改进的交联组合物的制作方法

改进的交联组合物的制作方法
【专利摘要】改进的组合物包括可交联蛋白或多肽以及引发可交联蛋白交联的无毒性材料。组合物任选地且优选地在非磷酸盐缓冲溶剂中制备。任选地且优选地，可交联蛋白包括明胶和任何明胶变体，或本文中描述的变体蛋白。任选地且优选地，无毒性材料包括转谷氨酰胺酶(TG)，其可以任选地包括任何类型的钙依赖性或非依赖性转谷氨酰胺酶，转谷氨酰胺酶可以例如任选地是微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。
【专利说明】改进的交联组合物
[0001]本申请是申请日为2009年06月18日，申请号为200980131973.6，发明名称为“改进的交联组合物”的申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及改进的交联组合物，其包括可交联蛋白和引发可交联蛋白交联的无毒性材料。
[0003]发明背景
[0004]可以原位形成凝胶的生物材料用于各种应用。在许多情形中，原位凝胶形成材料用作受控药物递送的可注射基质或用于组织工程的可注射支架。(Gutowska A、Jeong B、Jas1nowski M.Anat Rec2001，263，342-349。Silva EA, Mooney DJ.J Thromb Haemost2007，5, 590-δο Mahoney MJ，Anseth KS.J B1med Mater Res A2007，81，269-78。)原位凝胶形成材料还可以用作粘合剂以在生理环境中粘结组织或密封渗漏(气体或流体)。
[0005]对软组织粘合剂的兴趣在逐渐增加，因为期望替换或补充用于伤口闭合的缝线(Glickman M，Gheissari A，Money S，Martin J，Ballard J.Arch Surg2002,137，326-31 ;讨论 332。Pursifull NF，Morey AF.Curr Opin Urol2007，17,396-401。)，损伤更少和美容手术的趋势(Tissue Adhesives in Clinical Medicine (临床医学中的组织粘合剂);第2版；Quinn, J.V.，编；BC Decker:Hamilton，Ontar1 Canada，2005。Tissue Glue in CosmeticSurgery (美容手术中的组织胶)；Saltz，R.；Toriumi, D.M.编辑；Quality MedicalPublishing，Inc.，:St.Louis, Missouri, USA2004。)，以及紧急止血的需要(PusateriAE, Holcomb JB, Kheirabadi BS, Alam HB, Wade CE，Ryan KL Journal of Trauma-1njuryInfect1n and Critical Care2006，60，674-682。Acheson EM，Kheirabadi BS，Deguzman R，Dick EJ, Holcomb JB.Journal of Trauma-1njury Infect1n and Critical Care 2005，59，865_8740Kheirabadi BS，Acheson EM, Deguzman R，Sondeen JL, Ryan KL, Delgado A，Dick EJ,Holcomb JB.Journal of Trauma-1njury Infect1n and Critical Care2005，59，25-34。)。
[0006]可以通过多种方法引起原位凝胶形成。形成凝胶的化学方法包括通过接触，如在氰基丙烯酸酯中，或诸如光引发的外部剌激来引发聚合。而且，可以通过下述方式实现凝胶形成:使用诸如戊二醛或碳二亚胺的低分子量交联剂来化学交联预聚物(OtaniY， TabataY, Ikada Y.Ann Thorac SurgI999,67,922-60 Sung HW, Huang DM, Chang WH,Huang RN，Hsu JC.J B1med Mater Re si 999,46, 520-30 0 Otani, Y.;Tabata，Y.;Ikada，Y.B1materialsl998，19，2167-73。Lim，D.W.;Nettles，D.L ;Setton，L A.;Chilkoti，A.B1mac1moleculeS2008，9，222-30。)，或使用聚合物上的活性取代基来化学交联预聚物(Iwata，H.;Matsuda，S.;Mitsuhashi，K.;Itoh，E.;Ikada，Y.B1materialsl998，19，1869-76)0
[0007] 除了化学方法外，通过利用自组装肽的物理方式可以实现凝胶形成(Ellis-Behnke RG, Liang YX, Tay DK, Kau PW, Schneider GE，Zhang S，Wu W，SoKF.Nanomedicine2006, 2，207-15。Haines-Butterick L，Rajagopal K，Branco M，Salick D，Rughani R，Pilarz M，Lamm MS，Pochan DJ, Schneider JP.Proc Natl Acad Sci U S A2007，104，7791-6。Ulijn RV，Smith AM.Chem Soc Rev2008，37，664-75)。
[0008]最后，已经研究了引起凝胶形成的生物方法，这些生物方法是基于交联诸如贻贝胶的来自海洋粘合剂的交联组分(Strausberg RL, Link RP.Trends B1technol 1990, S,53-7)，或基于血液凝固，如在血纤蛋白密封剂中(Jackson MR.Am J Surg2001，182，1S-7S。Spotnitz WD.Am J Surg2001,182,8S-14S Buchta C, Hedrich HC, Macher M, Hocker P, Redl
H.B1materials2005,26,6233-41.27—30)。
[0009]还考虑了多种仿生方法来原位形成凝胶。在这些方法中，聚合物交联和凝胶形成是模仿生物学中存在的交联操作之一。可能引起技术上最感兴趣的生物模型是在湿气条件下凝固的贻贝胶(Silverman HG, Roberto FF。Mar B1technol (NY) 2007, 9,661-81。DeaconMP, Davis SS, Waite JH, Harding SE0 B1chemistryl998，37，14108-12。)。粘着蛋白的酚(即多巴)残基酶促转化成反应性醌残基来引发贻贝胶的交联，反应性醌残基可经历随后的蛋白内交联反应(Burz1 LA, Waite JH.B1chemistry2000, 39,11147-53。McDowell LM,Burz1 LA, Waite JH, Schaefer JJ.B1l Cheml999, 274，20293-5)。已经作为技术模型的第二种生物交联操作是在血液凝固期间发生的转谷氨酰胺酶催化反应(Ehrbar M，Rizzi SC，Hlushchuk R, Djonov V, Zisch AH, Hubbell JA, Weber FE, Lutolf MP。B1materials2007，28,3856-66)。用于原位凝胶形成的仿生学方法已经研究了 XIIIa因子或其他组织转谷氨酸胺酶的使用(Sperinde J, Griffith L.MacromoIecules2000, 33, 5476-5480。Sanborn TJ,Messersmith PB, Barron AE。B1materials2002,23,2703-10)。
[0010]特别感兴趣的一种用于原位凝胶形成的仿生方法是通过钙非依赖性微生物转谷氨酰胺酶(mTG)来交联明胶。mTG催化 与XIIIa因子类似的交联反应，但微生物酶活性既不需要凝血酶，也不需要钙。mTG的最初研究指向食品行业的应用(Babin H，Dickinson E.Food Hydrocolloids2001,15, 271-276。Motoki M, Seguro K.Trends in FoodScience&Technologyl998,9, 204-210。)，而后来的研究考虑了可能的医学应用。先前的体外研究已经显示出mTG可以交联明胶以在数分钟内形成凝胶，明胶-mTG粘合剂可以与湿气或湿组织结合，且粘合剂强度与基于血纤蛋白的密封剂相当或优于它们(ChenTH, Payne GF 等人，B1materials2003, 24, 2831-2841。McDermott MK, Payne GF 等人，B1macromolecules2004, 5,1270-1279。Chen T, Payne GF 等人，J B1med Mater Res B ApplB1mater2006，77，416-22。)。
[0011]发明概述
[0012]【背景技术】并未教导或表明以一种或多种额外的赋形剂为特征的改进的组合物，这些额外的赋形剂用于控制基于非血纤蛋白或多肽的酶促交联材料的一种或多种特性，该改进的组合物可以用于多种应用，诸如用于止血或体液密封目的，包括但不限于手术应用、控制出血、密封流体渗漏、控制伤口流血。
[0013]根据至少一些实施方案，本发明提供了一种包括可交联蛋白或多肽和一种或多种交联材料的组合物。
[0014]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括在组合的乙酸盐和柠檬酸盐缓冲液中的可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白的交联的酶的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。任选地，在所述可交联蛋白或多肽和所述酶及它们各自的缓冲液被混合以形成所述组合物之前，所述可交联蛋白或多肽存在于乙酸钠缓冲液中且其中所述酶在柠檬酸钠缓冲液中。优选地，所述可交联蛋白或多肽包括明胶。更优选地，所述明胶是至少250Bloom。
[0015]根据本发明的一些实施方案，提供了一种还包括任何药学上可相容的盐形式的钙的组合物。且任选地还包括脲。
[0016]优选地，所述钙与所述脲以组合存在时，与钙或脲的每一种单独存在时相比，钙和脲的每一种以减少的量存在。
[0017]更优选地，所述乙酸盐和/或所述柠檬酸盐小于约0.5M。
[0018]任选地且最优选地，所述乙酸盐和/或所述柠檬酸盐是至少约0.01M0
[0019]任选地，根据期望的交联时间，离子强度选自约0.1M到约0.5M，其中增大的离子强度导致相对缩短的交联时间。
[0020]任选地且优选地，对本文描述的任意组合物来说，酶包括转谷氨酰胺酶或多铜氧化酶中的一种或多种。
[0021]更优选地，所述转谷氨酰胺酶包括微生物转谷氨酰胺酶。
[0022]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白的交联的酶、金属离子和变性剂的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。 [0023]任选地，可交联蛋白或多肽包括明胶。优选地，所述明胶是至少250Bloom。
[0024]更优选地，所述金属离子包括任何药学上可相容的盐形式的钙。更优选地，所述钙盐包括氯化钙或氢氧化钙中的一种或多种。任选地且最优选地，所述钙以至多IM的量存在。
[0025]任选地，对本文描述的任意组合物来说，所述变性剂包括离液剂。优选地，所述离液剂包括脲。更优选地，所述脲以至多4M的量存在。最优选地，当所述钙和所述脲以组合存在时，钙和脲的每一种以减少的量存在。
[0026]任选地，当所述金属离子包括钙时，组合物还包括钙螯合剂。
[0027]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白的交联的钙非依赖性酶和钙螯合剂的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。
[0028]任选地，所述钙螯合剂包括EDTA、柠檬酸盐或calgon中的一种或多种。优选地，所述柠檬酸盐或所述EDTA以约0.01M到约2M的量存在。更优选地，所述柠檬酸盐或所述EDTA以约0.05M到约0.2M的量存在。最选地，所述柠檬酸盐或所述EDTA以约0.5M到约2M的量存在。
[0029]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白交联的酶和增粘剂的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白，其中增粘剂选自由藻酸酯、阿拉伯树胶、高粘度羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和PVP组成的组。
