专利名称：一种桔青毒素分子印迹材料及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种桔青毒素分子印迹材料及其制备方法与应用。
背景技术：
分子印迹技术是近年来受到广泛关注的一门新兴的分子识别技术，它是以欲识别 的化合物作为模板分子(或称印迹分子、目标分子)，制备出对该模板具有特定"记忆功能" 的聚合物。在分子印迹聚合物制备过程中，首先模板分子与功能单体通过分子间作用力在 溶液体系中形成主客体复合物，再通过光引发或热引发在交联剂存在下进行自由基聚合反 应，将主客体复合物固定在高度交联的高分子母体中，在一定的溶剂中洗去模板分子，得到
具有确定空间构型的空穴和功能基在该空穴中精确排列的刚性聚合物，即分子印迹聚合物 (Molecular Imprinting Polymer, MIP)。采用分子印迹技术制备的某一模板分子的MIP， 对该模板分子有特异的亲和性，能从结构类似的分子中识别出模板分子。这种特殊的识别 作用由以下两方面形成的一是除去模板分子，聚合物上留下与模板分子形状匹配的作用 空穴；二是在该空穴周围原来与模板分子相互作用的功能基团仍保留在原来的位置上，在 随后的再识别过程中，这些固定排列的功能基团可与目标分子形成一种精确的互补关系， 这与上述形状匹配作用的空穴一起，构成了对目标分子所特有的高选择性和识别能力。
分子印迹技术的基本思想起源于二十世纪四十年代Pauling提出的生物体内 抗体_抗原、酶_底物相互作用的"钥匙"原理，尽管他对于抗体_抗原相互作用的推 测被证实是错误的，但这种学说却为分子印迹理论奠定了基础。从Pauling理论出发， 1949年，Dickey成功地将甲基橙印迹在硅胶表面上，首次提出了"分子印迹"(molecular imprinting)的概念。令人遗憾的是，在之后一段时间内很少有人问津。直到二十世纪七十 年代，Wulff研究小组报道成功制备出人工合成的有机分子印迹聚合物，分子印迹技术才逐 渐为人们所关注。 目前，从全球分子印迹研究范围来看，已经有包括中国在内的十几个国家从事这 方面的研究。在国内，对于分子印迹的研究是从上个世纪90年代开始的。最初局限于中科 院的各个化学所，后来很多高校相继跟进，截至现在，他们都取得了一定的成果，并且在世 界高水平的杂志上发表论文。 分子印迹技术之所以发展迅速，主要是基于它在分子识别上具有的其它技术无法 比拟的优点，即构效预定性(Predetermination)、专一识别性(Specific recognition)和 实用性(Practicability)，并且制备的分子印迹聚合物具有高亲和性和高选择性、耐高温、 抗强酸碱、使用寿命长、应用范围广等优点。它已经用于高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳 色谱(CEC)以及薄层色谱(TLC)的固定相，并且在固相萃取(SPE)、生物传感器、药物分离及 分析、膜分离等方面都展现了独特的魅力。随着研究的深入，伴随着生命科学、物理学和化 学的发展，分子印迹技术有望在生物工程、医药、食品、环境监测等领域拥有更好的应用前
旦 足。 桔青毒素(citrinin， CIT)是青霉属和曲霉属的某些菌株产生的真菌毒素，于1931年首次被分离纯化。桔青毒素纯品呈柠檬黄色针状结晶，分子式是(:13111405，相对分子 量为250，熔点为178 179t:。该毒素极难溶于水，在酸性或碱性溶液中皆可热解。桔青 毒素急性毒性为剧毒。桔青毒素像赭曲霉毒素一样能够使实验动物产生类似猪肾病的肾损 伤。在丹麦发现桔青毒素与赭曲霉毒素协同作用产生猪肾病。 自1931年桔青毒素被首次纯化以来，人们相继采用了薄层层析法(TLC)、荧光光 度计法、高压液相色谱法(HPLC)以及气相色谱、质谱联合法用于桔青毒素的分析检测。目 前，TLC和HPLC法是最常用的检测方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种桔青毒素分子印迹材料及其制备方法。
本发明所提供的桔青毒素分子印迹材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的
