专利名称：：取代苯甲酰胺的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种取代苯甲酰胺，优选卤代苯甲酰胺的制备方法。本发明更具体地涉及通过生物水解制备2，6-二氟苯甲酰胺的方法。2，6-二氟苯甲酰胺是一种用于制备杀虫剂产品，尤其是除虫脲的已知中间体(参见GB-A-1324293)。通过化学合成途径制备2，6-二氟苯甲酰胺存在着问题，这是因为2，6-二氟苄腈的水解是在极其酸性的介质中，具体如在60％浓硫酸存在下进行。事实上不但收率不是很高，不超过80％，而且这种方法令人不满意之处还在于因生成大量盐类副产物，从而造成污染并使纯化困难且成本高。此外，业已发现由于使用大量硫酸，致使需要采取中和步骤。此外，FR-A-2294999公开了一种通过生物水解完成的酰胺类水解方法。所以，按照Bergey所述通过在短杆菌属细菌的作用下水解苄腈可以得到苯甲酰胺。但应注意，R312菌株的活性对于脂肪族腈类是特异性的因此它对苄腈的活性较低(60μmol/h.mg酶)，由于生产效率极低，使其无法适应工业化生产。出乎意料的是，业已发现在酶的作用下，优选在短杆菌属细菌且更优选在R312菌株及其突变株A4的作用下2，6-二氟苯甲酰胺可被水解。具体而言，本发明的主题是一种通过酶促水解取代苄腈来制备取代苯甲酰胺的方法，其特征在于在结构为α2β2的四聚体酶存在下取代苄腈发生水解，所述四聚体酶具有至少50％，优选高于80％的同源性且具有下列氨基酸序列-α链MSVTIDHTTENAAPAQAPVSDRAWALFRALDGKGLVPDGYVEGWKKTFEEDFSPRRGAEL60VARAWTDPEFRQLLLTDGTAAVAQYGYLGPQGEYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAWP119ILGLPPTWYKSFEYRARVVREPRKVLSEMGTEIASDIEIRVYDTTAETRYMVLPQRPAG178TEGWSQEQLQEIVTKDCLIGVAIPQVPTV207-β链MDGVHDLAGVQGFGKVPHTVNADIGPTFHAEWEHLPYSLMFAGVAELGAFSVDEVRYV58VERMEPRHYMMTPYYERYVIGVATLMVEKGILTQDELESLAGGPFP104LSRPSESEGRPAPVETTTFEVGQRVRVRDEYVPGHIRMPAYCRGRVGTI153SHRTTEKWPFPDAIGHGRNDAGEEPTYHVKFAAEELFGSDTDGGSVVVDLFEGYLEPAA212在本申请中，氨基酸的缩写与本
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惯用的含义相对应，并且具体公开在AlbertL.Lehinger等人所著的《生物化学原理》(第2版，F1ammarion医学科学出版社，113页)中。具体而言，它们是指甘氨酸＝G，丙氨酸＝A，缬氨酸＝V，亮氨酸＝L，异亮氨酸＝I，脯氨酸＝P，苯基丙氨酸＝F，酪氨酸＝Y，色氨酸＝W，丝氨酸＝S，苏氨酸＝T，半胱氨酸＝C，甲硫氨酸＝M，天冬酰胺＝N，谷氨酰胺＝Q，门冬氨酸＝D，谷氨酸＝E，赖氨酸＝K，精氨酸＝R，组氨酸＝H本申请中的术语“取代”是指，在苄腈类起始反应物中，芳环上5个氢原子中的至少一个被非氢原子取代。具体可以被卤素、碳、氧或氮原子取代。根据本发明，通过生物水解可以完全令人满意的方式制备2，6-二氟苄腈。由于在现有技术中，酶促水解苄腈似乎很困难，所以2，6-二氟苄腈恐怕无法被生物水解。人们尚无法预见可以水解2，6-二氟苄腈且获得良好的水解效果。根据本发明方法，取代苄腈，优选2，6-二氟苄腈在具有上述定义氨基酸序列的酶存在下水解。根据本发明，既可以使用含有所述酶的微生物细胞，也可以采用非细胞酶的制剂，但在后一情况中，由于必需进行酶的提取，致使生产成本增高。在本申请中，术语“酶”应代表表达酶的细胞以及分离的酶。优选使用细胞而不是分离的酶。所述酶可以得自短杆菌属微生物，更具体地可以得自短杆菌R312菌株或其突变株短杆菌spA4。R312菌株及其突变株A4属于公知并且尤其被公开在FR-A-2294999中和NicolasBernet呈交给蒙勃里耶国立高等农艺学校的论文(1989年6月30日)中。R312和A4在荷兰voorShimmel培养物保藏中心以保藏号CBS71773和CBSLMD792保藏。