[0030]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白的交联的酶和稳液剂(kosmotrope)的组合物,条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。
[0031]任选地，所述稳液剂选自由脯氨酸、海藻糖和谷氨酸或其任意两种或多种的组合组成的组。还任选地，组合物还以离液剂为特征。[0032]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、转谷氨酰胺酶和能够共价结合到所述明胶的PEG(聚乙二醇)衍生物的组合物。任选地，所述PEG衍生物包括任何胺化的PEG衍生物。优选地，所述胺化的PEG衍生物包括PEG胺。
[0033]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、转谷氨酰胺酶和能够共价结合到所述明胶的PVA(聚乙烯醇)衍生物的组合物。任选地，所述PVA衍生物包括任何胺化的PVA衍生物。优选地，所述胺化的PVA衍生物包括PVA胺。
[0034]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、胺底物交联剂和氨甲酰化的抑制剂的组合物。任选地，所述交联剂包括转谷氨酰胺酶。
[0035]优选地，所述氨甲酰化的抑制剂包括胺供体。更优选地，所述胺供体选自由甘氨酸和组氨酸组成的组。任选地且更优选地，所述胺供体以不会抑制由所述交联剂引起的所述明胶的交联的量存在。还任选地且更优选地，所述胺供体以部分抑制由所述交联剂引起的所述明胶的交联的量存在。上述组合物还可以任选地进一步包括脲。
[0036]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括至少部分琥珀酰化的明胶、未琥珀酰化的明胶和胺底物交联剂的组合物。
[0037]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括至少部分氨甲酰化的明胶、未氨甲酰化的明胶和胺底物交联剂的组合物。
[0038]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、二胺和胺底物交联剂的组合物。任选地，所述二胺包括腐胺。
[0039]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、胺供体和胺底物交联剂的组合物。
[0040] 任选地，所述胺供体包括聚乙烯亚胺(PEI)。优选地，胺底物交联剂包括转谷氨酰胺酶。
[0041]根据本发明的一些实施方案，提供了一种交联组合物，包括泡沫明胶和转谷氨酰胺酶。任选地，所述转谷氨酰胺酶以冻干形式存在。
[0042]根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白交联的钙非依赖性酶、变性剂和用于逆转所述变性剂的作用，用于逆转所述变性剂的溶胶凝胶转变点降低作用的剂的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。
[0043]任选地，所述变性剂包括脲，且所述用于逆转所述变性剂的所述作用的剂包括脲酶。
[0044]任选地，本文描述的任何组合物还可以包括山梨糖醇。任选地且优选地，所述山梨糖醇以足够增强交联组合物的柔性和/或加速交联速率的量存在。组合物还可以任选地进一步包括乙酸盐。
[0045]根据本发明的一些实施方案，本文中的任意组合物可以任选地进一步包括增塑剂。任选地，所述增塑剂选自由阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、PEG6000、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸烷基酯、丙三醇酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、脱水山梨糖醇酯、乙酰化单酸甘油酯、丙三醇、脂肪酸酯、二醇、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、伯洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂或食用油的单甘油酯和二甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇200到12，000、聚碳蜡聚乙二醇，和浓度高于其CMC(临界胶束浓度)的所述表面活性剂；或其组合组成的组。优选地，所述表面活性剂包括聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯、聚氧乙二醇十二烷基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(sodium laureth sulfate)、月桂基乙醚硫酸钠(sodium lauryl ether sulfate)、伯洛沙姆、伯洛沙胺、烷基多葡糖苷、脂肪醇、月旨肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺(cocamide monoethanolamine)和椰油酰胺二乙醇胺。
[0046]更优选地，所述表面活性剂的浓度在所述可交联蛋白干重的约0.1 %到约5% w/w的范围内。任选地且最优选地，所述聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯包括聚山梨醇酯20、21、0、60、61、65、80 或 85 中的一种或多种。
[0047]根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物还可以任选地包括增粘剂，增粘剂选自由藻酸酯、阿拉伯树胶、高粘度羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和PVP组成的组。
[0048]根据本发明的一些实施方案，对本文中的任一种组合物来说，任选地，所述酶包括转谷氨酰胺酶，组合物还包括胱胺、半胱氨酸、氰酸盐或黑色素中的一种或多种。
[0049]根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物还可以任选地包括氨清除齐?、氨螯合剂或氨结合剂、氨代谢的刺激剂、或细胞氨摄取的抑制剂。任选地，所述氨清除剂包括二糖乳果糖。还任选地，所述氨结合剂包括皂苷。优选地，所述氨清除剂包括含有苯乙酸钠和苯甲酸钠的溶液。
[0050]还优选地，所述氨代谢的刺激剂包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸或其组合。
[0051]还优选地，所述细胞氨摄取的抑制剂包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸或其组合。
[0052]根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物还可以任选地包括缓冲液，缓冲液选自由琥珀酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲胺(TRIS)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(三(羟甲基)甲基甘氨酸)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(M0PS)、哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、二甲基次胂酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N，-(2-乙磺酸)(HEPES)和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)组成的组。
[0053]根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物可以任选地具有约6到约7范围内的pH,其还任选地是约6。
[0054]根据本发明的一些实施方案，对本文中可任选的任一种组合物来说，所述酶包括转谷氨酰胺酶。任选地，所述转谷氨酰胺酶是钙非依赖性的。优选地，所述转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶。更优选地，所述转谷氨酰胺酶的蛋白浓度以组合物的约0.0001%到约2% w/w的量存在。最优选地，所述转谷氨酰胺酶以组合物的约0.01%到约1.35% w/w的量存在。还最优选地，所述转谷氨酰胺酶以组合物的约0.05%到约0.5% w/w的量存在。
[0055]任选地且最优选地，所述转谷氨酰胺酶以组合物的约0.1 %到约0.4% w/w的量存在。
[0056]任选地，所述转谷氨酰胺酶的浓度在总组合物的约I到约180酶单位(U/mL)的范围内。优选地，所述转谷氨酰胺酶的浓度在总组合物的约4到约70酶单位(U/mL)的范围内。更优选地，所述转谷氨酰胺酶的浓度在总组合物的约10到约55酶单位(U/mL)的范围内。
[0057]任选地，对本文中的任一种组合物来说，交联材料:可交联蛋白溶液的比是约1:1 至Ij 1: 5v/vo
[0058]根据本发明的一些实施方案，对本文中的任一种组合物来说，所述可交联蛋白或多肽包括明胶，且其中所述明胶由动物源、重组源或其组合产生。任选地，所述动物源选自由鱼和哺乳动物组成的组。优选地，所述哺乳动物选自由猪和牛组成的组。更优选地，所述明胶是A类型(酸处理的)或B类型(碱处理的)。最优选地，所述明胶包括高分子量明胶。任选地且最优选地，所述明胶是至少约250Bloom。还任选地且最优选地，所述明胶是在第一次提取期间产生。
[0059]根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物还可以任选地包括一种制造用于交联的组合物的方法，包括:制备可交联蛋白或多肽、用于交联所述可交联蛋白或多肽的酶和药学上可接受的钙盐的溶液，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白；以及向所述溶液中添加钙螯合剂。
[0060]任选地，所述钙螯合剂包括多磷酸盐和羧酸盐、或其组合中的一种或多种。还任选地，所述多磷酸盐选自由焦磷酸盐、三聚磷酸盐、高级多磷酸盐和六偏磷酸盐或其组合组成的组。优选地，焦磷酸盐选自由焦磷酸四钠、焦磷酸二氢二钠、焦磷酸四钾、焦磷酸二氢二钾和焦磷酸二钠二钾或其组合组成的组。还优选地，所述三聚磷酸盐选自由三聚磷酸五钠和三聚磷酸五钾或其组合组成的组。
[0061]还优选地，所述羧酸盐选自由碱金属柠檬酸盐、碱金属乙酸盐、碱金属乳酸盐、碱金属酒石酸盐、碱金属苹果酸盐、乙二胺四乙酸的碱金属盐以及editronic酸、或其组合组成的组。更优选地，所述羧酸盐选自由乙二胺四乙酸和柠檬酸钠，或其组合组成的组。
[0062]任选地且更优选地，所述六偏磷酸盐包括六偏磷酸钠。 [0063]根据本发明的一些实施方案，提供了一种制造用于交联的组合物的方法，包括:制备可交联蛋白或多肽、用于交联所述可交联蛋白或多肽的酶和变性剂的溶液，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白；以及向所述溶液中添加用于逆转所述变性剂的作用，用于逆转所述变性剂的溶胶凝胶转变点降低作用的剂。
[0064]任选地，所述变性剂包括脲，且所述用于逆转所述变性剂的所述作用的剂包括脲酶。
[0065]根据本发明的一些实施方案，提供了一种制造用于交联的组合物的方法，包括:制备可交联蛋白或多肽、用于交联所述可交联蛋白或多肽的酶和离液剂的溶液，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白；以及向所述溶液中添加稳液剂。
[0066]任选地，其中所述稳液剂选自由脯氨酸、海藻糖和谷氨酸或其任意两种或多种的组合组成的组。
[0067]根据本发明的一些实施方案，提供了一种制造用于交联的组合物的方法，包括:制备可交联蛋白或多肽和用于交联所述可交联蛋白或多肽的转谷氨酰胺酶的溶液，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白；以及向所述溶液中添加胱胺、半胱氨酸、氰酸盐或黑色素中的一种或多种以至少部分抑制所述转谷氨酰胺酶。
[0068]根据本发明的一些实施方案，提供了一种具有比活性> 25酶单位每毫克、> 95%电泳纯度、< 5内毒素单位每克以及< 10CFU/g的微生物转谷氨酰胺酶组合物。这种转谷氨酰胺酶可以任选地被提供为上面要求保护的任一种交联剂。
