一种甘草蛋白纳米颗粒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘草蛋白及其纳米颗粒的制备方法。经过分离纯化获得了一个分子量为31.0kDa、等电点为4.5的甘草蛋白，该甘草蛋白的N-端一级结构序列为NPDGLIACYCGQYCW。该甘草蛋白的盐溶液在蛋白浓度为1mg/mL，pH7.9条件下，经过100℃加热60min后，制备得到甘草蛋白纳米颗粒，其平均粒径为74.09±0.69nm。甘草蛋白纳米颗粒冻干品流动性佳，复溶性好，易于稳定保存。本发明涉及的甘草蛋白来源于食品，安全性高。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用甘草的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。本发明涉及的甘草蛋白纳米颗粒有望应用于多种药物的体内递送。
【专利说明】一种甘草蛋白纳米颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】中的蛋白药物新剂型和制剂技术，具体涉及到一种具有体内药物递送作用的甘草蛋白纳米颗粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]依据美国国家纳米科技启动计划(NationalNanotechnology Initiative, NNI)中的定义，粒径在1-100 nm尺度范围内的颗粒称为纳米颗粒。近几十年来,纳米颗粒被大量应用于药物运输体系的开发研究中，其中包括金属聚集体、无机颗粒、超支化聚合物、聚合物胶束等各种不同材料制备的纳米药物载体。在各种纳米药物载体在逐渐展现靶向性和穿透性等优点的同时，也暴露出在生物相容性、细胞毒性和可降解性方面的缺点。经过材料的纳米化后，纳米材料的物化性质(光学、电学、表面活性等)均会呈现与原始材料截然不同的性质。目前应用与纳米药物载体研究的生物大分子(如血清白蛋白、丝蛋白等)皆没有可以参照的天然研究模型，获得纳米颗粒的物化性质及其相关生物安全性也需要长期的观测，才能得到全面评估。纳米药物载体发展带来的潜在风险引起了科学界广泛的担忧。
[0003]“汤”给生物大分子自组装纳米颗粒提供了丰富的研究模型:从食品到中药，许多汤中都存在胶体体系，河蚬汤的胶体颗粒较为均一，平均粒径为78 nm;苦瓜汤中的胶体颗粒组成较为复杂，平均粒径分布范围较大，其中间值为347 nm ;对几十种中药汤剂的胶体学调查也表明纳米尺度的颗粒在中药汤剂中的广泛存在。这些在汤中存在的天然纳米颗粒与蛋白质，特别是非酶促糖基化的蛋白质的自组装行为密切相关。各种汤在人类历史上饮用的时间之长、受众之广，从风险管 理的角度可以被认为是安全的(Generally Recognizedas Safe，GRAS)。对汤的煎煮过程中自组装形成的纳米颗粒的研究可以解决现阶段纳米药物载体研究缺乏研究原型和对安全性担忧方面的问题。
[0004]甘草是一种我国人民长期使用的食品原料和中药药材，在卫生部公布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》中被列入“药食同源”的原料中。甘草在中药汤剂，特别是中药复方汤剂中具有非常重要的用途。甘草可以“调和诸药”，如在麻杏石甘汤中，“益气和中，与石膏合而生津，并能调和于寒温宣降之间，是为佐使之用”。甘草作为使药，或称为“引经药”，用现代科学的语言表述，它可能起到的作用是集合方药中的各种有效成分，实现体内递送的作用。
[0005]但是到目前为止，有关甘草蛋白纳米颗粒的研究国内外尚未见文献报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种甘草蛋白纳米颗粒及其制备方法。针对化合物在纳米化后，在安全性上的不确定性，本发明涉及的甘草蛋白纳米颗粒的设计从两个“天然”体系出发:一是天然存在于食品中的蛋白质成分，二是该蛋白质的纳米化过程发生在热加工过程，其纳米颗粒存在于各种“汤”中被广泛服用。本发明得到的甘草蛋白纳米颗粒体外细胞实验显示了极低毒性，药物装载能力强，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好。[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种甘草蛋白，其N-端一级结构序列为SEQ ID NO:1:NPDGLIACYCGQYCW。
[0008]所述的甘草蛋白分子量为31.0 kDa、等电点为4.5。
[0009]一种甘草蛋白的提取方法，经过磷酸盐缓冲液水相抽提，离子交换色谱Macro-Prep High Q和疏水色谱POROS Rl,从甘草中药饮片中分离得到一个电泳纯的甘草蛋白。其具体包括以下步骤:
1)甘草蛋白粗提液的制备:甘草饮片经小型高速粉碎机粉碎，以质量比1:5将甘草粉末和含0.1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液(0.02 mol/L、pH7.2)混合均匀，置于3-5 °C，搅拌浸提10-14 h ;用1-3层纱布过滤得到的甘草浸提液，弃去滤渣，将滤液在3-5 °C下经10000-12000g离心10-20 min，收集上清液；将上清液置于3_5°C，用氨水调至pH9.5-10.5，边搅拌边缓慢预冷的无水乙醇，使乙醇终浓度达到40%;静置3-5 h，以10000-12000 g离心10-20 min,收集上清液；继续向上清液缓慢加入预冷的无水乙醇至乙醇质量分数为50%，静置10-12 h,11000-13000 rpm离心10-20 min，收集沉淀；沉淀用Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L、pH8.0)充分溶解后以相同浓度Tris-盐酸缓冲液透析过夜，得到的溶液即为甘草蛋白粗提液；
2)甘草蛋白的离子交换色谱分离:将70-80mL甘草蛋白初提液流加至以Tris-盐酸缓冲液(0.02 mol/L、pH8.0)平衡 Macro-Pr印 High Q 色谱柱(Bio-RAD 公司，柱体积:10*250mm),以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0~0.5 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液(0.02 mol/L、pH8.0)线性梯度洗脱200 mL，最后用含0.5 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液(0.02 mol/L、pH8.0)洗脱I个柱体积，流速I mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；
3)甘草蛋白的疏水色谱分离:将`经High-Q分离且透析过的G2蛋白组分进一步用疏水色谱 P0R0S0R1 进行纯化，P0R0S Rl 疏水色谱柱(Applied Biosystems, 10 u m, 2.1*100mm)以去离子水平衡，洗脱流动相为:A去离子水，B乙腈，以100%A_100% B线性梯度进行梯度洗脱。流速1.0 mL/min,上样量:5 mL,紫外检测波长280 nm,经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；
4)甘草蛋白的基本性质表征:以SDS-PAGE测定该经纯化得到的甘草蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该甘草蛋白的等电点，以Edman degradation测定该甘草蛋白的N-端一级结构序列。
[0010]一种甘草蛋白纳米颗粒，由所述甘草蛋白组成，23个甘草蛋白单体形成一个球状的蛋白纳米颗粒，该纳米颗粒其平均粒径为74.09±0.69 nm,表面电荷呈负性，范围在-23±2mV。
[0011]所述的甘草蛋白纳米颗粒的制备方法包括:将该甘草蛋白配制为I mg/mL的pH7.9-8.0盐溶液，经过60-100°C加热I小时，应用TSK gel G6000PW凝胶色谱去除未反应的甘草蛋白，即获得甘草蛋白纳米颗粒。其具体步骤包括:将该甘草蛋白配制为I mg/mL的pH7.9-8.0盐溶液，经过60-100°C加热I小时，应用TSK gel G6000PW凝胶色谱去除未反应的甘草蛋白，即可获得甘草蛋白纳米颗粒。，并应用动态光散射技术动态光散射、多角度激光光散射和电子扫描显微镜对甘草蛋白纳米颗粒进行性质研究，本发明制备得到的甘草蛋白纳米颗粒平均粒径为74.09±0.69 nm，表面电荷呈负性，zeta电位值为-23±2 mV。
[0012]以该甘草蛋白为载体制备的黄芪甲苷-甘草蛋白纳米颗粒，平均粒径为74.09±0.69 nm，装载率为 51.2%。
[0013]甘草蛋白纳米颗粒在体外均显示了极低的细胞毒性，并对不同细胞株，如Hep_G2，Caco-2，L02和NR8383显示了不同的细胞亲和性。
[0014]所述的盐溶液为Tris-盐酸溶液或磷酸盐溶液。
