专利名称：一种分子印迹整体柱及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分子印迹整体柱及其制备方法和用途，具体地说，涉及一种以鸟苷为模板分子的分子印迹整体柱及其制备方法，该分子印迹整体柱用于萃取富集8-羟基脱氧鸟苷和鸟苷。
背景技术：
8-羟基脱氧鸟苷(8-hydrodeoxyguanosine， 8-OHdG)是一种DNA氧化损伤产生的加合物，也是灵敏和有效标示DNA氧化损伤的一种生物标记物。它是指在受到化学物质、电离辐射、吸烟以及空气污染等因素的影响下，体内产生的大量活性氧自由基，致使DNA氧化损伤产生的氧化加合物，若这种损伤未被修复或被错误修复时，即会引起基因突变，而这种突变若发生在功能基团的表达序列，将会导致肿瘤等疾病的发生。因此，DNA氧化加合物的形成代表着化学致癌过程中的一个早期的、可检测的关键阶段。在已发现的二十几种DNA氧化损伤产物中，鸟嘌呤由于拥有的分子轨道具有较高的能级，因此最容易被氧化损伤而生成较稳定的8-羟基脱氧鸟苷的加合物。它在非特异性酶作用下的DNA修复过程将被释放，并可从体液如血浆和尿样中检出。其检出量的水平与一些慢性疾病如糖尿病、肾病和不同癌症呈显著相关性。对吸烟和受严重污染环境下的人群与健康人也有明显差别。同时，它性能稳定，不受饮食等因素影响，可实现无创伤性检测。为此，8-OHdG已被公认为DNA氧化损伤的一种主要生物标记物，其在尿样中的含量水平，有助于为医学提供早期发现处于癌前病变的个体，以求实施早期干预措施，在个体健康普查和环境污染评价中起到指标性作用。但是由于尿样中8-OHdG含量很低、基质干扰很大，分析中常用固相萃取(SPE)进行样品富集，萃取材料主要有C18、C18/OH和混合型(C18和阴离子交换树脂)三种。C18萃取柱属于通用型非选择性材料，处理尿样时，需要双柱多次萃取，费时费力，操作复杂。使用C18/OH或混合型萃取柱，虽然增加了萃取的选择性，简化了萃取操作，但是尿样中其它相关组分也会被同时萃取，严重干扰了含量很低的8-OHdG的分离分析，给定性和定量带来较大困难。
鸟苷是许多名贵中药的主要有效成分之一，有明显的药理作用，已被用作冬虫夏草、半夏和红毛五加等中药及中成药的质控检测指标。由于中药成分复杂，分析干扰大，为控制药品质量，对冬虫夏草中核苷类物质建立快速、简便、准确的测定方法具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有富集技术的不足，提供一种以鸟苷为模板分子的分子印迹整体柱及其制备方法和用途，该分子印迹整体柱对8-羟基脱氧鸟苷和鸟苷有较高富集能力和选择性，分析速度快，且制备方法简单，成本低廉。 实现本发明目的的技术方案是 一种分子印迹整体柱，包括石英毛细管和石英毛细管内的分子印迹聚合物，所述分子印迹聚合物是以鸟苷为模板分子，将鸟苷、丙烯
3酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亚甲基双丙烯酰胺和十二醇在40 501:水浴条件下超声溶解于二甲亚砜中，除去混合物中的氧，然后加入偶氮二异丁腈混匀，其中鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亚甲基双丙烯酰胺、十二醇、二甲亚砜和偶氮二异丁腈的质量比为17.5 : 55 58 : 48 56 : 62 64 : 275 285 : 350 360 : 1.8 2.2，然后在3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修饰的石英毛细管中于55 6(TC恒温聚合16 20小时而成。
本发明还提供了上述分子印迹整体柱的制备方法，包括以下步骤
(l)以鸟苷为模板分子，将鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亚甲基双丙烯酰胺和十二醇在40 5(TC水浴条件下超声溶解于二甲亚砜中，除去混合物中的氧，然后加入偶氮二异丁腈，其中鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亚甲基双丙烯酰胺、十二醇、二甲亚砜和偶氮二异丁腈的质量比为17.5 : 55 58 : 48 56 : 62 64 : 275 285 : 350 360 : 1.8 2.2，混合均匀后作为分子印迹预聚体混合液；