1)将聚合物单体、模板分子和致孔剂混合，得到混合液，并使所述混合液静置，向所述混合
液中加入交联剂和引发剂并使其溶解，然后脱除混合液中的氧气，进行聚合反应，得到聚合
产物； 其中，所述聚合物单体选自下述任意一类或两类丙烯酸类单体、丙烯酸酯类单 体、酰胺类单体和吡啶类单体；所述模板分子选自下述任意一种l-羟基_2-萘甲酸、1-羟 基-4_甲基_2-萘甲酸、1-羟基-4-乙基_2-萘甲酸、1-羟基-5-甲基-2-萘甲酸、l-羟 基-5_乙基_2-萘甲酸、1-羟基-6-甲基_2-萘甲酸、1-羟基-6-乙基-2-萘甲酸、l-羟 基-4，5-二甲基-2-萘甲酸、l-羟基-4，5-二乙基-2-萘甲酸、l-羟基-5，6-二甲基-2-萘 甲酸、l-羟基_5，6-二乙基-2-萘甲酸、1-羟基_4，6-二甲基-2-萘甲酸、1-羟基-4，6-二 乙基-2-萘甲酸、l-羟基-4，5，6-三甲基-2-萘甲酸和l-羟基-4，5，6-三乙基-2-萘甲 酸； 2)去除所述聚合产物中的模板分子，得到桔青毒素分子印迹材料(MIP)。模板分
子1-羟基-2-萘甲酸的结构式如式1所示，桔青毒素的结构式如式2所示。
OH(式l) (式2) 其中，所述丙烯酸类单体具体可为丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸，丁基丙烯酸， 叔丁基丙烯酸或三氟甲基丙烯酸，所述丙烯酸酯类单体具体可为甲基丙烯酸甲酯、甲基丙 烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，二甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙酯或二甲基丙烯酸丁酯， 所述酰胺类单体具体可为丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺或乙基丙烯酰胺，所述 吡啶类单体具体可为2-乙烯基吡啶或4_乙烯基吡啶。所述模板分子优选为l-羟基-2-萘 甲酸。
所述致孔剂可选自下述任意一种丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷和四氯甲烷；所述交联剂可选自下述任意一种乙二醇二异丁烯、三羟甲基丙烷、三甲基丙烯酸酯、乙二醇二 甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯基戊四醇、三丙烯酸酯和季戊四醇四丙烯酸酯；所述引发剂可为 偶氮二异丁腈。 步骤1)中所述模板分子、所述聚合物单体、所述交联剂和所述引发剂的摩尔比依 次为(0. 30-0. 80)mmo1 : (0.9_2.4),1 : (8-24),1 : (0. 15-0. 40)mmo1 ;所述聚合物 单体与所述致孔剂的比例为(0. 9-2. 4)mmo1 : (4-10)mL。 所述聚合反应以热引发或光引发的方式进行；所述热引发的反应条件为反应温 度为50°C -IO(TC，反应时间为18-24小时；所述光引发的反应条件为365mm汞灯照射引发。 步骤2)中去除所述聚合产物中的模板分子的方法具体如下将所述聚合产物粉 碎至粒径为30-80um，然后用甲醇和乙酸的混合溶液通过索氏提取对粉碎后的聚合产物进 行洗脱抽提，除去聚合产物中的模板分子，用甲醇洗至中性，干燥，得到桔青毒素分子印迹 材料；其中，所述甲醇和乙酸的混合溶液中甲醇和乙酸的体积比为9 : 1 6 : 4。
为了检测桔青毒素分子印迹材料中的模板分子是否完全去除，可采用下述方法进 行检测将干燥的桔青毒素分子印迹材料颗粒填装到空的色谱柱中，用甲醇和水的混合液 作为洗脱流动相，经液相泵进行联机洗脱，洗脱效果经检测器检测，当洗脱至基线平直为 止，说明已将模版分子去除。 上述HPLC检测条件为日本岛津C化柱(lS0mmX4.6mm，Siim)，流动相V甲醇V 水=80 : 20， pH(甲醇)4. 1(H3P04)， pH(水)4.6(H3P04)，流速0.9mL'min—、检测波长为 220nm，进样量10iiL。温度室温。 本发明的另一个目的是提供一种固相萃取柱填料。 本发明所提供的固相萃取柱填料，由本发明所制备的桔青毒素分子印迹材料形 成。 以本发明所制备的桔青毒素分子印记材料为填料制成的固相萃取柱也属于本发 明的保护范围。 该固相萃取柱可应用于在分离纯化桔青毒素或用于检测桔青毒素。 本发明采用虚拟模板合成分子印迹聚合物的方法来制备桔青毒素分子印迹材料。