[0015]本发明的优点在于:本发明涉及的甘草蛋白来源于食品，安全性高。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用甘草的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。本发明得到的甘草蛋白纳米颗粒体外细胞实验显示了极低毒性，药物装载能力强，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好。涉及的甘草蛋白纳米颗粒有望应用于多种药物的体内递送。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1甘草蛋白粗提液离子交换色谱及SDS-PAGE电泳图。
[0017]图2甘草蛋白粗提液离子交换收集各色谱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M表示为蛋白 Maker。
[0018]图3甘草蛋白疏水色谱及SDS-PAGE电泳图。
[0019]图4甘草蛋白疏水色 谱收集得到各色谱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M表示为蛋白Maker。
[0020]图5甘草蛋白纳米颗粒的电镜观察图。其中A表示0.22 醋酸纤维素膜空白对照；B表示甘草蛋白纳米颗粒。
[0021 ] 图6甘草蛋白纳米颗粒粒径分布图。
[0022]图7甘草蛋白纳米颗粒细胞毒性，其中L-02为正常肝细胞、Hep-G2人肝癌细胞、Caco-2为人结肠癌上皮细胞及MDCK为狗肾上皮细胞。
[0023]图8甘草蛋白纳米颗粒细胞结合特异性，其中L-02为正常肝细胞、Hep_G2人肝癌细胞、Caco-2为人结肠癌上皮细胞及MDCK为狗肾上皮细胞。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:甘草蛋白的提取
甘草饮片经小型高速粉碎机粉碎。以质量比1:5将甘草粉末和含0.1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液(0.02 mol/L、pH7.2)混合均匀，置于4 °C，搅拌浸提12 h。用二层纱布过滤得到的甘草浸提液，弃去滤渣。将滤液在4 °C下经10，000 g离心15 min，收集上清液。将上清液置于4°C下，用氨水调至pH10.0，边搅拌边缓慢预冷的无水乙醇，使乙醇终浓度达到40%。静置4 h，以10，000 g离心15 min，收集上清液。继续向上清液缓慢加入预冷的无水乙醇至乙醇浓度为50%，静置12 h，12000 rpm离心15 min，收集沉淀。沉淀用Tris-盐酸缓冲液(0.02 mol/L、pH8.0)充分溶解后以相同浓度Tris-盐酸缓冲液透析过夜，得到的溶液即为甘草蛋白粗提液。
[0025]将甘草蛋白粗提液流加至以Tris-盐酸缓冲液(0.02 mol/L、pH8.0)平衡Macro-Prep High Q色谱柱(Bio-RAD,柱体积:10*250 mm),以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含O~0.5 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液(0.02 mol/L、PH8.0)线性梯度洗脱200 mL，最后用含0.5 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液(0.02 mol/L、pH8.0)洗脱I个柱体积。甘草蛋白粗提液High Q色谱图及各组分SDS-PAGE电泳图见附图1、2。
[0026]将经High-Q分离且透析过的G2蛋白组分进一步用疏水色谱进行纯化。P0R0S0R1疏水色谱柱(Applied Biosystems, 10 u m, 2.1*100 mm)以去离子水平衡。洗脱流动相为:A去离子水，B乙腈，以100%A-100% B线性梯度进行梯度洗脱。洗脱得到的蛋白质组分M5为电泳纯的甘草蛋白，甘草蛋白粗提液P0R0S Rl色谱图及各组分电泳图见附图3、4。
[0027]甘草蛋白基本生化性质，其特征为分子量31.0 kDa、等电点为4.5，N_端一级结构序列为 NPDGLIACYCGQYCW。
[0028]实施例2:甘草蛋白纳米颗粒的制备
将该甘草蛋白配制为I mg/mL的Tris-盐酸缓冲液(pH 7.9)，经过60_100°C加热I小时，应用TSK gel G6000PW凝胶色谱去除未反应的甘草蛋白，即可获得甘草蛋白纳米颗粒。甘草蛋白纳米颗粒电镜观察图见附图5。
[0029]用激光粒度仪测定其粒度及表面电位，测得其粒径为74.09±0.69 nm，表面电位为-23±2 mV。甘草蛋白纳米颗粒粒度分布图见附图6。
[0030]实施例3:甘草蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性测定