[0069]根据本发明的一些实施方案，提供了一种组合物，包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白交联的酶、金属离子以及变性剂，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白，其中所述可交联蛋白或多肽包括明胶，其中所述酶包括转谷氨酰胺酶，其中所述金属离子包括任何药学上可相容的盐形式的钙并且其中所述变性剂包括脲。
[0070]在一些实施方案中，所述明胶可以是至少250bloom。
[0071]在一些实施方案中，所述钙盐可包括氯化钙或氢氧化钙中的一种或多种。
[0072]在一些实施方案中，所述钙可以以至多IM的量存在。
[0073]在一些实施方案中，所述脲可以以至多4M的量存在。
[0074]在一些实施方案中，所述组合物还可包括钙螯合剂。
[0075]在一些实施方案中，所述钙螯合剂可包括EDTA、柠檬酸盐或calgon中的一种或多种。
[0076]在一些实施方案中，所述柠檬酸盐或所述EDTA可以是以从0.01M到2M的量存在的。
[0077]在一些实施方案 中，所述柠檬酸盐或所述EDTA可以是以从0.05M到0.2M的量存在的。
[0078]在一些实施方案中，所述组合物还可包括能够共价结合到所述明胶的PEG(聚乙二醇)衍生物。
[0079]在一些实施方案中，所述PEG衍生物可包括任何胺化的PEG衍生物。
[0080]在一些实施方案中，所述组合物还可包括能够共价结合到所述明胶的PVA(聚乙烯醇)衍生物。
[0081]在一些实施方案中，所述PVA衍生物可包括任何胺化的PVA衍生物。
[0082]在一些实施方案中，所述组合物还可包括乙酸盐。
[0083]在一些实施方案中，所述组合物还可包括增塑剂。
[0084]在一些实施方案中，所述增塑剂可选自由阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、PEG6000、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸烷基酯、丙三醇酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、脱水山梨糖醇酯、山梨糖醇、乙酰化单酸甘油酯、丙三醇、脂肪酸酯、二醇、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、伯洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂或食用油的单甘油酯和二甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇200到12，000、碳蜡聚乙二醇，和浓度高于其CMC(临界胶束浓度)的表面活性剂、或其组合组成的组。
[0085]在一些实施方案中，所述表面活性剂可包括聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯、聚氧乙二醇十二烷基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、月桂基乙醚硫酸钠、伯洛沙姆、伯洛沙胺、烷基多葡糖苷、月旨肪醇、脂肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺和椰油酰胺二乙醇胺。
[0086]在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度可在所述可交联蛋白干重的0.1%到5% w/w的范围内。
[0087]在一些实施方案中，所述聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯可包括聚山梨醇酯20、21、0、60、61、65、80 或 85 中的一种或多种。
[0088]在一些实施方案中，所述组合物还可包括增粘剂，所述增粘剂选自由藻酸酯、阿拉伯树胶、高粘度羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和PVP组成的组。
[0089]在一些实施方案中，所述组合物还可包括胱胺、半胱氨酸、氰酸盐或黑色素中的一种或多种。
[0090]在一些实施方案中，所述组合物还可包括氨清除剂、氨螯合剂或氨结合剂、氨代谢的刺激剂、或细胞氨摄取的抑制剂。
[0091]在一些实施方案中，所述氨代谢的刺激剂或所述细胞氨摄取的抑制剂可包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸或其组合。
[0092]在一些实施方案中，所述组合物可具有从6到7范围内的pH。
[0093]在一些实施方案中，所述pH可以是6。
[0094]在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶可以是钙非依赖性的。
[0095]在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶可以是微生物的转谷氨酰胺酶。
[0096]在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶的蛋白浓度可以是以所述组合物的从
0.0001%|lj 2% w/w 的量存在的。
[0097]在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶可以是以所述组合物的从0.01%到
1.35% w/w的量存在的。
[0098]在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶的浓度可以是在总组合物的从I到180个酶单位(U/mi)的范围内。
[0099]在一些实施方案中，酶溶液与明胶溶液的比例可以是1:1到1: 5(v/v)。
[0100]在一些实施方案中，所述明胶可产自于动物源、重组源或它们的组合。
[0101]在一些实施方案中，所述动物源可选自由鱼和哺乳动物组成的组。
[0102]在一些实施方案中，所述明胶可以是A类型的(酸处理的)或B类型的(碱处理的)。
[0103]在一些实施方案中，所述明胶可包括具有至少250bloom的高分子量的明胶、或其等效物。
[0104]在一些实施方案中，在所述钙的存在下的所述脲的量，与不存在所述钙时的所述脲的量相比，可减少从30 %到50 %的范围内的百分比。
[0105]根据本发明的一些实施方案，组合物以缓冲液和一种或多种其他赋形剂为特征，选择它们以便克服【背景技术】缺陷中的至少一些。
[0106]任选地且优选地，缓冲液是非磷酸盐缓冲液，其任选地且更优选地选自由乙酸盐缓冲液(诸如乙酸钠)、柠檬酸盐缓冲液(诸如柠檬酸钠)、琥珀酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、三(轻甲基)甲胺(TRIS)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(三(羟甲基)甲基甘氨酸)、2_{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、二甲基次胂酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)组成的组。
[0107]根据一些实施方案，组合物用作局部药物递送的载体。
[0108]根据一些实施方案，组合物是用于组织工程的可注入支架。
[0109]根据一些实施方案，组合物是止血组合物。根据一些实施方案，组合物是体液密封组合物。
[0110]本发明的 组合物优选地提供快速止血，由此使受伤或手术后的血液损失最少。
[0111]正如本文中使用的，“伤口 ”指对患者的任何组织的任何损伤，其导致来自循环系统中的血液的损失或来自生理通道的任何其他体液的损失，所述生理通道诸如任意类型的管。此组织可以是肠组织，诸如器官或血管，或外部组织，诸如皮肤。血液或体液的损失可以是内部的，诸如来自破裂的器官，或外部的，诸如来自裂伤。伤口可以是在软组织中，诸如器官中，或在硬组织中，诸如骨中。损伤还可以因任何剂或源引起，包括外伤受伤、感染或手术干预。损伤可以是有生命危险的或无生命危险的。
[0112]“TG”指任意类型的转谷氨酰胺酶；“mTG”还可以指微生物转谷氨酰胺酶和/或任意类型的转谷氨酰胺酶，这取决于上下文(在下面具体的试验实施例中，该术语指微生物转谷氨酰胺酶)。任选地，转谷氨酰胺酶包括除了血液衍生因子XIII之外的源自植物、重组动物或微生物的转谷氨酰胺酶；然而，转谷氨酰胺酶的实际生产过程可以任选地包括本领域已知的任意类型的重组方法。
[0113]目前通过将组织牵拉在一起而促进愈合的缝线和U形钉来实现手术伤口闭合。然而，它们通常未能产生防止流体渗漏所需的足够的密封。因而，存在防止术后渗漏(包括经常沿着U形钉和缝线发生的渗漏)的器件和方法的大量的、未满足的医学需求。需要这种器件和方法作为缝线和U形钉的附件来在末梢血管重建、硬脑脊膜重建、胸、心血管、肺、神经和胃肠手术方面实现止血或止住其他流体。市场上目前的大多数高压止血器件如果在
任何程度是粘合性的，也是名义上的。这种器件的良好实例是QuikClot? ACS?(Z-Medica,ffallington, CT)和HemCon?绷带(HemCon, Portland, OR),这两种止血器件目前供给美国武装力量的成员。当面临剧烈的涌流时或面对伤口的中等血流1-2小时后，构成HemCon绷带的壳聚糖网络可以被血液饱和并很快失效(B.S Kheirabadi等人(2005).J.Trauma.59:25-35 ；A.E.Pusateri 等人(2006).J.Trauma.60:674-682)。QuikClot 矿物为了有效，必须产生有害量的热(A.E.Pusateri 等人(2006).J.Trauma.60:674-682)。
[0114]已经提议用于在出血控制中使用的基于其他多糖的止血器材是RDHTM(AcetylGlucosamine)、TraumaDEX?(MPH)和 Chitoskin?(Chitosan&Gelatin)。然而，这些类型的绷带中没有一种能够始终证明在面临严重血流时避免失效。最近采用的其他止血器材包括Ce I ox? (Chitosan Crystals)和 WoundStat? (TraumaCure Inc., MD)(蒙脱石矿物和超吸收性聚合物的颗粒混合物)。然而，这些产品都快速溶胀以填充伤口部位，使它们仅仅适合于加快特定类型的伤口中的血液凝结并带来减少或甚至消除周围的血管中的血流的危险。
[0115]上面提到的所有产品依赖于自然的凝结级联以控制从伤口部位的流体渗漏。这样，它们的容量受到了明显限制。一般的伤口部位密封，尤其是渗漏非血液流体的受伤部位的密封超出了这些产品的范围。
[0116] 就先前由明胶与mTG的交联形成组织粘合的尝试来说(即McDermott等人,2004和Chen等人，2006)，这些尝试的商业化应用受到了限制，这是因为在操作室温下，明胶溶液中发生了热可逆胶凝。虽然过去已经提出脲用于降低用在粘合剂中的明胶溶液的胶凝转变点(Otani等人，1998)，但是这先前并未认为与明胶-mTG密封剂一起使用，因为已经确认脲是可以显著破坏酶活性的强变性剂(Rajagopalan等人,J B1logica Chem236 (4), 1961)。此外，在特别采用脲存在下的mTG活性的研究中，发现非常低浓度的脲(< 0.5M)严重抑制了 mTG 作用(Nomura Y 等人，B1sci B1tech B1chem65 (4)，2001:第 982-985 页)，而高浓度的脲(8M)完全使mTG 失活(Yokoyama K 等人，Protein Exp&Purif26，2002:第 329-335 页2002)。[0117]出人意料地，本发明人发现脲在某些条件下实际上能够成功地与明胶和mTG—起使用，正如本发明人的于2007年12月17日提交的PCT公布第W0/2008/076407号所描述，该专利在此通过引入并入，就好像它们在本文中提出一样。进一步出人意料地，本发明人扩展了脲在交联的明胶/mTG组合物中的可能的用途和引入，正如下面更详细描述的。
[0118]正如本文中使用的，“约”意指标示值的正或负约10%。
[0119]从下面的详细描述和从权利要求中，本发明的多个实施方案的其他特征和优势将是明显的。
[0120]附图简述
[0121]本文参考附图，仅作为例子，描述了本发明。现在，详细地具体参考附图，应强调所显示的细节仅作为例子且仅仅是为了示例性讨论本发明的优选实施方案的目的，并且因提供被认为是本发明的原理和概念方面最有用和易于理解的描述的内容而提出。在这一点上，并不试图显示比基本理解本发明所需更详细的本发明的结构细节，结合附图进行描述使如何可以在实践中具体实施本发明的若干形式对本领域的技术人员来说是明显的。
[0122]在附图中:
[0123]图1是显示了 mTG的pH稳定性的图；
[0124]图2是显示了在0.5M乙酸钠(Na-Ac)和0.5M柠檬酸钠中的mTG的粘度随时间的变化的图。