因为桔青毒素的毒性大，以其作为模板化合物在操作相当危险。在此情况下，"直接的"分子
印迹就不能得到了，而只能采用适当的类似化合物代替作为模板。而l-羟基-2-萘甲酸与
桔青毒素有相似的结构，且毒性较小，因而可接受用作模板化合物。另一方面使用虚拟模板
可以避免在检测桔青毒素时对结果造成影响。 本发明具有下述有益效果 1)本发明所开发的制备桔青毒素分子印迹聚合物的方法是以l-羟基-2-萘甲酸 为模板分子，所得的分子印迹材料具有良好的分子识别性能，为1-羟基_2-萘甲酸及其它 结构类似物分子印迹聚合物的合成提供了一种可行的制备方案。 2)本发明以l-羟基-2-萘甲酸为模板制备的分子印迹材料为桔青毒素的固相萃 取材料开发提供了依据，从而可对的桔青毒素进行分离提纯。 3)本发明制备的桔青毒素分子印迹材料对桔青毒素具有专一识别性能，通过比较 MIP对l-羟基-2-萘甲酸和桔青毒素的等温吸附曲线，说明可使用本发明所提供的分子印迹材料实现对食品中桔青毒素含量的快速测定。
图1为实施例2中MIP和NIP对1-羟基_2-萘甲酸的等温吸附曲线。
图2为实施例2中MIP和NIP对桔青毒素的等温吸附曲线。
图3为实施例2中MIP对1-羟基_2-萘甲酸和桔青毒素的等温吸附曲线比较。
图4为实施例4中加标浓度为0. 05mg/L的大米样品的高效液相色谱图。
图5为实施例5中加标浓度为0. 05mg/L的桔子样品的高效液相色谱图。
图6为实施例6中加标浓度为0. 05mg/L的小麦样品的高效液相色谱图。
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实 施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可 从商业途径获得。 实施例1、桔青毒素分子印迹材料的制备 (1)反应物配料处理称取0. lOOg(O. 532mmol)的1-羟基_2_萘甲酸分子(虚拟 模板)溶于4. 8mL的丙酮(致孔剂)中，加入0. 162mL (1. 88mmol)的MAA (甲基丙烯酸)，超 声30min，使模板分子与功能单体充分作用，静置3小时。 (2)聚合反应在上述混合液中加入2. 85mL(14. 39mmol)交联剂EDMA(乙二醇二 甲基丙烯酸酯)和0.040g(0.245mmol)AIBN(偶氮二异丁腈)引发剂，超声5min，使其充分 溶解后，通N2脱氧5min后密封。在6(TC恒温水浴中聚合24h，反应得到坚硬的白色固体聚 合物。 (3)去除模板分子，纯化分子印迹聚合物将聚合物粉碎研磨后过270目筛 (50ym)，所得到的聚合物微粒用甲醇/乙酸(9 : 1，v/v)混合液通过索氏提取进行洗脱抽 提，提取液用紫外分光光度仪检测(A 二 220nm)，直至无模板分子检出为止，然后用甲醇洗 至中性，7(TC烘干干燥，得到以l-羟基-2-萘甲酸为模板的分子印迹聚合物(MIP)。
(4)检测色谱柱洗脱，检测分子印迹聚合物将干燥的MIP颗粒填装到空的色谱 柱(日本岛津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim))中，用甲醇和水的混合试剂作为洗脱流动相，经 液相泵进行联机洗脱，洗脱效果经检测器检测，当洗脱至基线平直为止，说明已将模版分子 完全去除。 液相HPLC检测条件流动相V甲醇V水=80 : 20， pH (甲醇)4. 1 (H3P04)， pH(水)4. 6 (H3P04)，流速为0. 9mL min—、检测波长为220nm，室温条件下进样10 y L。
为了比较分子印迹聚合物与非分子印迹聚合物对目标分子桔青毒素识别的差异 性。按照如下方法制备非分子印迹聚合物，与上述制备MIP的区别在于，下述步骤(1)中没 有加入模板分子 (1)反应物配料处理在4. 8mL的丙酮溶液中，加入0. 162mL的MAA，超声30min， 使功能单体充分作用，静置3小时。 (2)聚合反应在上述混合液中加入2. 85mL交联剂EDMA和0. 040gAIBN引发剂， 超声5min，使其充分溶解后，通N2脱氧5min后密封。在6(TC恒温水浴中聚合24h，反应得到坚硬的白色固体聚合物(NIP)。