所述突变株的特征在于，该菌株丧失了水解多数酰胺类的能力，但同时却保留下与野生型短杆菌sp.R312菌株相同的腈水合酶活性。通过在含有碳源如葡萄糖、磷酸盐和氨、镁和亚铁离子的培养基中进行培养可以得到短杆菌菌株。上述培养基可以富含有机氮源如酵母提取液或胨。所述酶或菌株通过聚集可以被固定在例如载体如二氧化硅上或凝胶中，这同样属于本发明范围。载体固定技术对于本领域技术人员来说是已知的，并且具体可以参考GordonF.Bickerstaff的著作《酶和细胞的固定方法》。本发明优先适用于水解2，6-二氟苄腈，但本发明方法也可采用更具体地对应于下式(I)的取代苄腈类的其它反应物式(I)中R1表示氢原子，卤素原子，优选氟、氯或溴原子，或卤代烷基，优选全氟代烷基，或任何其他基团R，R2与R1相同或不同，表示氢原子，卤素原子，优选氟、氯或溴原子，或卤代烷基，优选全氟代烷基，或任何其他基团R，R1和R2中至少一个不是氢原子，n等于1-4。本发明方法优选的并且是卤代苄腈类的反应物更具体地如式(Ia)所示式(Ia)中R1表示卤素原子，优选氟、氯或溴原子；或卤代烷基，优选全氟代烷基，R2与R1相同或不同，表示氢原子；卤素原子，优选氟、氯或溴原子；或卤代烷基，优选全氟代烷基，或任何其他基团R，n等于1-4。在式(I)和(Ia)中，具有一个或多个R1和R2基团位于氰基的邻位、对位或间位。优选基团R1和R2位于氰基的邻位。R1和R2表示卤素原子，但也可表示优选含有1-12个碳原子和1-7个卤素原子的卤代烷基。优选的基团是含有1-5个碳原子且优选含有1-7个卤素原子的全卤代烷基，优选全氟代烷基。作为卤代烷基的更具体实例，可提及氟代烷基，例如氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、氟代乙基、1，1，1-三氟乙基、五氟乙基、氟代丙基、氟代丁基或三氟戊基。优选三氟甲基。式(I)中的基团R1和R2以及式(Ia)中的基团R2可以具有符号R所示的其它含义。基团R可以具备任一种特性，条件是R不干扰水解反应。例如，可以提及羟基；含有1-6个碳原子，优选含有1-4个碳原子的烷基或烷氧基；氨基或被一个或两个含有1-6个碳原子，优选1-4个碳原子的烷基所取代的氨基。优选的化合物是其中R1代表氟原子、氯原子或三氟甲基同时R2与R1相同或不同地表示氢原子、氟原子、氯原子或三氟甲基的式(I)或(Ia)所示化合物。作为适用于本发明方法的式(I)或(Ia)反应物的例子，可以提及-邻羟基苄腈，-对羟基苄腈，-邻甲氧基苄腈，-对甲氧基苄腈，-邻溴代苄腈，-邻氯代苄腈，-对氯代苄腈，-间氯代苄腈，-间三氟甲基苄腈，-2，6-二氯苄腈，-2，6-二氟苄腈，-对甲基苄腈，-对氨基苄腈，在式(I)或(Ia)所示化合物中，优选的反应物是2，6-二氟苄腈和间三氟甲基苄腈。根据本发明方法，取代苄腈，优选2，6-二氟苄腈在所述酶存在下进行水解。该反应在经缓冲的含水介质中完成。在本发明方法的一个优选实施方案中，反应原料含有高达3mol/l苄腈反应物。以干细胞重量计，微生物的存在浓度是1-50g/l，优选2-10g/l。反应物介质已被缓冲，优选pH在6-8的范围内且更优选约为7。为了获得预期的pH，可以参见文献，具体如Rex.M.C，Davison等人所著的《(生物化学研究数据》(第3版，牛津科学出版社，1986，第432页)。在本发明方法中，采用常规方法，具体地相对于每升尤其是由磷酸氢钾钠制成的溶液含有1-500mmolPO4＝离子的磷酸盐缓冲溶液。为了在操作温度下获得预期的pH，借助适宜浓度的氢氧化钠或碳酸氢钠缓冲液将pH调至适当水平。事实上，本发明方法简便并且易于实施。在搅拌下，将反应物和分离形式的或微生物细胞载带的酶加入到被调至适当pH的缓冲介质中。加热适宜在10℃-40℃，优选10℃-30℃的范围内进行。反应温度需维持一段时间，通常是4小时-20小时。当反应结束时，得到沉淀形式的取代苯甲酰胺，优选卤代苯甲酰胺。以常规方式按照液体/固体的惯用分离技术，优选通过过滤进行回收。如果需要，用适当的有机溶剂进行提纯。本发明方法的优越性在于可以通过不生成任何盐类化合物且生产效率高的水解方法制得苯甲酰胺。下列实施例举例说明但不限定本发明。