[0125]图3A-F显示了根据本发明一些实施方案的不同示例性制剂达到粘度为3X106cP(完全成形的凝胶的30%)和粘度为9X106cP(完全成形的凝胶的90%)的时间；
[0126]图4显示了纯化的mTG材料的凝胶电泳的结果(2_8泳道)；
[0127]图5显示了与对照相比的不同增塑剂溶液的相对交联速率；
[0128]图6显示了根据本发明一些实施方案的一些示例性明胶溶液的结果:对照、A和B ；
[0129]图7A、7B和7C概述了根据本发明一些实施方案的含有作为氨甲酰化抑制剂的多种甘氨酸和组氨酸添加剂的多种示例性明胶溶液在不同的孵育时间后交联并由粘度计测试的结果；
[0130]图8概述了根据本发明一些实施方案的含有和不含氰酸盐添加剂的对照溶液在高温的不同孵育时间后交联并由粘度计测试的结果；以及
[0131]图9显示了爆破压力系统和相关的组织歧管的示意图。
[0132]优选实施方案的描述
[0133]本发明是包括可交联蛋白或多肽的溶液和引发可交联蛋白交联的一种或多种无毒性材料的溶液的改进的组合物。
[0134]根据一些实施方案，将可交联蛋白或多肽的溶液，和引发可交联蛋白交联的一种或多种无毒性材料的溶液制备在非磷酸盐缓冲液溶剂中。
[0135]任选地且优选地，可交联蛋白包括明胶和本文描述的任何明胶变体或变体蛋白。任选地且优选地，无毒性材料包括转谷氨酰胺酶(TG)，其可以任选地包括任意类型的钙依赖性或非依赖性转谷氨酰胺酶，其可以，如任选地是钙非依赖性微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。并不希望以任何方式进行限制，在本发明至少一些实施方案的改进的特性中，与【背景技术】的组合物相比，本发明的组合物提供了增大的蛋白交联速率。而且，mTG的交联反应显示超过由血液凝固系统的XIIIa因子催化的交联反应的显著改进。与XIIIa因子不同，微生物酶活性即不需要凝血酶，也不需要钙。
[0136]因此，在至少一些实施方案中，本发明提供了用于多种软组织应用的明胶-mTG粘合组合物改进的应用。在一些实施方案中，本发明还提供了一种用于制备组合物的方法，该方法包括提供可交联蛋白或多肽的溶液；提供一种或多种交联材料的溶液；以及使可交联蛋白或多肽的溶液与交联材料的溶液混合。
[0137]根据本发明的一些实施方案，组合物以绷带形式提供，该绷带优选地适于用作止血绷带。本文描述的组合物可以另外具有一种或多种用途，这些用途包括但不限于组织粘合剂(特别是仿生组织粘合剂)、组织培养支架、组织密封剂、止血组合物、药物递送平台、手术助剂或类似物，以及其他非医学用途，包括但不限于可食用的产品、化妆品以及类似物，诸如，如用在食品中的酶的纯化。
[0138]下文在各节标题下更详细地描述了本发明的多个实施方案，这仅仅是为了清楚的缘故且没有以任何方式对本发明进行限制的目的。
[0139]可交联蛋白
[0140]根据本发明的优选实施方案，可交联蛋白包括明胶。
[0141 ] 明胶可以任选地包括任意类型的明胶，其包括本领域已知的蛋白，优选地包括但不限于由动物组织的部分水解获得的明胶和/或从动物获得的胶原，动物组织包括但不限于动物皮肤、结缔组织(包括但不限于韧带、软骨以及类似物)、茸角或角以及类似物，和/或骨、和/或鱼鳞和/或骨或其他部位；和/或利用细菌、酵母、动物、昆虫或植物系统或任意类型的细胞培养物产生的重组明胶。
[0142]根据本发明的 优选实施方案，来自动物源的明胶优选包括来自哺乳动物源的明胶且更优选包括猪皮、猪肉和牛骨、或二层牛皮(split cattle hide)或任何其他猪源或牛源中的一种或多种。更优选地，这样的明胶包括猪明胶，因为其具有较低的过敏反应速率。来自动物源的明胶可以任选地是A型(酸处理的)或B型(碱处理的)，虽然优选A型(但是，下面给出了使用B型明胶的实施例)。
[0143]优选地，来自动物源的明胶包括在第一次提取期间获得的明胶，其通常在低温(50°C -60°C，但是此确切的温度范围未必是限制)下进行。这种方式产生的明胶将在250-300Bloom的范围内且具有至少约95-100千道尔顿的高分子量。优选地，使用275-300Bloom 的明胶。
[0144]这种明胶的制造商的非限制性的实例是PB Gelatins (Tessenderlo Group,Belgium)。
[0145]根据本发明的一些实施方案，来自动物源的明胶任选地包括来自鱼类的明胶。任选地,可以使用任何种类的鱼,优选冷水鱼种类,诸如鲤鱼、鳕鱼、或梭子鱼、或鲔鱼。此明胶的pH(在10%的溶液中测得)优选在4-6的范围。
[0146]冷水鱼明胶在10°C的水中形成溶液，且因而所有的冷水鱼明胶都被认为是OBloom0对本发明来说，任选且优选地使用高分子量的冷水鱼明胶，更优选包括至少约95-100千道尔顿的分子量。这等同于250-300Bloom动物明胶的分子量。由于冷水鱼明胶的脯氨酸和羟脯氨酸的含量较低，因此其在比动物明胶低得多的温度下经历热可逆胶凝作用。与动物明胶中每1000个氨基酸残基中135-145个脯氨酸和90-100个羟脯氨酸相比，冷水鱼明胶每1000个氨基酸残基中具有100-130个脯氨酸和50-75个羟脯氨酸(Haug IJ,Draget KI, Smidsr0d 0.(2004)Food Hydrocolloidsl8:203-213)。
[0147]这种明胶的制造商的非限制性实例是Norland Products (Cranbury, NJ)。
[0148]在本发明的一些实施方案中，低内毒素毒性明胶用于形成明胶-mTG组合物的明胶溶液组分。这种明胶可从诸如Gelita?(Eberbach,Germany)的供应商购得。低内毒素毒性明胶被定义为具有小于1000内毒素单位(EU)/克的明胶。更优选地，使用内毒素毒性小于500EU/克的明胶。
[0149]对非常高灵敏度的应用来说，诸如用将会接触脊柱或脑的材料，优选具有小于100EU/克的内毒素毒性的明胶，更优选具有小于50EU/克的明胶。具有小于1EU/克的内毒素毒性的明胶是非常昂贵的，但在一些灵敏的应用中，也能够用作本发明至少一些实施方案的一部分。
[0150]根据本发明的一些实施方案，类型1、类型II或任何其他类型的水解或非水解胶原替代明胶作为被交联的蛋白材料。已经证明了各种类型明胶形成热稳定的mTG交联的凝胶的倉泛力(O' Halloran DM 等人，Characterizat1n of a microbial transglutaminasecross-linked type II collagen scaffold(微生物转谷氨酰胺酶交联的II型胶原支架的表征)。Tissue Eng.2006Jun ； 12 (6): 1467-74。Garcia Y 等人，Assessment of cellviability in a three-dimens1nal enzymatically cross-linked collagen scaffold(三维酶促交联的胶原支架中的细胞存活率的评价)。J Mater Sci Mater Med.2007年10月；18 (10): 1991-2001。Epub2007 年 6 月 7 日.Nomura Y 等人，Improvement of shark type Icollagen with microbial transglutaminase in urea(服中用微生物转谷氨酸胺酶对 I 型S鱼胶原的改进)。B1sci B1technol B1chem.2001Apr ；65(4):982_5。)。 [0151]根据本发明的一些实施方案，使用重组人明胶。这种明胶可从诸如Fibr0genTM(SanFrancisco, CA)的供应商购得。重组明胶优选是至少约90%的纯度且更优选是至少约95%的纯度。一些重组明胶在10°C下是非胶凝的且因而被认为是OBloom。对本发明的一些实施方案来说，优选使用高分子量的重组明胶，更优选包括至少约95-100千道尔顿的分子量。
[0152]如上所述，可交联蛋白优选包括明胶，但还可以另外或可选择地包括另一种类型的蛋白。根据本发明的一些实施方案，蛋白还是转谷氨酰胺酶的底物，且优选以合适的转谷氨酰胺酶特异性多肽和聚合物序列为特征。这些蛋白可以任选地包括但不限于独立地具有形成生物粘合剂的特性的合成聚合物序列，或已经更优选地用转谷氨酰胺酶特异性底物修饰而增强了材料被转谷氨酰胺酶交联的能力的聚合物。下面描述了这些类型的材料中的每一种的非限制性的实例。
[0153]已经开发出具有合适的转谷氨酰胺酶交联靶的合成多肽和聚合物序列，它们具有优选约20°C到约40°C的转变点。优选的物理特性包括但不限于结合组织的能力和形成纤维的能力。与胶凝型明胶(如上所述)相同，这些多肽可以任选地被使用在组合物中，这些组合物还以降低它们转变点的一种或多种物质为特征。
[0154]这种肽的非限制性实例描述在美国专利第5，428，014号和第5，939，385号中，两篇专利都由ZymoGenetics Inc提交,这两篇专利通过引用并入就好像它们在本文中全文提出一样。两篇专利都描述了生物相容的、生物粘合的转谷氨酰胺酶可交联多肽，其中已知转谷氨酰胺酶催化蛋白结合谷氨酰基残基的Y-甲酰胺基团与赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰基转移反应，导致形成ε-(Υ-谷氨酰基)赖氨酸异肽键。
[0155]例如，描述了具有13-120个氨基酸残基的多肽，包括式S1-Y-S2的区段，其中:SI是Thr-1le-Gly-Glu-Gly-Gln ;Υ是1_7个氨基酸的间隔肽或不存在；且S2 是 Xaa_Lys_Xaa_Ala_Gly_Asp_Val。任选地，间隔妝 Y 是 Gln_His_His_Leu_Gly、Gln-His-His-Leu-Gly-Gly 或 His-His-Leu-Gly-Gly。还任选地，S2 的 Xaa 氨基酸 I 是 Ala或Ser。任选地，间隔肽包括His-His-Leu-Gly。任选地且优选地，Y和S2中的至少一个不含GIn残基。任选地，多肽的羧基端氨基酸残基是Pro或Gly。多肽的具体的非限制性的实例包括下述多月太:Thr-1 Ie-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-Hi s-Hi S-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val、Thr-1le-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val、Thr-1le-Gly-Glu-Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val或Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Gly。该专利还描述了包括这些肽的高分子量的、生物相容的、生物粘合的转谷氨酰胺酶可交联的共聚物和均聚物。
[0156]美国专利第5，939，385号描述了生物相容的、生物粘合的转谷氨酰胺酶可交联多肽。这些多肽优选具有包括式S1-Y-S2的区段的约9-120个氨基酸残基，其中:S1选自由 Ile-Gly-Glu-Gly-Gln、Gly-Glu-Gly-Gln、Glu-Gly-Gln 和 Gly-Gln 组成的组；Y 是His-His-Leu-Gly-Gly 或 His-His-Leu-Gly ;且 S2 选自由 Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp、Ala-Lys-Gln-Ala-Gly> Ala-Lys-Gln-Ala> Ala-Lys-Gln、Ala-Lys-Ala-Gly-Asp-VaKAla-Lys-Ala和Ala-Lys组成的组，其中所述多肽具有氨基端和羧基端，且是可由转谷氨酰胺酶交联。优选的多肽是Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln。还优选一种多肽，其中弹性多肽位于该多肽的氨基端和羧基端的一侧或两侧。该专利还提供了弹性多肽，其中弹性多肽是五肽或四肽，尤其是侧翼多肽，其中侧翼弹性多肽是Val-Pro-Gly-Val-Gly、Ala-Pro-Gly-Val-Gl y> Gly-Val-Gly-Val-Pro > Val-Pro-Gly-Gly 或其任何部分，优选使侧翼多肽的氨基端是Val且侧翼多肽的羧基端是Gly。该专利还描述了包括这些多肽的高分子量的、生物相容的、生物粘合的转谷氨酰胺酶可交联的共聚物和均聚物。
[0157]交联材料
[0158]任选地且优选地，无毒性交联材料包括转谷氨酰胺酶(TG)，其可以任选地包括任何类型的钙依赖性或钙非依赖性转谷氨酰胺酶(mTG)，其可以如，任选地是微生物转谷氨酰胺酶。