(3)检测色谱柱洗脱，检测分子印迹聚合物将干燥的聚合物颗粒填装到空的色 谱柱中，用甲醇和水的混合试剂作为洗脱流动相，经液相泵进行联机洗脱，洗脱效果经检测 器检测，当洗脱至基线平直为止
实施例2、桔青毒素分子印迹材料的制备(1)反应物配料处理称取0. 056g(0. 3mmo1)的1-羟基_2_萘甲酸分子(虚拟模 板)溶于4. 8mL的二氯甲烷(致孔剂)中，加入2. 4mmo1的甲基丙烯酰胺，超声30min，使模 板分子与功能单体充分作用，静置3小时。 (2)聚合反应在上述混合液中加入20mmo1交联剂三羟甲基丙烷和 0. 025g(0. 15mmol)AIBN(偶氮二异丁腈)引发剂，超声5min，使其充分溶解后，通N2脱氧 5min后密封。在6(TC恒温水浴中聚合24h，反应得到固体聚合物。 (3)去除模板分子，纯化分子印迹聚合物将聚合物粉碎研磨后过270目筛 (80ym)，所得到的聚合物微粒用甲醇/乙酸(6 : 4，v/v)混合液通过索氏提取进行洗脱抽 提，提取液用紫外分光光度仪检测(A = 220nm)，直至无模板分子检出为止，然后用甲醇洗 至中性，7(TC烘干干燥，得到以l-羟基-2-萘甲酸为模板的分子印迹聚合物(MIP)。
(4)检测色谱柱洗脱，检测分子印迹聚合物将干燥的MIP颗粒填装到空的色谱 柱(日本岛津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim))中，用甲醇和水的混合试剂作为洗脱流动相，经 液相泵进行联机洗脱，洗脱效果经检测器检测，当洗脱至基线平直为止，说明已将模版分子 完全去除。 液相HPLC检测条件流动相V甲醇V水=80 : 20， pH (甲醇)4. 1 (H3P04)， pH(水)4. 6 (H3P04)，流速为0. 9mL min—、检测波长为220nm，室温条件下进样10 y L。
实施例3、桔青毒素分子印迹材料的制备 (1)反应物配料处理称取0. 15g(0. 8mmo1)的1-羟基-2-萘甲酸分子(虚拟模 板)溶于6mL的氯仿(致孔剂)中，加入2. 26mmol的2-乙烯基吡啶，超声30min，使模板分 子与功能单体充分作用，静置3小时。 (2)聚合反应在上述混合液中加入4. 08mL (20. 6mmo1)交联剂EDMA (乙二醇二甲 基丙烯酸酯)和0.040g(0.245mmol)AIBN(偶氮二异丁腈)引发剂，超声5min，使其充分溶 解后，通N2脱氧5min后密封。在6(TC恒温水浴中聚合24h，反应得到坚硬的白色固体聚合 物。 (3)去除模板分子，纯化分子印迹聚合物将聚合物粉碎研磨后过270目筛 (50ym)，所得到的聚合物微粒用甲醇/乙酸(8 : 2，v/v)混合液通过索氏提取进行洗脱抽 提，提取液用紫外分光光度仪检测(A 二 220nm)，直至无模板分子检出为止，然后用甲醇洗 至中性，7(TC烘干干燥，得到以l-羟基-2-萘甲酸为模板的分子印迹聚合物(MIP)。
(4)检测色谱柱洗脱，检测分子印迹聚合物将干燥的MIP颗粒填装到空的色谱 柱(日本岛津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim))中，用甲醇和水的混合试剂作为洗脱流动相，经 液相泵进行联机洗脱，洗脱效果经检测器检测，当洗脱至基线平直为止，说明已将模版分子 完全去除。 液相HPLC检测条件流动相V甲醇V水=80 : 20， pH (甲醇)4. 1 (H3P04)， pH(水)4. 6 (H3P04)，流速为0. 9mL min—、检测波长为220nm，室温条件下进样10 y L。
实施例4、桔青毒素分子印迹材料的制备 (1)反应物配料处理称取0. 122g(0. 65mmol)的1-羟基_2_萘甲酸分子(虚拟 模板)溶于6mL的丙酮(致孔剂)中，加入2. 18mmo1的甲基丙烯酸甲酯，超声30min，使模 板分子与功能单体充分作用，静置3小时。 (2)聚合反应在上述混合液中加入24mmol交联剂EDMA(乙二醇二甲基丙烯酸 酯)和0.049g(0.3mmol)AIBN(偶氮二异丁腈)引发剂，超声5min，使其充分溶解后，通N2 脱氧5min后密封。在6(TC恒温水浴中聚合24h，反应得到坚硬的白色固体聚合物。
