诊断个体中ανβ·8相关病症的方法，包括 使来自所述个体的细胞与权利要求48-53中任一项所述的分离的抗体接触，和 检测所述分离的抗体与所述细胞的结合， 其中所述ανβ8相关病症选自:炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、关节炎、肝纤维化、肺纤维化病症、炎症性脑自身免疫病、多发性硬化、脱髓鞘病、神经炎症、肾病、腺癌、鳞状癌、胶质癌和乳腺癌，并且 其中所述分离的抗体与所述细胞的结合表明所述个体患有α νβ 8相关病症。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述接触为体内的。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述接触为体外的。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为炎症性肠病。
61.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为关节炎。
62.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为肝纤维化。
63.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为哮喘。
64.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述ανβ8相关病症为慢性阻塞性肺病(COPD)和/或纤维化肺病。
65.如权利要求57-64中任一项所述的方法，还包括将权利要求8所述的药物组合物给予所述个体。
66.如权利要求65所述的方法,其中所述药物组合物包含权利要求1-5中任一项所述的分离的抗体。
【文档编号】C07K16/00GK103857696SQ201280048486
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年8月17日 优先权日:2011年8月17日
【发明者】斯蒂芬·尼什穆拉, 楼建龙, 乔迪·林恩·巴荣, 詹姆士·马可斯 申请人:加利福尼亚大学董事会