采用了正常肝细胞(L-02)、人肝癌细胞(Ifep-G2)、人结肠癌上皮细胞(Caco-2)及狗肾上皮细胞(MDCK)测定甘草蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性。细胞皆使用含20%小牛血清RPMI1640培养液，于37°C，5% C02培养环境中培养。测定时，细胞按4X IO4个/mL接于96孔板，200 UL /孔，每 组设6个平行孔。培养24小时，弃去培养基，将已倍比稀释后的样品以每孔100 iiL量加入。同时加不含血清的培养基100 UL，用做空白对照。继续培养24h后以MTT法测定细胞增殖率，计算公式如下:
存活率=(A590加样组-A590空白组)/A590空白组X 100%
甘草蛋白纳米颗粒细胞毒性试验表明，除了 Caco-2细胞外，纳米颗粒浓度低于224ug/mL对并不会抑制并不会抑制细胞的增值。Caco-2细胞生长增值低,可能是高浓度的纳米颗粒抑制了 Caco的吸收代谢所致。甘草蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性见附图7。
[0031]实施例4:甘草蛋白纳米颗粒的细胞亲和性测定
将100 u L异硫氰酸荧光素(10 mg/mL)染液加入4 mL甘草颗粒样品中，于4°C暗室静置24 h进行标记。使用S印hadex G25除去游离的FITC后得到标记的甘草蛋白纳米颗粒样品。
[0032]细胞按4X IO5个/孔接入细胞培养板，0.75 mL/孔，将已标记的甘草蛋白纳米颗粒液加入孔中。其他孔加入不含血清培养基0.75 mL，用作空白对照。避光、37 °C、5% C02、培养24 h。避光弃去上清，PBS清洗3次，加入0.75 mL不含血清培养基，置于激光扫描共聚焦显微镜下(放大倍数200*)观察。
[0033]该实验显示甘草蛋白纳米颗粒能结合到上述4种细胞表面，但结合程度用明显差异，与来源于肺部的巨噬细胞NR8383细胞结合最为强烈。甘草蛋白纳米颗粒的细胞亲和性的激光扫描共聚焦显微镜观察见附图8。
[0034]实施例5:甘草蛋白纳米颗粒装载黄芪甲苷能力测定精确配制10 mg/mL的黄芪甲苷标准液(溶于色谱纯的甲醇)，取50 标准液加入1.995 mL甘草蛋白样品中，使得黄芪甲苷终浓度为0.25 mg/mL。取含有0.25 mg/mL黄芪甲苷和不含黄芪甲苷的甘草蛋白液体各1.6 mL，于100°C下保温60 min。取含黄芪甲苷(0.25mg/mL)的甘草蛋白I mL,加入100 kDa超滤管25°C,5000 g离心60 min。加入Tris-盐酸(0.02 mol/L, pH8.0)1 mL,反复冲洗超滤管上部样品池后,5000 g离心60min,待液体完全透过超滤膜后，测定黄芪甲苷含量，即为游离黄芪甲苷含量。药物装载率计算公式如下:装载率=(总AST含量-游离AST含量)/总AST含量经测定，在上述实验条件下甘草蛋白对黄芪甲苷装载率为51.2%。
[0035]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。`
【权利要求】
1.一种甘草蛋白，其特征在于:所述甘草蛋白的N-端一级结构序列为SEQ ID N0:1:NPDGLIACYCGQYCW。
2.根据权利要求1所述的一种甘草蛋白，其特征在于:所述的甘草蛋白分子量为31.0kDa、等电点为4.5。
3.—种如权利要求1所述的一种甘草蛋白的提取方法，其特征在于:经过磷酸盐缓冲液水相抽提，离子交换色谱Macro-Pr印High Q和疏水色谱POROS R1，从甘草中药饮片中分离得到一个电泳纯的甘草蛋白。
4.一种甘草蛋白纳米颗粒，其特征在于:甘草蛋白纳米颗粒由权利要求1中所述甘草蛋白组成，23个甘草蛋白单体形成一个球状的蛋白纳米颗粒，该纳米颗粒其平均粒径为74.09±0.69 nm，表面电荷呈负性，范围在-23±2 mV。
5.一种如权利要求4所述的一种甘草蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述的甘草蛋白纳米颗粒的制备方法包括:将该甘草蛋白配制为I mg/mL的pH 7.9-8.0盐溶液，经过60-100°C加热I小时，应用TSK gel G6000PW凝胶色谱去除未反应的甘草蛋白，即获得甘草蛋白纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的一种甘草蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述的盐溶液为Tris-盐酸溶液或磷酸盐溶液。`
【文档编号】C07K14/415GK103739688SQ201310738014
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】刘树滔, 髙观祯, 汪惠勤 申请人:福州大学