(3)去除模板分子，纯化分子印迹聚合物将聚合物粉碎研磨后过270目筛 (50ym)，所得到的聚合物微粒用甲醇/乙酸(9 : 1，v/v)混合液通过索氏提取进行洗脱抽 提，提取液用紫外分光光度仪检测(A 二 220nm)，直至无模板分子检出为止，然后用甲醇洗 至中性，7(TC烘干干燥，得到以l-羟基-2-萘甲酸为模板的分子印迹聚合物(MIP)。
(4)检测色谱柱洗脱，检测分子印迹聚合物将干燥的MIP颗粒填装到空的色谱 柱(日本岛津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim))中，用甲醇和水的混合试剂作为洗脱流动相，经 液相泵进行联机洗脱，洗脱效果经检测器检测，当洗脱至基线平直为止，说明已将模版分子 完全去除。 液相HPLC检测条件流动相V甲醇V水=80 : 20， pH (甲醇)4. 1 (H3P04)， pH(水)4. 6 (H3P04)，流速为0. 9mL min—、检测波长为220nm，室温条件下进样10 y L。
实施例5、 MIP和NIP分别对1-羟基-2-萘甲酸和桔青毒素的吸附实验
1)模版分子1-羟基-2-萘甲酸的等温静态吸附实验
(1)标准溶液 HPLC(紫外检测)条件日本岛津(:18柱(l50mmX4.6mm，5iim);流动相V甲醇V 水=80 : 20， pH(甲醇)4. 1 (H3P04) ， pH(水)4. 6 (H3P04);流速为0. 9mL min—、检测波长为 220nm，室温条件下进样10 y L。 准确称取1-羟基-2-萘甲酸标准品50mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，超 声溶解后稀释成一定浓度梯度的溶液(浓度分别为0. 01、0. 05、0. 1、0. 5、lmg/L)。按照上 述色谱条件进行HPLC测定。待仪器基线稳定后，由低浓度到高浓度连续进行，每个浓度各 注入3针，记录峰面积，由峰面积对浓度绘制标准曲线。所得到的l-羟基-2-萘甲酸的标 准曲线方程如下:y = 28. 246x-0. 1525， R2 = 0. 9991。
(2)静态吸附 分别称取20mg实施例1制备的MIP和NIP(各11份)于干净的小样品瓶中，各取 以下浓度(浓度分别为0. 01、0. 03、0. 05、0. 1、0. 3、0. 5、0. 8、1. 0、1. 5、2. 0、2. 7mmol/L)的 l-羟基-2-萘甲酸溶液2ml分别加入样品瓶中，密封，在室温下(25°C)恒温震荡24h，然后 用0. 22 ii m滤膜过滤，在同样条件下用HPLC测定平衡吸附液中1_羟基_2_萘甲酸的峰面 积，将所得峰面积带入标准曲线计算出吸附后溶液中l-羟基-2-萘甲酸的浓度。然后根据 吸附前后溶液中l-羟基-2-萘甲酸浓度的变化。计算MIP和NIP对l-羟基-2-萘甲酸的 吸附量(Q)，计算公式如下
Q = (C0-C) XV/W 式中Q为吸附量，每克吸附剂所吸附的吸附质的摩尔数，单位为mmol/g ;
C。为原始浓度，单位为mmol/L ;
C为平衡浓度，单位为mmol/L ;
W为印迹聚合物的质量，单位为g ;
V为吸附溶液的体积，单位为L。 以初始1-羟基-2-萘甲酸溶液的浓度对吸附量作图，所得到的等温吸附曲线见图 1。由图1可知，本发明所制备的分子印迹材料对l-羟基-2-萘甲酸的选择性高且吸附能 力强。 2、桔青毒素的等温吸附实验包括如下步骤
(1)标准溶液 HPLC(荧光检测)条件日本岛津(:18柱(150mmX4.6mm，5iim)，流动相V乙腈V 水=1 : 1， pH(乙腈)2. 66 (CH3C00H) ， pH(水)2. 48 (CH3C00H)，流速为lmL min—、 Kex = 331nm， Kem = 500nm， 30。C条件下进样20 ii L。 将5mg的桔青毒素标准品(CIT)用甲醇定容于10mL容量瓶中(500mg/L)，超声 溶解后稀释成一定浓度梯度的溶液(浓度分别为0. 001、0. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L)。按 照上述色谱条件进行HPLC测定。待仪器基线稳定后，用HPLC测定(各浓度自动进样3 针)。记录峰面积，由峰面积对浓度绘制。所得到的桔青毒素的标准曲线方程如下y = 42. 383x+0. 2211， R2 = 0. 9994。