(2)将分子印迹预聚体混合液灌入经3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修饰的石英毛细管内，封口，然后于6(TC恒温聚合16
20小时; (3)聚合反应完成后，依次用甲醇或乙腈，甲醇与醋酸按体积比7 : 3 9 : 1混合的混合液，甲醇与质量百分比浓度为0.1 0.5%的醋酸溶液按体积比2 : 8 7 : 3
混合的混合液，充分洗脱毛细管，直至从毛细管流出的洗脱液中没有鸟苷为止，得到分子印迹整体柱。 上述步骤(l)中鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亚甲基双丙烯酰胺、
十二醇、二甲亚砜和偶氮二异丁腈的质量比为17.5 : 56 : 56 : 63 : 280 : 350 : 2。上述步骤(2)中是于6(TC恒温聚合16 20小时。 本发明的分子印迹整体柱用于萃取富集8-羟基脱氧鸟苷和鸟苷。 本发明采用原位整体聚合分子印迹技术，制作了一种以鸟苷为模板分子的分子
印迹整体柱，该分子印迹整体柱对8-羟基脱氧鸟苷和鸟苷有较高富集能力和选择性，富
集容量大，分析速度快，可以离线也可在线和液相色谱、毛细管电泳结合使用，使用寿
命长，且制备方法简单，成本低廉。
图1为本发明实施例1所得分子印迹整体柱的扫描电镜图(放大5000倍)；
图2为本发明实施例1所得分子印迹整体柱的扫描电镜图(放大600倍)。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1分子印迹整体柱的制备 将石英毛细管柱用NaOH活化，而后用HC1和二次蒸馏水冲洗，干燥后灌入3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯进行管内壁修饰。将鸟苷17.5mg、丙烯酰胺56mg、 4-乙烯基吡啶56mg、 N， N'-亚甲基双丙烯酰胺63mg和十二醇280mg在5(TC水浴条件下超声溶解于350mg二甲亚砜中，通氮气10 分钟以除去混合物中的氧，然后加入偶氮二异丁腈2mg，超声混合均匀后作为分子印迹 预聚体混合液。然后将分子印迹预聚体混合液灌入经3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸 酯修饰的毛细管柱中，用硅橡胶封口，于6(TC恒温聚合，反应18小时。反应结束后，依 次用甲醇(3mL)、甲醇与醋酸的混合液(3mL，其中甲醇与醋酸体积比为9 : 1)、甲醇与 质量百分比浓度为0.1X的醋酸溶液的混合液(15mL，混合液中甲醇与0.1%醋酸溶液的体 积比为2 : 8)，连续冲洗毛细管柱，直至液相色谱检测从毛细管流出的淋洗液中没有模板 分子鸟苷为止，得到分子印迹整体柱，其最终实际有效长度为4.8cm。本实施例的分子印 迹整体柱的扫描电镜(SEM)图如图l(放大5000倍)和图2(放大600倍)所示。
实施例2分子印迹整体柱的制备 按与实施例1相同的方法，用3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯对石英毛细 管进行管内壁修饰。将鸟苷17.5mg、丙烯酰胺55mg、 4-乙烯基吡啶48mg、 N， N'-亚 甲基双丙烯酰胺62mg和十二醇275mg在4(TC水浴条件下超声溶解于355mg 二甲亚砜中， 通入氮气5分钟以除去混合物中的氧，然后加入偶氮二异丁腈1.9mg，超声混合均匀后作 为分子印迹预聚体混合液。然后将分子印迹预聚体混合液灌入经3-(三乙氧基硅基)丙基 甲基丙烯酸酯修饰的毛细管柱中，用硅橡胶封口，于55t:恒温聚合，反应22小时。反应 结束后，依次用乙腈(3mL)、甲醇与醋酸的混合液(甲醇与醋酸体积比为7 : 3， 2mL)、 甲醇与质量百分比浓度为0.1 %的醋酸溶液的混合液(15mL，混合液中甲醇与0.1 %醋酸溶 液的体积比为7 : 3)，连续冲洗毛细管柱，直至液相色谱检测从毛细管流出的淋洗液中没 有模板分子鸟苷为止，得到分子印迹整体柱。