[0159]根据本发明的一些实施方案，可以使用新近购得的包含10%或更多mTG的转谷氨酰胺酶产品。市售的此类型的转谷氨酰胺酶产品的非限制性实例包括由AjinomotoC0.(Kawasaki, Japan)和Yiming Chemicals (China)制造的那些产品。来自此公司的这种产品的非限制性实例是Activa TG-成分:mTG(10% )和麦芽糖糊精(90% );活性:810-1, 350U/g m Activa0来自Yiming的这种产品的非限制性实例包括含有10 % mTG和90 %麦芽糖糊精的一种产品以及含有10 % mTG和90 %乳糖的一种产品，也是活性为810-1，350U/g的产品。来自Yiming的这种产品的其他非限制性实例包括含有30% mTG和70%麦芽糖糊精的一种产品以及含有30% mTG和70%乳糖的一种产品，两种都是活性为2, 430-4, 050U/g 的产品。
[0160]如上所述，交联材料优选包括转谷氨酰胺酶，但根据本发明的一些实施方案，还可以另外包括别的类型的交联材料。[0161]这种交联剂的非限制性实例包括碳二亚胺，诸如N，N-(3_( 二甲基氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC)、含有EDC的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或与聚(L-谷氨酸)(PLGA)和聚丙烯酸一起使用的碳二亚胺。在另一个实施方案中，这种交联剂可以包括酪氨酸酶或含有壳聚糖的酪氨酸酶。在另一个实施方案中，交联(聚合)是用紫外光或Y射线来光引发的。在另一个实施方案中，交联剂可以包括亚烃基、柠檬酸(碳酸)、或纳米-羟磷灰石(n-HA) +聚(乙烯醇)(PVA)。
[0162]在另一个实施方案中，交联剂是植物源多酚，诸如(即，羟基化肉桂酸，诸如咖啡酸(3,4-二羟基肉桂酸)、绿原酸(优选奎尼酸酯)、咖啡酰基酒石酸(caftaric acid)(优选酒石酸酯)和类黄酮(即，五羟黄酮和芸香苷)。在另一个实施方案中，额外的交联剂是氧化的单糖或二糖、氧代乳糖或基于糖部分的二醛(半乳糖-己糖二醛糖)(galacto-hexodialdose) (GALA)。在另一个实施方案中，京尼平或其他环烯醚職糖苷衍生物，或裂环烯醚萜，优选橄榄苦苷，包括交联剂。在另一个实施方案中，交联剂是巯基反应性聚(乙二醇)。在另一个实施方案中，交联剂是葡聚糖、氧化葡聚糖、葡聚糖二醛。在另一个实施方案中，交联剂是多铜氧化酶，诸如漆酶或胆红素氧化酶。
[0163]示例性的组合物
[0164]根据本发明，上述交联底物和交联材料可以任选地与一种或多种额外的材料结合以形成不同的组合物。根据一些实施方案，粘合材料任选地且优选地包括:(i)明胶；(ii)转谷氨酰胺酶。更优选地，明胶和转谷氨酰胺酶以足够用作密封剂、止血剂的量提供。
[0165]此外，一种或多种添加物也可以被包括在止血产品中，如，诸如生长因子、多克隆抗体和单克隆抗体以及其他化合物的药物。这种添加物的示例性实例包括，但不限于:抗生素，诸如四环素和环丙沙星、阿莫西林以及甲硝哒唑；抗凝血剂，诸如活性蛋白C、肝素、前列腺环素(PGI2)、前列腺素、白细胞三烯、抗转谷氨酰胺酶II1、腺苷二磷酸酶和纤溶酶原激活物；类固醇，诸如地塞米松，前列腺环素、前列腺素、白细胞三烯和/或激肽的抑制剂以抑制炎症；心血管药物，诸如钙通道阻断剂、血管舒张剂和血管收缩剂；化学引诱物；局部麻醉剂，诸如布比卡因；以及抗增生药物/抗肿瘤药物，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和/或泰索帝；抗病毒剂，诸如更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、阿糖腺苷、利巴韦林、曲氟尿苷、阿昔洛韦、二脱氧尿苷和病毒组分的抗体或基因产品；细胞因子，诸如α-干扰素或β-干扰素或Y-干扰素，α-或β-肿瘤坏死因子以及白细胞介素；细胞集落刺激因子；促红细胞生成素；抗真菌剂，诸如大扶康、酮康唑和制霉菌素；抗寄生虫剂，诸如戊双脒；抗炎剂，诸如α -1-抗胰蛋白酶和α -1-抗胰凝乳蛋白酶；麻醉剂，诸如布比卡因；镇痛药；防腐剂；以及激素。其他示例性的添加物包括，但不限于:维生素和其他营养添加物；糖蛋白；纤连蛋白；肽和蛋白；糖类(单糖和/或复合糖)；蛋白聚糖；抗血管紧张素；抗原；类脂或脂质体；以及寡核苷酸(有义和/或反义DNA和/或RNA)。
[0166]缓冲液选择
[0167] 2007年12月17日提交的PCT公开第W0/2008/076407号公开了包括作为可交联蛋白的明胶和作为无毒性交联材料的微生物转谷氨酰胺酶的组合物，其中磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作溶解明胶和mTG的优选溶剂。然而，已经发现PBS降低了 mTG促进的明胶交联的速度。不希望受限于一种假设，显示缓冲液中的磷酸盐分子降低了 mTG酶的交联活性。因此，确定不含磷酸盐的缓冲液用作明胶和mTG溶液的缓冲液是更有效的。[0168]适于用在本发明中的非磷酸盐缓冲液的非限制性实例包括乙酸盐缓冲液(诸如乙酸钠)、柠檬酸盐缓冲液(诸如柠檬酸钠)、琥珀酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲胺(TRIS)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(三(羟甲基)甲基甘氨酸)、2_{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N’ -双(2-乙磺酸)(PIPES)、二甲基次胂酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’ -(2-乙磺酸)(HEPES)和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。
[0169]任选地且优选地，采用包括一个或多个羧基的缓冲液。更优选地，缓冲液包括乙酸钠或柠檬酸钠。更优选地，乙酸钠用作蛋白或多肽的缓冲液，而柠檬酸钠或乙酸钠用作交联材料的缓冲液。
[0170]任选地且优选地，缓冲液具有约0.01M到约0.6M范围内的浓度。更优选地，用于蛋白或多肽的缓冲液具有约0.05M到约0.15M范围内的浓度，且最优选具有约0.1M的浓度。更优选地，用于交联材料的缓冲液具有约0.1M到约0.5M范围内的浓度。就下面示例性的、非限制性的实施例描述了这些浓度的益处。
[0171]不希望受限于一种假设，认为乙酸钠缓冲液加速了蛋白的mTG催化的交联，正如下面示例性的、非限制性的实施例所描述。
[0172]不希望受 限于一种假设，认为如果柠檬酸钠缓冲液连同交联剂一起加入到蛋白/多肽溶液中，则柠檬酸钠缓冲液改善了交联组合物的机械性能和生物相容性。下面更详细地描述了此效果。
[0173]出人意料地，发现通过在单一组合物中使用乙酸钠缓冲液与蛋白/多肽溶液以及柠檬酸钠缓冲液与交联剂溶液，能够同时获得使用每一种类型的缓冲液的益处(即，加速的交联和改善的机械性能)，而不会对任何反应产生任何不合适的抑制或不会发生任何不合适的额外的反应。就下面示例性的、非限制性的实施例描述了此方法的成功实施。
[0174]缓冲液pH
[0175]2007年12月17日提交的PCT公开第W0/2008/076407号还公开了根据优选的实施方案，将缓冲液的pH调节到约1.5到约5.0，或约7.0到约9.0范围内的值，此范围在明胶的等离子PH值的一般范围之外，以便增大明胶在溶液中的溶解度。根据该PCT申请的教导，产物pH距等离子pH越远，则明胶的溶解度越好。正如下面详细所述的，发现对转谷氨酰胺酶来说，在PH6.0附近的范围内的pH值是最有效的。
[0176]然而，根据将要在有生命的生物体内使用的组合物的可接受的实践，明胶应该溶解在缓冲在PH5.5-9.0的含水溶剂中，该pH范围包括等离子明胶溶液的pH范围。
[0177]根据本发明的一些实施方案，将明胶溶液的pH任选地且优选地调节到落入到使mTG保持超过其酶促活性的80%的pH水平的范围内。对当前已知的mTG的菌株来说，此范围是约 5 到约 8( Activa? General Informat1n, Ajinomoto Food Ingredients LLC)。
[0178]优选高mTG活性pH范围的较低部分，这是因为mTG促进的明胶交联释放了作为产物的NH3, NH3在交联过程中升高了局部环境中的pH。不希望受到一种假设的限制，如果初始溶液PH处于高mTG活性pH范围的较低部分，那么蛋白交联过程中释放NH3就不会立即使局部PH升高到高mTG活性的pH范围之上，从而使mTG能够以高活性水平连续发挥作用。因此，优选地，将明胶溶液组分的pH调节到约5到约8范围内的pH，且更优选约6到约7范围内的pH。更优选地，将明胶溶液组分的pH调节到约6的pH，这是粗转谷氨酰胺酶活性的最佳pH。
[0179]使用pH调节剂或本领域已知的任何其他方法可以调节pH。例如且无任何受到限制的意图，一种这样的方法包括用冰乙酸滴定溶解的缓冲盐溶液，直到溶液PH达到期望的pH水平。在pH调节之后，将溶液转移到容量瓶中且添加双蒸水，直至达到期望的缓冲液体积和相应的缓冲液浓度。
_0] 钙和脲的添加
[0181]2007年12月17日提交的PCT公开第W0/2008/076407号公开了向明胶溶液中添加氯化钙(CaCl2)基本上降低了明胶的转变点。2M氯化钙的缓冲液中25% (w/w)的明胶溶液具有低于22°C的转变点，该转变点是足够低的以在操作室温下维持液态。然而，mTG促进的明胶交联在这种高CaCl2环境中受到了极大地抑制，极大地增加了明胶凝胶固化所需的时间。而且，在这种环境中mTG交联得到的交联的明胶产物具有比在较低CaCl2环境中mTG交联得到的交联的明胶产物差的机械性能。
[0182]出人意料地，本发明人发现氯化钙和脲对降低明胶溶液的转变点具有协同效应。当以合适的浓度将氯化钙和脲都导入缓冲液中，且将明胶(25% w/w，A型300Bloom猪)溶解到该缓冲溶液中时，可以将明胶溶液转变点降低到操作室温(18°C -22°C )之下。在此协同溶液中，脲和氯化钙的各自要求浓度比如果脲和氯化钙中的仅仅一种用于降低明胶溶液的转变点时所需的浓度低得多。例如，替代将明胶溶解在2M CaCl2溶液中，通过将明胶溶解在包括2M脲的IM CaCl2溶液中或包括3M脲的0.5M CaCl2溶液中可以实现相同的转变点降低。就下面示例性的、非限制性的实施例描述了此效应的试验实施例。
[0183]在不存在CaCl2时，需要4M-4.5M脲溶液来同等程度地降低明胶溶液转变点。在许多情况下，当使用用于降低转变点的此协同溶液时，改善了由mTG交联得到的交联明胶凝胶的机械性能(粘合强度、胶粘强度以及弹性)。
[0184]在本发明的另一个实施方案中，作为CaCl2的替代物或补充物，使用不同的钙化合物。其他钙化合物的实例是氢氧化钙和碳酸钙。就下面示例性的、非限制性的实施例描述了使用氢氧化钙来降低明胶溶液的转变点，该明胶溶液随后使用mTG交联。
[0185]在另一个实施方案中，作为钙化合物的替代物或补充物，使用结合了不同二价阳离子的化合物。合适的二价化合物的非限制性实例是氯化镁。
_6] 转谷氨酰胺酶浓度
[0187]向明胶溶液中添加氯化钙和/或脲以降低溶液的转变点，即使以如上所述的较低浓度，仍对mTG促进的交联具有抑制效果，由此减缓对止血、组织密封、组织粘合以及其他伤口治疗应用所需的热不可逆的明胶胶凝化作用的固化。由于添加脲或CaCl2而使mTG促进的蛋白交联时间增加可以减少蛋白mTG交联用于上述医学应用的使用。
[0188]本发明人发现通过增大与蛋白溶液混合来开始mTG交联反应的mTG溶液中的mTG的浓度，可以增大mTG促进的蛋白交联反应速度的速率。根据本发明的一些实施方案，用于增大溶液中mTG的浓度的材料和方法包括使用市售的浓mTG混合物，从填充剂来纯化mTG溶液以及利用过滤技术来浓缩mTG溶液。通过使用这些方法和材料，可以将mTG溶液中的mTG的蛋白浓度增大到高达约2% w/w的浓度(按重量计10% mTG产品的20% w/w溶液，诸如 ACTIVA TG)。[0189]根据一些实施方案，当脲和/或CaCl2添加到明胶溶液的缓冲液中以降低明胶溶液的转变点时，相应mTG溶液的优选的蛋白浓度在总mTG溶液的约0.1 % w/w到约2% w/w的范围内。更优选地，mTG溶液的浓度在总mTG溶液的约0.25 % w/w到约I % w/w的范围内。最优选地，mTG溶液的浓度在总mTG溶液的约0.4% w/w到约0.8% w/w的范围内。
[0190]根据本发明的一些实施方案，以范围在1: 0.5到1: 8mTG溶液:明胶溶液的体积比将mTG溶液与明胶溶液充分混合。优选地，体积比范围在1:1到1: 4mTG溶液:明胶溶液；更优选地，体积比范围在1:1到1: 2，mTG溶液:明胶溶液。
[0191]这些体积比和mTG浓度一起描述了本发明的实施方案，其中总组合物中mTG的蛋白浓度在约0.01 % w/w到约1.35% w/w的范围内，优选在约0.05% w/w到约0.5% w/w的范围内，且更优选在约0.1% w/w到约0.4% w/w的范围内。
[0192]根据本发明的一些实施方案，总组合物中的酶活性在约I到约180酶单位(EU)每克的范围内，优选在约4EU/g到约70EU/g的范围内，且更优选在约10EU/g到约55EU/g的范围内。