在实施例中，缩写具有以下的含义-DFBN＝2，6-二氟苄腈-DFBZ＝2，6-二氟苯甲酰胺-DC＝干细胞实施例1细胞的生产在下列培养基中培养能够产生腈水合酶的微生物短杆菌sD.A4-缓冲液(Na2HPO4/KH2PO4)pH750mmol/l-FeSO4·7H2O0.01g/l-MgSO4·H2O0.5g/l-盐酸硫胺0.002g/l-葡萄糖10g/l-NH4Cl5g/l分别制备含有不同组分的水溶液并且利用高压灭菌法灭菌，但铁溶液和硫胺溶液通过过滤法灭菌(微孔滤膜，HA型，0.45μm)。用于短杆菌sp.A4的高密度细胞培养的制得的培养基含有上述基础培养基并补充Difco酵母提取液和葡萄糖。短杆菌sp.A4在锥形瓶中进行培养，培养物填充到锥形瓶体积的五分之一处，以确保培养基换气。在28℃下，这些锥形瓶在工作台上以150rpm振荡搅拌(振幅5cm)。首先，用Columbia培养基制备的(Difco)琼脂皿被接种上存在于液氮中的细胞原种。第一预培养物是用培养皿在50ml培养基中制备。约20小时后，接种第二培养物。15小时后这种培养达到指数生长期。为了获得更多细胞，其生产是在2升的发酵罐内进行。培养参数设定如下-pH7-氧的分压调整至50％在持续搅拌下，通过打开进气阀来调整分压。阀门最大开至1.5vvm，以便不造成换气过度；-搅拌开始时300rpm(在发酵过程中加速)；-温度28℃。细胞的回收将细胞离心，用生理盐水或含有20％甘油的生理盐水洗涤，再次离心。以两条不同途径冷冻细胞-将细胞加入到0.1mol磷酸缓冲液中，均匀地分布在微量离心管中，随后在-30℃下储藏；-将细胞团制剂冷冻在液氮中并储藏在-80℃的冰箱中。对干重的评估从指定体积培养物得到一定量的细胞，用蒸馏水洗涤并悬浮在蒸馏水中，将悬浮液在100℃的巴氏杀菌器内加热过夜以除去全部痕量水分。得到指定体积的细胞的干重。实施例22，6-二氟苯甲酰胺的制备将按照Rex.M.C.Davison等人的《生物化学研究数据》(第3版，牛津科学出版社，1986，432页)制备的0.1mol、pH为7的磷酸缓冲液加入反应器中。再加入35℃的液体DFBN并在介质中结晶，结晶粘着在反应器底部。搅拌加快至500rpm以便使其悬浮并打碎较大的晶粒。在t＝0时加入细胞悬浮液并将搅拌速率设定在500-600rpm。在试验过程中密封反应器。所用容器是一种用搅拌体系进行充分搅拌的反应器，所述搅拌体系包括浆叶和平衡桨叶。借助恒温槽调节温度。操作条件和结果如表(I)所列</tables>2.5g/l或5g/l的干细胞浓度在6个小时反应时间内产生最佳活性。为了在6个小时内、于受控pH的培养基中获得浓度为1.5mol的酰胺，需要5g/l干细胞。实施例3反应产物的作用首先，将不同浓度的粉末酰胺引入到0.1mol/lpH7的磷酸盐缓冲液中，向其中加入5.3g/l短杆菌sp.A4的干细胞。在30℃下的1个小时中，在0.5、1、2、3或4mol/DFBZ存在下测定DFBZ(开始时815mmol)的水解活性，其结果如表(II)所示表(II在高浓度反应产物(DFBZ)存在下，短杆菌菌株的活性几乎未受到不利影响。实施例4分离酶的活性在30℃和搅拌下，令菌株或酶与DFBZ(500-900mmol/l)接触1小时。所得活性如表(III)所示实施例53-三氟甲基苯甲酰胺的制备将按照Rex.M.C.Davison等人的《(生物化学研究数据》(第3版，牛津科学出版社，1986，432页)制备的0.1mol、pH为7的磷酸盐缓冲液加入管中。以300mmol/l的比例向磷酸盐缓冲液中加入间三氟甲基苄腈。在t＝0时，加入细胞悬浮液(最终的反应体积＝1ml)并将搅拌速率设定在500-600rpm。反应温度为30℃。在1小时内，用2g/l干细胞可以将全部腈水解为酰胺。权利要求1.通过酶促水解取代苄腈制备取代苯甲酰胺的方法，其特征在于取代苄腈在结构为α2β2的四聚体酶存在下水解，所述酶具有至少50％，优选高于80％同源性并且具有以下氨基酸序列-α链MSVTIDHTTENAAPAQAPVSDRAWALFRALDGKGLVPDGYVEGWKKTFEEDFSPRRGAEL60VARAWTDPEFRQLLLTDGTAAVAQYGYLGPQGEYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAWP119ILGLPPTWYKSFEYRARVVREPRKVLSEMGTEIASDIEIRVYDTTAETRYMVLPQRPAG178TEGWSQEQLQEIVTKDCLIGVAIPQVPTV207-β链MDGVHDLAGVQGFGKVPHTVNADIGPTFHAEWEHLPYSLMFAGVAELGAFSVDEVRYV58VERMEPRHYMMTPYYERYVIGVATLMVEKGILTQDELESLAGGPFP104LSRPSESEGRPAPVETTTFEVGQRVRVRDEYVPGHIRMPAYCRGRVGTI153SHRTTEKWPFPDAIGHGRNDAGEEPTYHVKFAAEELFGSDTDGGSVVVDLFEGYLEPAA2122.