(2)静态吸附 分别秤取20mg实施例1制备的MIP和NIP(各11份)于干净的小样品瓶中，各取 以下浓度(浓度分别为0. 008、0. 02、0. 04、0. 08、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 2、1. 6、2. Ommol/L) 的桔青毒素溶液2ml分别加入其中，密封。在室温下(25°C)恒温震荡24h，然后用0. 22 y m 滤膜过滤，在同样条件下用HPLC测定平衡吸附液中CIT的峰面积，将此面积带入标准曲线 计算出吸附后溶液中CIT的浓度。然后根据吸附前后溶液中CIT浓度的变化，根据吸附公 式计算出聚合物对底物的吸附量。 以初始桔青毒素溶液的浓度对吸附量作图，所得到的等温吸附曲线见图2。由图2
可知，以虚拟模板制备的分子印迹材料对桔青霉素有选择性吸附能力。 将MIP对1-羟基-2-萘甲酸和桔青毒素的等温吸附曲线比较(见图3)，由图3可
知本发明所制备的分子印迹材料对模板分子的选择性要高于桔青霉素。 实施例6、桔青毒素的固相萃取 两个3mL的干净固相萃取小柱中分别装填250mg实施例1制备的MIP和NIP，每 次使用前，填料用适量的水和甲醇预处理。然后用0. 05mg/L桔青毒素标准甲醇溶液5mL通 过萃取小柱，然后用3ml洗脱液进行洗脱。得到的流出液用N2低温吹干，lmL甲醇溶解定 容，然后通过HPLC进行定量分析，色谱条件与桔青毒素标准溶液等温吸附一致。所述洗脱 液可选自下述任意一种1、甲醇；2、甲醇-乙酸混合液(99 : 1， v/v);甲醇-乙酸混合液 (98 : 2，v/v);乙腈。回收率在95 98%之间。
实施例7、在大米样品中的固相萃取实验
(1)样品处理 将500g的大米样品进行研磨(直径< 0. 2mm)，然后取1. Og样品用5mL的乙醇/ 水(7 : 3， v/v)的混合液提取，超声10min，12000rpm离心10min，然后用0.45iim滤器过
滤上清液。[OO92] (2)大米加标回收率测定 量取10mL上述样品溶液于小样品瓶中，共8个，分为4组，每组中的一个样品过 MIP的柱子，另一个过NIP的柱子。依次向每组中分别加入O. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4个 浓度的标准样品。按照以上方法每一组平行做3份，同时再做一组空白，测定其回收率，色 谱条件与桔青毒素标准溶液等温吸附一致。
(3)大米加标回收率实验 对大米分别进行了 0. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L4个浓度的加标回收，每个浓度水
平平行做3份，实验结果见表1。结果表明，4个加标水平下，样品的加标回收率在86.7%
97. 7%之间，平行3次测定加标回收率的相对标准偏差在1. 2% 3. 8%之间。图4为桔青
霉素加标浓度为0. 05mg/L的色谱图。 表1大米样品4个水平的加标回收实验结果
加标浓度mg/L(n=3)
加标 0.005 0.01 0.05 0.1
样品__
回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率 RSD
_(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
97.8 87.5 96.7 94.7
大米 98.8 1.3 86.6 1.2 96.1 2.3 89.8 3.8
_^__^_^_ 实施例8、在桔子样品中的固相萃取实验 [OO"] (1)样品处理将500g的桔子样品捣碎，然后以1. Og样品用5mL的乙醇/水(7 : 3， v/v)的混 合液提取，超声10min， 12000rpm离心10min，然后用0. 45 y m滤器过滤上清液。