[0193]钙螯合剂
[0194]如上所述，虽然CaCl2在降低包括可交联蛋白或多肽的溶液的转化点方面是非常有用的，但是其存在于交联的明胶溶液中具有有害的作用。因此，发生交联时中和CaClJt用的方法在开发用于医学和手术密封剂和止血应用的组合物方面是极有用的。
[0195]根据本发明的一些实施方案，止血或流体密封组合物包括钙结合剂(calcium-binding agent)。当包括交联材料和至少一种钙结合剂的溶液混入含有CaCl2的可交联蛋白的溶液中时 ，钙结合剂附着到钙分子上并削弱了钙分子对止血组合物或流体密封组合物的负面影响。在本发明的上下文中，术语“钙结合剂”与术语“钙螯合剂(calcium-sequestering agent) ”、“|丐螯合剂(calcium-chelating agent) ”、“|丐螯合剂(calcium-chelator) ”、“钙络合剂(calcium-complexing agent) ”是同义的。
[0196]本发明的发明人进一步出人意料地发现，向可交联蛋白的溶液，诸如明胶中添加钙结合剂，除了中和溶液中的钙之外，还具有额外的作用。当这种剂添加到明胶溶液中时，明胶溶液经历物理热可逆胶凝。此胶凝过程的速率取决于添加到明胶溶液中的溶液中钙结合剂的浓度。优选地，mTG溶液中的钙结合剂的浓度在约0.1M到约0.5M的范围内。更优选地，浓度范围是约0.25M到约0.5M。高于0.5M的浓度，则由某些钙结合剂促进的热可逆胶凝可以足够迅速地发生，以便严重阻碍mTG促进的交联。
[0197]即使就在环境温度下不能形成热可逆凝胶的明胶溶液而言，发生了通过向明胶溶液中添加包含钙结合剂的溶液引起的热可逆凝胶。这些类型的明胶溶液包括上述包含使明胶溶液转变点降到低于18°C_22°C (足够低以在操作室温下维持液态)的量的脲和/或CaCl2的那些明胶溶液。
[0198]通过向明胶溶液中添加钙结合剂形成的热可逆明胶凝胶与使明胶溶液在其溶胶-凝胶转变点的温度之下时形成的热可逆明胶凝胶是明显不同的。由降低温度引起的胶凝过程通常是渐进的过程，这是因为明胶溶液具有低的导热率且其耗费大量的时间使整个明胶溶液的温度降到其溶胶-凝胶转变点之下。由明胶溶液形成的凝胶是透明的且结实的。如果添加足够量的钙结合剂，那么由钙结合剂引起的胶凝过程几乎立即发生。形成的凝胶是不透明的、白色的且非常有弹性。而且，由钙结合剂胶凝得到的凝胶只在高于40°C (它们近似的溶胶-凝胶转变点)的温度下转变成溶液，该温度明显高于由300Bloom明胶得到的凝胶的溶胶-凝胶转变点。
[0199]不希望受到一种假设的限制，由添加某些钙螯合剂，诸如柠檬酸盐、EDTA和Calgon引起的热可逆物理胶凝的机理可能是由于离子交联，因为这些剂是带负电的聚阴离子，A型明胶具有7-9的等离子点，这意味着A型明胶在pH6.0的溶液中带正电(正如下面的参考实施例)。将带负电的聚阴离子添加到带负电的明胶溶液中可以引起离子交联。
[0200]在本发明的另一个任选的实施方案中，不是钙螯合剂的带负电的聚阴离子另外或可选择地用于一种或多种钙螯合剂以引起对组合物的离子交联。
[0201]可以通过向明胶溶液或相关的可交联蛋白中添加钙结合剂引起的热可逆胶凝在改善用于医疗和手术应用的mTG促进的交联蛋白凝胶的组合物方面具有极大的益处。这对具有低于18°C _22°C (其是足够低的以在操作室温下维持液态)的溶胶-明胶转变点的明胶溶液制备的交联凝胶来说，诸如包含必要量的脲和/或CaCl2的交联凝胶来说，尤其如此。由包含降低转变点的添加剂的明胶溶液制备的交联的凝胶的弹性和粘结性被降低，这是因为该凝胶随后缺少通常发生在明胶溶液中的赋予明胶凝胶弹性和粘合性的物理热可逆胶凝。当该凝胶用于组织密封剂、止血和伤口闭合应用时，降低的弹性和粘合性给这些凝胶带来明显的害处，这是因为该凝胶不太能够在处于伤口部位之上的合适位置时经受血液或其他体液的流动而不在凝胶开裂或允许液体穿透凝胶。然而，如果将钙结合剂添加到与明胶溶液混合以促进交联的mTG溶液中，那么明胶溶液也将经历物理的热可逆胶凝，同时经历mTG促进的交联。用于本发明的此实施方案的钙结合剂的浓度任选地且优选地是其本身不会在发生mTG促 进的交联所要求的时段内发生热可逆胶凝的量。如果添加太多的钙结合剂，那么热可逆胶凝就会立即发生，而mTG促进的交联将根本不会发生。
[0202]由钙结合剂引发的热可逆胶凝既发生在钙或含钙的分子作为凝胶溶液的一部分被包括在内的凝胶溶液中，又发生在不包含钙或含钙的分子的明胶溶液中。在不包含任何钙的明胶溶液中，添加钙结合剂仅仅用于引发的热可逆胶凝作用。在确实包含钙(单独或在较大的分子中)的明胶溶液中，钙结合剂用于降低钙的有害作用并引发热可逆胶凝作用。钙对交联的蛋白/多肽组合物的有害作用可以包括差的机械性能，特别增大的脆性和粘合强度的降低。另外，当钙以其毒性阈值之上的高浓度存在时，钙可能引起不利的组织反应。
[0203]用在本发明的上下文中的钙结合剂的非限制性实例包括多磷酸盐，诸如焦磷酸盐(包括焦磷酸四钠、焦磷酸二氢二钠、焦磷酸四钾、焦磷酸二氢二钾和焦磷酸二钠二钾)、三聚磷酸盐(包括三聚磷酸五钠和三聚磷酸五钾)，高级多磷酸盐，诸如四磷酸钠和四磷酸钾以及六偏磷酸盐，也称为“玻璃态磷酸盐”或“聚焦磷酸盐”以及羧酸盐(诸如碱金属柠檬酸盐、碱金属乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐和苹果酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)的碱金属盐以及editronic 酸)。
[0204]合适的钙结合剂的优选实例包括EDTA和柠檬酸钠。
[0205]参照下面示例性的、非限制性的实施例描述了试验实施例，该试验实施例描述了mTG促进的明胶溶液交联，其中已经将不同浓度的EDTA或柠檬酸钠添加到mTG溶液中。
[0206]用于本发明的上下文中的多磷酸盐的优选实例是以商品名Calgon?下销售的粉末六偏磷酸钠(SHMP)。Calgon在水中与周围的钙离子形成络合物。当用作本发明的一部分时，当将Calgon引入到含钙的明胶溶液中时，其与其他钙结合剂具有类似的作用。当将Calgon引入到不含钙的明胶溶液中时，其像其他钙结合剂一样引发类似的热可逆胶凝过程，但还具有缩短mTG促进的明胶凝胶的交联时间的额外益处。还观察到所产生的包括Calgon的凝胶的粘合性比所产生的包括其他钙结合剂的凝胶的粘合性强。
[0207]脲螯合剂和脲水解剂
[0208]如上所述，可以将脲添加到明胶溶液中以便显著降低其转变点。这对在操作室环境中简化明胶-mTG化合物的使用方面具有巨大的益处。然而，在高浓度的脲存在下形成的交联的明胶凝胶对某些应用来说并不理想，因为当它们被植入到体内的自身组织上时，它们具有高的渗透压且能够将水抽吸出周围的组织。
[0209]根据本发明的一些实施方案，如通过在与明胶溶液混合以形成明胶-mTG组合物的mTG溶液中包括脲络合剂或脲螯合剂，必要时连同活性剂来中和明胶溶液中脲的作用。另外，催化脲的水解的剂可以被包括在具有类似作用的mTG溶液中。当mTG溶液混合到明胶溶液中时，脲螯合剂或脲水解剂立即与明胶溶液中的脲形成反应并中和或降低了其对明胶-mTG组合物可能的不期望的作用。脲螯合剂或脲水解剂可以任选地对明胶-mTG组合物的机械性能具有积极作用并增大了组合物的胶粘强度、粘合强度和/或弹性(不希望提供封闭的列表且还不希望受到一种假设的限制)。
[0210]用于催化脲的水解的剂的非限制性实例是脲酶，脲酶是一种市售的酶，其催化脲水解成二氧化碳和氨。脲酶存在于许多细菌、几种酵母物种以及许多高等植物中。两个示例性的来源是:刀豆(直生刀豆(Canavlia ensiformis))和巴氏芽孢杆菌(Bacilluspasteurii),已经从刀豆结晶出脲酶并得到充分的研究。
[0211]脲酶优选地以范围在约0.1M到相应明胶溶液中的脲的摩尔浓度的约2倍，至多溶液中脲酶的饱和点的浓度被包括在mTG溶液中，mTG溶液将添加到该相应明胶溶液中以形成明胶-mTG组合物。例如，如果IM脲被包括在明胶缓冲液中，那么脲酶的最大优选浓度是2M。此优选浓度指1: 2，mTG溶液:明胶溶液的比，该比在本文所述的明胶_mTG组合物中是优选的且允许每分子脲一分子脲酶。
[0212]根据本发明的一些实施方案，脲酶连同脲酶稳定剂一起包括在mTG溶液中。这种稳定剂的非限制性实例是约IM到约3M浓度的EDTA或mTG缓冲液中约50% v/v浓度的丙三醇。另外的实施例包括谷胱甘肽和柠檬酸盐，正如美国专利第4，188，465号中描述的。
[0213]脲络合剂的非限制性实例是石蜡，其可以在诸如低分子量醇和酮的活性剂的存在下络合脲。这样的过程描述在美国专利第2，719，145号中。
[0214]增塑剂
[0215]本发明的一些实施方案包括向组合物的交联材料的溶液，而不是向组合物的可交联蛋白组分中添加山梨糖醇。
[0216]出人意料地，正如下面详细描述的，发现包括在mTG溶液中的山梨糖醇可以在开始明胶交联之前，意想不到地与明胶溶液结合。在与明胶溶液混合之前将山梨糖醇添加到mTG溶液中时，山梨糖醇增强了明胶-mTG组合物的柔性和弹性。这种增强的柔性和弹性可以任选地表示组合物的某些应用或用途的改进的性能。而且，山梨糖醇可以作为mTG的载体分子，避免mTG氧化并增加了 mTG溶液的贮存期限。
[0217] 虽然被包括在mTG溶液中，但是优选地参照对应于特定的mTG溶液的明胶溶液中的明胶的量来确定待添加的山梨糖醇的优选浓度。以相应明胶溶液中的明胶的量的重量比表示的增塑剂的优选浓度的范围在1:1到3:1。添加到溶液中的此范围内的增塑剂的量并不会对明胶溶液的交联时间具有显著的影响。
[0218]如上所述，mTG促进的交联的明胶组合物的性能可以根据用于mTG溶液的缓冲液来改变。例如，当使用柠檬酸钠缓冲液时，包含山梨糖醇的明胶-mTG组合物是极柔性的。当使用乙酸钠缓冲液时，极大地缩短了形成结实的明胶凝胶所要求的交联时间。就柠檬酸钠和乙酸钠缓冲液两者来说，明胶-mTG组合物在山梨糖醇存在时比山梨糖醇不存在时具有更强的弹性和柔性。
[0219]依据下面示例性的、非限制性的实施例描述了向用柠檬酸钠缓冲液制备的mTG溶液中添加山梨糖醇。此试验实施例中的试验数据证实了山梨糖醇进一步增强了用柠檬酸钠缓冲液中的mTG制备的凝胶的柔性。
[0220]当山梨糖醇被包括在mTG溶液中时，与柠檬酸钠用作mTG溶液的缓冲液时制备的凝胶相比，乙酸钠用作mTG溶液的缓冲液时，mTG以更快的速率促进明胶凝胶的交联，正如下面详细描述的。
[0221]可以用在本发明上下文中的增塑剂的进一步的实例包括，但不限于，柠檬酸烷基酯、丙三醇、丙三醇酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、脱水山梨糖醇酯、乙酰化单酸甘油酯、丙三醇、脂肪酸酯、二醇、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、泊洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂或食用油的单甘油酯和二甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇(PEG) 200到20，000、碳蜡聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、阿拉伯树
胶、瓜尔胶、黄原酸 胶、Plasdone? (聚乙烯吡咯酮)、甘露醇及其混合物。
[0222]显示出阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、PEG6000和Plasdone增强了 mTG交联的明胶组合物的柔性。优选地，本发明的增塑剂包括山梨糖醇、聚乙二醇、聚乙烯醇或阿拉伯树胶中的一种或多种，尽管其他有用的增塑剂也可以被包括在正如本文描述的本发明的这些实施方案中。
[0223]稳液剂和/或滲透物
[0224]稳液剂是增强水溶液中围绕蛋白的溶剂化层中的水分子的秩序的物质且因此:
[0225]?使水溶液中的大分子和蛋白稳定
[0226].增强疏水作用、分子间相互作用以及蛋白聚集。
[0227]稳液剂对生物分子的作用通常与诸如脲和氯化胍(GuCl)的离液剂的作用相反。离液剂破坏了水的结构且因此，以蛋白-蛋白相互作用为代价，在水与蛋白之间形成新的氢键,这导致:
[0228].聚集体的溶解
[0229].通过使蛋白的内部疏水区域暴露于溶液而使球蛋白解折叠
[0230]如上所述，诸如脲和GuCl的离液剂可以用于通过使蛋白/多肽链之间的氢键网络不稳定来破坏某些蛋白/多肽溶液的物理胶凝。因而，这些离液剂降低了这些溶液的溶胶到凝胶的转变温度。
[0231]然而，在一些情形中，破坏蛋白/多肽溶液的物理胶凝可能对交联的蛋白组合物的机械性能产生不利的影响。例如，物理胶凝可以起到增强这种组合物的弹性的作用。破坏物理胶凝可以降低这些组合物的弹性并增强它们的脆性，这对某些应用来说是不期望的。[0232]通过将稳液剂引入到交联材料的溶液中，可以刺激物理胶凝与由交联材料促成的胶凝一起发生，优选是同时发生，因而维持了物理胶凝的有益的机械性能效果。