权利要求1的方法，其特征在于取代苄腈如下式(I)所示式(I)中R1表示氢原子，卤素原子，优选氟、氯或溴原子，或卤代烷基，优选全氟代烷基，或任何其他基团R，R2与R1相同或不同，表示氢原子，卤素原子，优选氟、氯或溴原子，或卤代烷基，优选全氟代烷基，或任何其他基团R，R1和R2中至少一个不是氢原子，n等于1-4。3.权利要求1的方法，其特征在于取代苄腈是下式(Ia)所示的卤代苄腈式(Ia)中R1表示卤素原子，优选氟、氯或溴原子；或卤代烷基，优选全氟代烷基，R2与R1相同或不同，表示氢原子；卤素原子，优选氟、氯或溴原子；或卤代烷基，优选全氟代烷基，或任何其他基团R，n等于1-4。4.权利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代苄腈中，R1和R2中的一个基团位于氰基的邻位、对位或间位，但优选位于邻位。5.权利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代苄腈中R1和R2表示卤素原子和/或含有1-12个碳原子和1-7个卤原子的卤代烷基。7.权利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代苄腈中R1和R2表示含有1-5个碳原子且优选含有1-7个卤原子的全卤代烷基。8.权利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代苄腈中R1和R2表示卤代烷基，优选氟代烷基，例如氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、氟代乙基、1，1，1-三氟乙基、五氟乙基、氟代丙基、氟代丁基或三氟戊基。9.权利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代苄腈中R1和R2表示卤代烷基，优选三氟甲基。10.权利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代苄腈中R表示羟基；含有1-6个碳原子，优选1-4个碳原子的烷基或烷氧基；氨基或被一个或两个含有1-6个碳原子，优选1-4个碳原子的烷基所取代的氨基。11.权利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代苄腈中R1表示氟或氯原子或三氟甲基，而R2与R1相同或不同，表示氢原子、氟原子、氯原子或三氟甲基。12.权利要求2或3的方法，其特征在于取代苄腈是2，6-二氟苄腈或间三氟甲基苄腈。13.权利要求1-12中任一项的方法，其特征在于所述酶来自短杆菌属微生物。14.权利要求13的方法，其特征在于所述酶来自菌株短杆菌R312或短杆菌spA4。15.权利要求1-14中任一项的方法，其特征在于取代苄腈的水解过程在6-8的pH范围内，优选在约7的pH下进行。16.权利要求1-15中任一项的方法，其特征在于取代苄腈的水解过程在经缓冲的培养基，优选磷酸盐缓冲的培养基中进行。17.权利要求16的方法，其特征在于水解反应温度为10℃-40℃，优选10℃-30℃。18.权利要求1-17中任一项的方法制得的卤代苯甲酰胺。19.根据权利要求1-17中任一项的方法通过2，6-二氟苄腈水解得到的2，6-二氟苯甲酰胺。全文摘要本发明涉及一种取代苯甲酰胺,优选卤代苯甲酰胺的制备方法。具体而言,本发明涉及通过生物水解制备2,6－二氟苯甲酰胺的方法。本发明涉及一种通过酶促水解取代苄腈来制备取代苯甲酰胺的方法,其特征在于将取代苄腈在结构为α文档编号C07C233/65GK1277637SQ9881050公开日2000年12月20日申请日期1998年10月23日优先权日1997年10月24日发明者L·查西奥,C·珠尔答特,D·派特勒申请人:罗狄亚化学公司