(2)桔子加标回收率测定 量取10mL上述样品溶液于小样品瓶中，共8个，分为4组，每组中的一个样品过 MIP的柱子，另一个过NIP的柱子。依次向每组中分别加入O. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4个 浓度的标准样品。按照以上方法每一组平行做3份，同时再做一组空白，测定其回收率，色 谱条件与桔青毒素标准溶液等温吸附一致。
(3)桔子加标回收率实验对大米分别进行了 0. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4个浓度的加标回收，每个浓度水
平平行做3份，实验结果见表2。结果表明，4个加标水平下，样品的加标回收率在91. 3%
95. 9%之间，平行3次测定加标回收率的相对标准偏差在2. 1% 3. 8%之间。图5为桔青
毒素加标浓度为0. 05mg/L的色谱图。表2桔子样品4个水平的加标回收实验结果加标浓度mg/L(n=3)
力口标 0.005 0.01 0.05 0.1
样品_
回收率RSD 回收率RSD 回收率RSD 回收率 RSD
_(%) (%) (%) (%) (%)(%)(%) (%)
91.1 94.3 96.4 89.3 桔子 96.2 3.8 98.3 2.1 93.5 2.9 91.6 2.1 __^_^_^_ 实施例9、在小麦样品中的固相萃取实验
(1)样品处理 将500g的小麦样品捣碎，然后以1. 0g样品用5mL的乙醇/水(7 : 3， v/v)的混 合液提取，超声10min， 12000rpm离心10min，然后用0. 45 y m滤器过滤上清液。
(2)小麦加标回收率测定 量取10mL上述样品溶液于小样品瓶中，共8个，分为4组，每组中的一个样品过 MIP的柱子，另一个过NIP的柱子。依次向每组中分别加入O. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4个 浓度的标准样品。按照以上方法每一组平行做3份，同时再做一组空白，测定其回收率，色 谱条件与桔青毒素标准溶液等温吸附一致。
(3)小麦加标回收率实验对大米分别进行了 0. 005、0. 01、0. 05、0. lmg/L 4个浓度的加标回收，每个浓度水
平平行做3份，实验结果见表3。实验表明4个加标水平下，样品的加标回收率在90. 9%
94. 6%之间，平行3次测定加标回收率的相对标准偏差在1. 2% 3. 7%之间。图6为桔青
毒素加标浓度为0. 05mg/L的色谱图。表3小麦样品4个水平的加标回收实验结果
加标浓度mg/L(n=3)
力口标 0.005 0.01 0.05 0.1
样品 _
回收率RSD 回收率RSD 回收率RSD 回收率 RSD
_(%) (%) (%) (%) (%)(%)(%) (%)
90.8 卯.2 89.8 98.1 小麦 89.9 1.2 90.8 1.7 90.1 2.193.8 3.7 __^__^_ 实施例7-9不同样品的固相萃取实验回收率结果表明，以本发明所提供的桔青毒 素印迹材料为填料制备的固相萃取柱与液相色谱联用，可以准确测定桔青毒素。
权利要求
一种桔青毒素分子印迹材料的制备方法，包括下述步骤1)将聚合物单体、模板分子和致孔剂混合，得到混合液，并使所述混合液静置；然后向所述混合液中加入交联剂和引发剂并使其溶解，然后脱除混合液中的氧气，进行聚合反应，得到聚合产物；其中，所述聚合物单体选自下述任意一类或两类丙烯酸类单体、丙烯酸酯类单体、酰胺类单体和吡啶类单体；所述模板分子选自下述任意一种1-羟基-2-萘甲酸、1-羟基-4-甲基-2-萘甲酸、1-羟基-4-乙基-2-萘甲酸、1-羟基-5-甲基-2-萘甲酸、1-羟基-5-乙基-2-萘甲酸、1-羟基-6-甲基-2-萘甲酸、1-羟基-6-乙基-2-萘甲酸、1-羟基-4，5-二甲基-2-萘甲酸、1-羟基-4，5-二乙基-2-萘甲酸、1-羟基-5，6-二甲基-2-萘甲酸、1-羟基-5，6-二乙基-2-萘甲酸、1-羟基-4，6-二甲基-2-萘甲酸、1-羟基-4，6-二乙基-2-萘甲酸、1-羟基-4，5，6-三甲基-2-萘甲酸和1-羟基-4，5，6-三乙基-2-萘甲酸；2)去除所述聚合产物中的模板分子，得到桔青毒素分子印迹材料。