[0233]在本发明的一些实施方案中，降低了蛋白/多肽溶液的溶胶-凝胶转变点并将一种或多种稳液剂引入到交联材料或交联材料的溶液中。
[0234]在优选的实施方案中，以足以使蛋白/多肽溶液中发生物理胶凝的浓度添加稳液剂。
[0235]稳液剂浓度的非限制性范围是合并的交联蛋白组合物的0.5M-1M。
[0236]在一些实施方案中,稳液剂是离子型稳液剂。
[0237]在优选的实施方案中,稳液剂是非离子型稳液剂。
[0238]非离子型稳液剂的非限制性实例是脯氨酸和海藻糖。
[0239]离子型稳液剂的非限制性实例是三甲胺N-氧化物(TMAO)和谷氨酸(谷氨酸)。
[0240]稳液剂对体外蛋白稳定性的稳定作用以及它们与脲的反作用可能与它们在体内起到渗透物的作用有关。已经证明了脯氨酸的体外作用与体内作用之间的良好关系(Fisher 等人，PNAS103,2006 --第 13265-6 页)。
[0241 ] 在优选的实施方案中，用在本发明中的稳液剂是渗透物。
[0242]渗透物的非限制性实例是谷氨酸或脯氨酸。
[0243]交联剂抑制剂
[0244]当增加蛋白/多肽溶液中的交联密度时，增加了交联组合物的硬度。因此，若期望由交联蛋白组合物增加柔性或弹性，那么交联抑制剂可以用于限制组合物中的交联密度。实现此的一种方式是通过向组合物中引入交联剂抑制剂来减少蛋白溶液中由交联材料催化的交联的量。
[0245]在本发明的实施方案中，向蛋白溶液或交联剂溶液中添加交联抑制剂，因此降低了交联组合物的交联程度。
[0246]在本发明的优选实施方案中，交联材料是酶且抑制剂是酶抑制剂。
[0247]在本发明的更优选实施方案中，交联材料是转谷氨酰胺酶(TG)且抑制剂是转谷氨酰胺酶抑制剂。
[0248]在本发明的更优选实施方案中，交联材料是微生物转谷氨酰胺酶(mTG)且抑制剂是mTG抑制剂。
[0249]mTG抑制剂的非限制性实例包括胱胺(一种可以与mTG形成二硫键的有机二硫化物)、半胱氨酸(一种具有反应性S-H侧链(巯基侧链)的疏水性氨基酸)、黑色素、变性剂、具有巯基或二硫键的其他化合物、赖氨酸以及包含mTG底物的尺寸< 5kDA的化合物。
[0250]巯基侧链，诸如胱胺、半胱氨酸、二硫苏糖醇(DTT)和巯基乙醇中的巯基侧链可以作为抑制剂，因为它们可以通过与mTG巯基反应来阻断mTG的活性部位。
[0251]之前将黑色素描述为具有竞争性mTG抑制剂的作用(Ikura K等人，B1sciB1technol B1chem.66 (6)，2002，第 1412-1414 页)。
[0252]在本发明的优选实施方案中，包括足以将交联活性抑制了低于50%的量的抑制剂。在更优选的实施方案中，包括足以将交联活性抑制了低于30%的量的抑制剂。
[0253]在本发明的另一个实施方案中，在已经开始交联之后，将抑制剂释放到组合物中。
[0254]可交联蛋白/多肽的PEG或PVA共聚物[0255]根据一些实施方案，将聚乙二醇(PEG)(也被称为聚(环氧乙烷)(PEO)或聚氧乙烯(POE))作为共聚物被添加到蛋白/多肽或交联剂溶液中，以改善组合物的一种或多种性能，例如(且不限于)增强组合物的柔性或避免身体对蛋白-交联剂组合物的免疫反应。可以获得300Da到1MDa的宽范围分子量内的PEG且PEG可以是液体或低熔点固体，这取决
于分子量。
[0256]还可以获得不同形式的化学修饰的PEG，这取决于用于聚合过程的引发剂，最常用的是单官能的甲基醚PEG(甲氧基聚(乙二醇))。还可以获得具有不同几何形状的PEG。支化PEG具有从中间的核心基团弓丨出的3到10个PEG链。星型PEG具有从中间的核心基团引出的10-100个PEG链。梳型PEG具有通常接枝到聚合物主链的多个PEG链。所有这些类型的PEG在本发明中都应该被认为是有用的。
[0257]可以将PEG添加到蛋白-交联剂组合物的蛋白或交联剂组分中。优选地，以蛋白:PEG 20: I到1:1之间的干重比添加PEG。可以通过蛋白或交联剂的修饰和/或PEG分子的修饰将PEG添加到蛋白组分或交联剂组分。这种修饰的一个实例是被称为聚乙二醇化的过程。聚乙二醇化是PEG结构共价连接到另一个较大分子上的行为。此过程可以在蛋白或交联剂分子上实施。
[0258]明胶聚乙二醇化实施方案除了许多优势以外以及不希望为限制性的，还具有PEG是蛋白链的一部分的优势，因此引起蛋白表面性能的变化，表面性能包括但不限于电荷和亲水性，以及由于其松散性引起的空间效应。因此，共价连接的PEG可以对蛋白链之间的分子间相互作用产生极大的影响且转而 对物理胶凝和交联剂依赖性交联以及对由这些方法制备的凝胶的机械性能产生极大的影响。
[0259]用于聚乙二醇化的PEG分子通常是被活化的，意指它们自发地与靶蛋白上的官能团反应。聚乙二醇化的非限制性实例是使用PEG的NHS酯衍生物。这些活化的PEG分子与蛋白上的伯胺反应以形成酰胺键并释放N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)
[0260]可以修饰蛋白的其他方式是通过使赖氨酸的链内部和蛋白链的氨基端处存在的伯胺反应。修饰可以通过烷基化、琥珀酰化、氨甲酰化或通过蛋白修饰的任何其他方法。
[0261]在优选的实施方案中，可交联蛋白/多肽先与活化的PEG反应以产生聚乙二醇化蛋白。通过下述方法从过量的未反应的PEG和其他反应产物中纯化聚乙二醇化蛋白，这些方法诸如，但不限于，透析、超滤和凝胶过滤色谱法。随后，聚乙二醇化蛋白可以与交联剂反应以形成交联凝胶。
[0262]也可以通过将PEG胺用作靶向胺基的交联剂的底物来任选地添加PEG。交联剂通过其端氨基将PEG分子交联到蛋白分子上的交联剂底物上，因而与蛋白上自身的氨基竞争。
[0263]PEG胺包括已经结合到胺官能团的PEG。这些PEG胺以所有类型的PEG几何形状来市售。胺官能的PEG产物的来源包括NOF(Japan)、Nanocs (New York, NY)和PierceB1technology(Rockford, IL)。
[0264]在结合PEG的所有方法中，减少了可用于交联的天然底物的数目，这导致减少的交联。这可以影响交联凝胶的机械性能，如任选地使交联凝胶的刚性变弱且柔性更强。此外且不希望受到一种假设的限制，PEG分子本身可以作为增塑剂且还有助于所得凝胶的柔性。[0265]根据优选的实施方案，PEG胺包括活性赖氨酸氨基酸。
[0266]根据本发明的另一个实施方案，将聚乙烯醇(PVA)作为共聚物添加到明胶或mTG溶液中以增强蛋白-交联剂组合物的柔性或粘合性。PVA是具有高拉伸强度和柔性的水溶性合成聚合物。在高湿度环境中，诸如在身体内，PVA将吸收水。作为增塑剂的水可以降低PVA的拉伸强度，但增大其延伸。
[0267]根据一些实施方案，共聚物包括PVA-胺。将胺靶向交联剂添加到溶液中时，蛋白和PVA-胺都将作为底物且将形成具有比相当的交联蛋白聚合物的柔性好的蛋白-PVA共聚物。
[0268]可以用于产生聚(乙烯醇)的胺官能衍生物的方法的非限制性实例描述在美国专利 6107401 中。
[0269]可以用于产生PVA的胺共聚物的方法的非限制性实例描述在美国专利4931501
中，其中聚(乙烯醇)与氨基-醛二烷基缩醛反应。
[0270]作为另一个非限制性实例，之前描述了使用羰基二咪唑活化的二胺通过两步法合成胺修饰聚(乙烯醇)以产生具有不同胺取代度的PVA的方法(Wittman M等人，B1physical and Tr ansfect1n Studies of an Amine-Modified Poly(vinyl alcohol)for Gene Delivery (用于基因递送的胺修饰聚(乙烯醇)的生物物理和转染研究)。B1conjugate Chem.，16 (6)，1390-1398, 2005)。
[0271]表面活性剂
[0272]根据本发明的一些实施方案，将一种或多种生物相容的表面活性剂添加到可交联蛋白或多肽的溶液中，如为了降低溶液的表面张力。
[0273]表面活性剂是降低液体表面张力的润湿剂，使得易于散布并降低两种液体之间的界面张力。较低的表面张力有利于容易处置可交联肽的溶液，因为其易于通过涂布器，且易于与可交联材料的溶液混合。表面活性剂还可以降低溶液的粘度。另外，当明胶溶液单独或与mTG溶液一起被冻干时，降低明胶溶液的表面张力具有大的益处，因为其可以防止在干明胶的顶层上形成膜。这种膜抑制冻干明胶重建成均匀的溶液。
[0274]用于本发明上下文中的生物相容的表面活性剂的非限制性实例是聚山梨醇酯20(Tween?20)、聚氧乙烯二醇十二烷基醚(Bri j?35)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(PluronicTMF-68)、月桂基硫酸钠(SLS)或十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基乙醚硫酸钠或月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(SLES)、泊洛沙姆或泊洛沙胺、烷基多葡糖苷、脂肪醇、脂肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺和椰油酰胺二乙醇胺。
[0275]表面活性剂也可以用作增塑剂。例如，已经显示出TweenSO降低了若干种亲水性聚合物的玻璃化转变点(Tg)。聚合物内存在较小分子的TWeen80被认为稀释并减弱了聚合物链之间的粘结相互作用。这通过增大聚合物基体内的体积而减轻了摩擦和缠结。(Ghebremeskel 等人，2006, Internat1nal Journal of Pharmaceutics328:119-129)。
[0276]在本发明的优选实施方案中，一种或多种表面活性剂用作增塑剂以改进交联组合物的弹性，特别因为其随着时间变硬。
[0277]在另一个任选的实施方案中，一种或多种表面活性剂与来自上面列出的与本发明有关的增塑剂中的另外的增塑剂相结合。Rodriguez等人(Food ResearchInternat1nal39 (2006) 840-6)证明了增塑剂(丙三醇)和表面活性剂(Tween20、Span80、卵磷脂)对增强非交联的干凝胶膜的弹性的协同效应。
[0278]优选地，以溶液中明胶干重的0.1% -5%的重量比将表面活性剂添加到明胶溶液中。可选择地，以约等于溶液中的那种特定表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)的浓度将表面活性剂添加到明胶溶液中。每一种表面活性剂的CMC是变化的且依赖于溶解了表面活性剂的溶液的离子浓度。
[0279]鉬织某质中和
[0280]根据本发明的一些实施方案，止血组合物或体液密封组合物还包括基质特异性结合剂，这中和了表面材料对用组合物密封、附着或以其他方式处理的组织基质的粘合抑制作用。例如，这些剂可以结合、溶解和/或分散具有抗粘合作用的基质表面材料。
[0281]根据优选的实施方案，本发明的组合物旨在粘合到粘膜，诸如胃肠道(GIT)或颊粘膜。
[0282]GIT中的组织，诸如肠，通常有粘膜，覆盖有连续产生的粘液。由于粘液不断地进行自我更新，因此成功地附着到GIT内的组织要求组合物特异性粘合到粘膜层下的组织本身。
[0283]特异性粘合GIT的靶向区域的一种方式是通过使用能够可逆地结合到GIT内的细胞表面的粘膜粘合剂。这些粘膜粘合剂以较大特异性发挥作用，因为它们是基于受体-配体样相互作用，其中分子牢固地且快速直接结合到粘膜细胞表面，而不是粘液本身。
[0284]具有这些独特要求的一类化合物的非限制性实例是凝集素。凝集素是蛋白或糖蛋白并享有特异性且可逆地结合到糖类的普遍能力。它们以可溶的或细胞结合的形式存在并具有糖选择性和识别部分。肠上皮细胞具有包含膜锚固的糖缀合物的细胞表面。正是因为凝集素能够祀向这些表面，因而实现了肠内递送构想(Shah KU, Rocca JG., Drug Deliv.Tech.,2004,4(5)，I)。
[0285]粘膜粘合凝集素的非限制性实例是番茄凝集素(TL)。已经在体外结合方面广泛研究了 TL且显示出TL选择性地结合到小肠上皮(Lehr C, Bouwstra JA, KokW, Noach AB, deBoer AG, Junginger HE.Pharma Res.，1992,9 (4)，547-53。)
[0286]凝集素用于改进粘合到包含膜锚固的糖缀合物的所有粘膜组织表面。这种组织表面的非限制性实例是颊粘膜和肠道壁。
[0287]改进颊粘膜粘合的化合物的非限制性实例是聚(天冬氨酸)(PAA)和聚乙二醇(PEG)单乙醚单甲基丙烯酸酯(PAA-共-PEG) (PEGMM)的共聚物(Shojaei AM，LiX.J.Control.Release，1997，47，151-61.27。)。优选地，PEGMM 是 16mol % 的 PEGMM，其具有最有利的热力学曲线和最闻的粘I吴粘合力。