实施例3分子印迹整体柱的制备 按与实施例1相同的方法，用3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯对石英毛细 管进行管内壁修饰。将鸟苷17.5mg、丙烯酰胺58mg、 4-乙烯基吡啶56mg、 N， N'-亚 甲基双丙烯酰胺64mg和十二醇285mg在5(TC水浴条件下超声溶解于360mg 二甲亚砜中， 通入氮气5分钟以除去混合物中的氧，然后加入偶氮二异丁腈2.2mg，混合均匀后作为分 子印迹预聚体混合液。将分子印迹预聚体混合液灌入经3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯 酸酯修饰的毛细管柱中，用硅橡胶封口，于6(TC恒温聚合，反应16小时。反应结束后， 依次用乙腈(3mL)、甲醇与醋酸的混合液(4mL，其中甲醇与醋酸体积比为8 : 2)、甲醇 与质量百分比浓度为0.5X的醋酸溶液的混合液(13mL，混合液中甲醇与0.5%醋酸溶液的 体积比为2 : 8)，连续冲洗毛细管柱，直至液相色谱检测从毛细管流出的淋洗液中没有模 板分子鸟苷为止，得到分子印迹整体柱。 实施例4以实施例1的分子印迹整体柱作为萃取柱检测尿样中的8-羟基脱氧鸟 苷 萃取装置是由一台注射泵和改装过的注射器组成。以实施例1中制备的分子印 迹整体柱作为萃取柱。首先把注射器的金属针头去掉，然后装上实施例1中制备的分子 印迹整体柱，用胶水密封即可。经优化后萃取的溶剂选择乙腈。将8-羟基脱氧鸟苷标 样溶解于乙腈中配制成浓度为0.35 ii mol/L的溶液，以0.03mL/min速度推过萃取柱进行 萃取，用甲醇与质量百分比浓度为0.1 %的醋酸溶液的混合液(混合液中甲醇与质量百分 比浓度为0.1%的醋酸溶液的体积比为1 : 9作洗脱液，收集前30iiL洗脱液，结合液相
5色谱/紫外检测器(HPLC/UV)，对样品中的8-羟基脱氧鸟苷进行检测分析。通过与对0.35 ii mol/L 8-羟基脱氧鸟苷标样直接进样的液相色谱进行比较，本方法对8-OHdG的富集因子达到75.67。在0.35 8.83 y mol/L浓度范围通过与空白柱(即无模板分子的萃取柱)的富集结果进行比较，印迹技术对富集效果的贡献为41.72% 52.50%。表明该柱对8-羟基脱氧鸟苷有很强的富集能力和良好的选择性，完全能够满足对尿样中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的检测需要。本检测方法的线性范围为0.010 5.30 iimol/L、最小检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)分别为3.17nmol/L(S/N = 3)、 10.56腿ol/L(S/N =10)，回收率为93% 101%。 采集学生志愿者、焦化厂工人和肺癌病人的晨尿(10mL)作为分析应用对象，进行实际样品测定，结果见表1 : 表1.学生志愿者、焦化厂工人和肺癌病人晨尿样中的8-OHdG检测结果
分析对象)Hd(;浓度
学生志愿者14.68土4.59 ,o!,l(n=15)
焦化r工人17,63 ±2,74 iimoi/L (n= 12)
肺癌病人106,89 ± 26,06腿ol/L (n=6) 由于分子印迹整体柱具有整体柱的双孔结构和较大的比表面积以及印迹技术特定选择性等特点，它表现出较大的萃取容量和良好的选择性。萃取后的尿样，干扰少，有效改善了对8-OHdG的分离，提高了定量精度(RSD在3X以内)，分离速度快，时间短，使用寿命达到50次以上。采用本发明整体柱的制备方法，可以将不同规格的石英毛细管制成分子印迹整体柱，可以离线也可在线和液相色谱、毛细管电泳结合使用。本萃取检测方法可望用于重大疾病(如癌症)的早期诊断、健康普查；也可用于环境污染的评价。 实施例5以实施例1的分子印迹整体柱作为萃取柱萃取富集中成药中的鸟苷
以实施例1中的分子印迹整体柱作为萃取柱，按与实施例1相同的方法采用0.35iimol/L鸟苷标样进行实验，分子印迹整体柱对鸟苷的富集因子达到100.33。 在0.35 8.83 ii mol/L浓度范围内，通过与空白柱(即无模板分子的萃取柱)的富集效果进行比较，印迹技术对富集效果的贡献为58.67%。本发明的分子印迹整体柱对鸟苷表现出很高的富集能力和良好的选择性，完全能够满足药材中微量鸟苷的检测需要。本检测方法的线性范围为0.011 5.30 ii mol/L、最小检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)分别为0.25nmol/L(S/N = 3)、 0.88nmol/L(S/N = 10)，回收率为96% 102%。 对市场上所售某品牌中成药剌五加片的鸟苷含量进行分析，测得其鸟苷含量为4.31X10-、mol(3.05iig/g)，测量的相对标准偏差(RSD)为4.22X(n二3)。基于本发明的分子印迹整体柱建立的萃取方法能够有效地萃取富集鸟苷等主要成分，减少干扰，适用于中药及中成药的质量监控。
权利要求