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述模板分子为l-羟基-2-萘甲酸；所 述丙烯酸类单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸，丁基丙烯酸，叔丁基丙烯酸或三氟甲 基丙烯酸，所述丙烯酸酯类单体为甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯，二 甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙酯或二甲基丙烯酸丁酯，所述酰胺类单体为丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺或乙基丙烯酰胺，所述吡啶类单体为2-乙烯基吡啶或4-乙烯 基吡啶。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述致孔剂选自下述任意一种丙 酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷和四氯甲烷；所述交联剂选自下述任意一种乙二醇二异丁烯、三 羟甲基丙烷、三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯基戊四醇、三丙烯酸酯 和季戊四醇四丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中所述模板分子、所述聚合物单体、所述交联剂和所述引发剂的摩尔比依次为(0.30-0. 80)mmol : (0.9-2.4) mmol : (8-24) mmol : (0. 15-0. 40) mmol ;所述聚合物单体与所述致孔剂的比例为 (0.9-2.4),1 : (4-10)mL。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述聚合反应以热引发或光引 发的方式进行；所述热引发的反应条件为反应温度为50°C -IO(TC，反应时间为18-24小 时；所述光引发的反应条件为365mm汞灯照射。
6. 根据权利要求l-5中任一所述的方法，其特征在于步骤2)中去除所述聚合产物中 的模板分子的方法如下将所述聚合产物粉碎至粒径为30-80um，然后用甲醇和乙酸的混 合溶液通过索氏提取对粉碎后的聚合产物进行洗脱抽提，除去聚合产物中的模板分子，用 甲醇洗至中性，干燥，得到桔青毒素分子印迹材料；其中，所述甲醇和乙酸的混合溶液中甲 醇和乙酸的体积比为9 : 1 6 : 4。
7. 权利要求1-6中任一所述方法制备得到的桔青毒素分子印迹材料。
8. —种固相萃取柱填料，其由权利要求7所述的桔青毒素分子印迹材料形成。
9. 以权利要求7所述的桔青毒素分子印记材料为填料制成的固相萃取柱。
10. 权利要求9所述的固相萃取柱在分离纯化桔青毒素或检测桔青毒素中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种桔青毒素分子印迹材料及其制备方法与应用。本发明所提供的桔青毒素分子印迹材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的1)将聚合物单体、模板分子和致孔剂混合，得到混合液，并使所述混合液静置；然后向所述混合液中加入交联剂和引发剂并使其溶解，然后脱除混合液中的氧气，进行聚合反应，得到聚合产物；其中，所述聚合物单体选自下述任意一类或两类丙烯酸类单体、丙烯酸酯类单体、酰胺类单体和吡啶类单体；所述模板分子1-羟基-2-萘甲酸；2)去除所述聚合产物中的模板分子，得到桔青毒素分子印迹材料。以所述桔青毒素分子印记材料为填料制成的固相萃取柱可用于分离纯化或检测桔青毒素。
文档编号B01J20/30GK101768238SQ20101003412
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月15日 优先权日2010年1月15日
发明者张丹莉, 李建中, 王会利, 郭宝元, 金惠芳 申请人:中国科学院生态环境研究中心