[0288]根据本发明的一些实施方案，粘膜粘合剂是市售的粘膜粘合剂水凝胶。适用于改进本文描述的新颖的组合物的基质特异性粘合的水凝胶的非限制性实例是以商品名Corplex?出售(Corium Technologies,Menlo Park, CA)。这些粘合性水凝胶是通过膜形成亲水性聚合物(如，聚乙烯吡咯烷酮，(PVP))与其链端具有补充的反应性羟基的短链增塑剂(通常是，但不一定是PEG)的非共价(氢键)交联制备的。
[0289] 粘膜粘合化合物的另一种非限制性实例包括具有一个或多个巯基的聚合物。在这种聚合物中，引入巯基(sulphahydryl)增强了粘膜粘合剂聚合物的粘合性能((Bernkop-Schnurch A, Schwarch V, Steininger S.Pharm.Res., 1999,16,6,876-81.32。)。证明了对猪的肠粘膜的改进的粘合。已经证明了巯基化聚合物(巯基化物(th1mer))强力的颊粘合性能(Langoth N, Kalbe J, Bernkop-Schnurch A.1nt.J.Pharm., 2003, 252,141-48。)。
[0290]颊粘合剂的另一种非限制性实例是从哈克木属(Hakea)得到的天然的粘膜粘合树胶(Alur HH, Pather SI, Mitra AK, Johnston TP.1ht.J.Pharm.，1999,88 (I)，1-1O0 )
[0291]酶钝化&浓缩
[0292]根据本发明的一些实施方案，转谷氨酰胺酶溶液经历一步或多步纯化以实施下述中的一个或多个I)从转谷氨酰胺酶混合物中去除发酵残余物；2)浓缩转谷氨酰胺酶溶液中活性转谷氨酰胺酶的量；3)从载体蛋白或糖进一步纯化转谷氨酰胺酶溶液；4)降低转谷氨酰胺酶溶液中的内毒素水平；和/或5)从转谷氨酰胺酶溶液中去除所有的微生物，有效地灭菌溶液；全都不希望受限于封闭的名单。
[0293]在至少一些实施方案中，本发明还提供了一种用于制备止血组合物或体液密封组合物的方法，该方法包括提供可交联蛋白或多肽的溶液；提供交联材料的溶液；以及将可交联蛋白或多肽的溶液与交联材料的溶液混合。
[0294]根据一些实施方案，在与多肽的可交联蛋白混合之前，过滤交联材料的溶液。
[0295]在本发明的优选实施方案中，过滤过程首先采用粗过滤，有时称为澄清，以去除将会迅速堵塞更细的过滤步骤的大块发酵残余物。这种粗过滤的非限制性实例是约0.45 μ m孔径的过滤和约0.65 μ m孔径的过滤。 [0296]根据本发明的另一个优选的实施方案，交联材料的溶液任选地且优选地通过小于0.22 μ m孔径的过滤器，如以将材料的生物负载降低到低于10个菌落形成单位(CFU)每克并使其适于医疗应用。优选地，几乎消除了生物负载以获得小于约10_2且更优选小于约10_3的无菌保证水平(SAL)，其中SAL是用在微生物学中来描述已经经受灭菌过程后，单一单位是非无菌的可能性的术语。
[0297]根据本发明的另一个优选的实施方案，切线流过滤或中空纤维超滤技术不仅用于通过去除载体糖和蛋白来纯化交联材料的溶液，而且用于浓缩溶液。用于本发明的优选的孔径是小于交联组合物的组分的尺寸的孔径。
[0298]在优选的实施方案中，交联材料是mTG且孔径在10kDa_50kDa的范围内。在更优选的实施方案中，交联材料是mTG且孔径在10kDa-30kDa的范围内。
[0299]根据另一个实施方案，一个或多个尺寸排阻色谱步骤用于选择性地将交联材料与周围的材料分开。
[0300]根据另一个实施方案，一个或多个疏水相互作用或亲水相互作用色谱步骤用于选择性地将交联材料与周围的材料分开。
[0301]根据本发明的另一个优选的实施方案，交联材料是蛋白，且一个或多个离子交换色谱法步骤用于优先结合交联蛋白，由此从周围的材料纯化交联蛋白。
[0302]根据更优选的实施方案，交联蛋白是mTG且一个或多个阳离子交换色谱法步骤用于纯化mTG。
[0303]在优选的实施方案中，阳离子交换树脂是琼脂糖树脂。
[0304]根据另一个优选的实施方案，纯化将交联材料的内毒素水平降低到< 5内毒素单位(EU)每克。[0305]根据另一个优选的实施方案，交联材料是mTG且纯化产生mTG组合物，其中比活性大于20个酶单位每毫克且优选大于25个单位每毫克。
[0306]根据另一个优选的实施方案，交联材料是mTG且纯化产生至少95%且优选至少98%的电泳纯度。
[0307]作为非限制性实例，本文描述了 mTG纯化过程，该过程纯化食品级mTG产品以产生具有比活性>25个酶单位每克、>95%电泳纯度、<5内毒素单位每克和< 10CFU/g的mTG组合物。
[0308]如上所述，mTG浓度对本发明组合物的一些实施方案也是优选的参数。上面的纯化过程还可以产生浓度更大的mTG材料。除了交联明胶比交联未浓缩的mTG溶液更快之外，浓缩的mTG溶液形成的凝胶比未浓缩的对照的弹性更强、粘合性更强和透明度更高。
[0309]酶溶液的增大的粘度
[0310]根据本发明的另一个实施方案，增大无毒性交联剂溶液的粘度，以便减小交联剂溶液与明胶溶液之间的粘度差异。减小的溶液粘度的差异能够快速且均匀地混合两种溶液。
[0311]在本发明的优选实施方案中，将交联剂溶液的粘度增大至50cP到5000cP之间。
[0312]在本发明的更优选的实施方案中，将交联剂溶液的粘度增大至150cP到2500cP之间。
[0313]在此实施方案的非限制性实例中，向交联剂溶液中添加无胺官能团的高分子量分子以增大其粘度。这种分子的非限制性实例是可溶性淀粉，聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)。
[0314]在本发明的优选实施方案中，向交联剂溶液中添加一种或多种增粘剂以增大溶液的粘度而不会抑制交联反应超过50 %，优选地，不会抑制反应超过30 %，且甚至更优选地，不会抑制该反应。合适的增粘剂的非限制性实例包括藻酸酯、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和plasdone。
[0315]可交联蛋白/多肽的氨甲酰化的抑制
[0316]正如本专利中较早描述的，在本发明的一些实施方案中，使用脲以降低蛋白溶液的溶胶-凝胶转变点。使用脲可引起的一个缺点在于其可以离解成氰酸。氰酸盐离子与蛋白上的伯氨基团反应以产生氨甲酰化衍生物。这在称为氨甲酰化的过程中使可交联蛋白上的氨基去官能化。在本发明的优选实施方案中，可交联蛋白中的交联底物之一包括一种或多种胺基。当这些基团被去官能化时，减少了可用于交联的底物的数目且交联速率降低。脲存在于溶液中的时间以及溶液的温度影响氨甲酰化的速率，这是因为脲以温度依赖性速率随时间分解成氰酸盐。
[0317]并不是出人意料地，氨甲酰化会对本发明所述的实施方案可能带来问题，因为此过程先前已经被描述成对胺官能的蛋白和多肽产生不利的影响。美国专利4，605，513描述了一种通过使用1，2_乙二胺或结构上与1，2_乙二胺相关的化合物来抑制多肽的氨甲酰化的方法。美国专利7，459，425B2描述了一种用于通过添加氨甲酰化抑制剂来在包含脲或氰酸盐的溶液中抑制多肽的氨甲酰化的方法。
[0318]【背景技术】中描述的氨甲酰化抑制过程依赖于使用竞争性的胺基底物来结合氰酸盐离子，否则氰酸盐离子将造成靶分子的氨甲酰化。这些【背景技术】的方法可以产生关于本发明的优选实施方案的问题，这是因为可交联蛋白的可交联底物包括胺基。因此，添加竞争性胺基底物可以竞争性地抑制靶可交联蛋白的交联。举一个这样的实例，发明人发现在美国专利7，459，425B2中公开为优选的氨甲酰化抑制剂的羟胺增加了已经与脲孵育的蛋白溶液的交联时间。
[0319]交联材料可以任选地包括具有与伯胺反应的官能团的化学实体，包括，但不限于，芳基叠氮化物、碳二亚胺、羟甲基膦、亚氨酸酯、NHS-酯、乙烯基-砜、二异氰酸酯和醛，诸如，如戊二醛和甲醛。
[0320]交联材料还可以任选地(可选择地或另外)包括具有胺基底物的酶交联剂。优选地，酶交联剂使用赖氨酸的ε氨基作为底物。这种酶的非限制性实例是微生物转谷氨酰胺酶(mTG)和组织转谷氨酰胺酶。
[0321]将期望【背景技术】中描述的化合物将会抑制转谷氨酰胺酶依赖性交联，这是因为这些化合物包含是转谷氨酰胺酶的优选底物的伯胺。出人意料地，与【背景技术】的教导不同，本发明人发现通过添加竞争性的氨甲酰化抑制剂可以抑制蛋白/多肽溶液中的氨甲酰化且不会不利地影响蛋白/多肽的胺基依赖性交联。
[0322]在本发明的实施方案中，可交联蛋白/多肽组合物包括氨甲酰化抑制剂。
[0323]氨甲酰化抑制剂的非限制性描述是可以是比靶向蛋白/多肽更优先的氨甲酰化的底物的任何分子。
[0324]抑制剂的非限制性实例是在其结构中具有伯胺的分子。
[0325]在优选的实 施方案中，氨甲酰化抑制剂不抑制多肽的交联能力或不会以比它们抑制氨甲酰化反应更大的程度抑制其交联能力。
[0326]在另一个优选的实施方案中，氨甲酰化抑制剂不抑制交联活性或不会以比它们抑制氨甲酰化反应更大的程度抑制其活性。
[0327]根据优选的实施方案，氨甲酰化抑制剂包括氨基酸或氨基酸盐。
[0328]根据更优选的实施方案，氨甲酰化抑制剂是甘氨酸或组氨酸中的一种或多种。根据更优选的实施方案，氨甲酰化抑制剂是甘氨酸。
[0329]甘氨酸任选地且优选地以约0.05M到约1.5M的浓度存在于组合物中。更优选地，以约0.1M到约0.9M的浓度使用甘氨酸。
[0330]出人意料地，本发明人发现虽然甘氨酸包含胺基，但是其并不抑制转谷氨酰胺酶的交联活性或mTG依赖的明胶交联的动力学。
[0331]显示出与包含其他伯胺基团的物质相比，甘氨酸在包含脲的明胶溶液中优先抑制氨甲酰化，并且是以剂量依赖的方式。组氨酸也可以任选地用于抑制氨甲酰化。
[0332]氰酸钠也产生抑制作用，这证实了脲分解是抑制mTG交联的原因。
[0333]可交联蛋白中的胺基的修饰
[0334]在本发明的另一个实施方案中，可交联蛋白/多肽包含胺基，胺基是交联材料的底物，且可交联蛋白/多肽上的伯胺基被修饰。
[0335]在明胶中，相关的胺基是赖氨酸侧链上的ε胺和明胶链的氨基端的游离胺。
[0336]修饰可交联蛋白/多肽上的胺基可以减少可用于交联的可交联底物的数目，由此通过维持组合物的弹性或改变组合物的化学性能，诸如表面电荷或亲水性来改进可交联蛋白组合物的机械性能。[0337]在本发明的实施方案中，可以任选地用一种或多种方法来实施伯胺的修饰，这些方法包括但不限于烷基化、酰胺化、氨甲酰化或琥珀酰化。
[0338]在另一个实施方案中，可以任选地通过蛋白与醋酸酐、戊二酸酐和柠康酐反应来修饰明胶上的伯胺基。
[0339]在另一个实施方案中，还可以任选地通过与琥珀酰亚胺酯的衍生物反应来修饰伯胺基。此外，可以通过聚乙二醇化修饰伯胺基。在优选的实施方案中，琥珀酰化蛋白/多肽。
[0340]琥珀酰化是一种琥珀酸酐与赖氨酸的ε氨基和/或蛋白/多肽的氨基-N-端α -氨基反应的过程。
[0341]
【权利要求】
1.一种组合物，包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白交联的酶、金属离子以及变性剂，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白，其中所述可交联蛋白或多肽包括明胶，其中所述酶包括转谷氨酰胺酶，其中所述金属离子包括任何药学上可相容的盐形式的钙并且其中所述变性剂包括脲。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述明胶是至少250bloom。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述钙盐包括氯化钙或氢氧化钙中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述钙以至多IM的量存在。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述脲以至多4M的量存在。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，还包括钙螯合剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述钙螯合剂包括EDTA、柠檬酸盐或calgon中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述柠檬酸盐或所述EDTA是以从0.01M到2M的量存在的。
9.如权利要求8 所述的组合物，其中所述柠檬酸盐或所述EDTA是以从0.05M到0.2M的量存在的。
10.如权利要求1所述的组合物，还包括能够共价结合到所述明胶的PEG(聚乙二醇)衍生物。
【文档编号】C08H1/00GK104031393SQ201410163235
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2009年6月18日 优先权日:2008年6月18日
【发明者】奥莱恩·普里斯-布鲁姆, 艾沙伊·艾塔, 纳塔利·伊莱姆, 查盖·康罗思, 梅厄·哈伯 申请人:生命连结有限公司