一种分子印迹整体柱，包括石英毛细管和石英毛细管内的分子印迹聚合物，其特征在于所述分子印迹聚合物是以鸟苷为模板分子，将鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和十二醇在40～50℃水浴条件下超声溶解于二甲亚砜中，除去混合物中的氧，然后加入偶氮二异丁腈混匀，其中鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、十二醇、二甲亚砜和偶氮二异丁腈的质量比为17.5∶55～58∶48～56∶62～64∶275～285∶350～360∶1.8～2.2，然后在3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修饰的石英毛细管中于55～60℃恒温聚合16～20小时而成。
2. —种权利要求1所述的分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 以鸟苷为模板分子，将鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亚甲基双丙 烯酰胺和十二醇在40 5(TC水浴条件下超声溶解于二甲亚砜中，除去混合物中的氧，然 后加入偶氮二异丁腈，其中鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亚甲基双丙烯酰 胺、十二醇、二甲亚砜和偶氮二异丁腈的质量比为17.5 : 55 58 : 48 56 : 62 64 : 275 285 : 350 360 : 1.8 2.2，混合均匀后作为分子印迹预聚体混合液；(2) 将分子印迹预聚体混合液灌入经3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧 基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修饰的石英毛细管内，封口，然后于55 6(TC恒温聚合16 20小时;(3) 聚合反应完成后，依次用甲醇或乙腈，甲醇与醋酸按体积比7 : 3 9 : i混合的混合液，甲醇与质量百分比浓度为0.1 0.5%的醋酸溶液按体积比2 : 8 7 : 3混合的混合液，充分洗脱毛细管，直至从毛细管流出的洗脱液中没有鸟苷为止，得到分子印迹整体柱。
3. 根据权利要求2所述的分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于步骤(l)中鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N， N'-亚甲基双丙烯酰胺、十二醇、二甲亚砜和偶氮 二异丁腈的质量比为17.5 : 56 : 56 : 63 : 280 : 350 : 2。
4. 根据权利要求2所述的分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于步骤(2)中是于 60。C恒温聚合16 20小时。
5. 如权利要求1所述的分子印迹整体柱用于萃取富集8-羟基脱氧鸟苷和鸟苷。
全文摘要
本发明公开了一种分子印迹整体柱及其制备方法和用途，该分子印迹整体柱包括石英毛细管和管内的分子印迹聚合物，是以鸟苷为模板分子，将鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和十二醇在40～50℃水浴超声溶解于二甲亚砜中，除氧后加入偶氮二异丁腈混匀，其中鸟苷、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、十二醇、二甲亚砜和偶氮二异丁腈的质量比为17.5∶55～58∶48～56∶62～64∶275～285∶350～360∶1.8～2.2，然后在3-(三乙氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯或3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯修饰的石英毛细管中于55～60℃恒温聚合16～20小时而成。该分子印迹整体柱用于萃取富集8-羟基脱氧鸟苷和鸟苷，具有较高富集能力和选择性。
文档编号C08F2/44GK101690886SQ20091006276
公开日2010年4月7日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者吴采樱, 张少文, 蔡凌霜, 邢钧 申请人:武汉大学