化合物的生物合成基因簇及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及j1001-2化合物的生物合成基因簇及其应用，更具体地，涉及j1001-2化合物的生物合成基因簇、微生物和制备j1001-2化合物的方法。

背景技术：

聚酮化合物是天然产物最多的类群之一，因其巨大的药用价值而被广泛应用于医用、兽用和农用等领域。例如抗生素红霉素、抗寄生虫抗生素阿维菌素等。聚酮化合物是有聚酮合酶(pks)催化形成的，以模块形式组装成的基因簇决定了聚酮化合物结构从而决定了其生物活性，因此一个新化合物的基因簇对其后续研究有着极为重要的意义。

随着致病菌耐药性问题的日益严峻，临床上对新抗生素的需求也显得更为迫切。为了应对这一局面，人们一方面对已有抗生素进行改造，另一方面也加快了新型抗生素筛选的步伐。j1001-2化合物是最近发现的一种抗生素，具有良好的抑菌活性。

迄今为止，还没有j1001-2化合物生物合成基因簇相关研究的报道。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有抗菌活性的抗生素-j1001-2化合物的生物合成基因簇。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种j1001-2化合物的生物合成基因簇，其中，所述j1001-2化合物结构如下，

根据本发明的实施例，所述生物合成基因簇包括：

ⅰ型线性聚酮合成酶基因模块，所述ⅰ型线性聚酮合成酶基因模块包括：2a1基因、2a2基因、2a3基因、2a4基因、2a5基因、2a6基因、2a7基因、2a8基因、2a9基因、2a10基因和2a11基因；

糖基合成相关基因模块，所述糖基合成相关基因模块包括：2g1基因、2g2基因、2g3基因、2g4基因、2g5基因、2g6基因、2g7基因、2g8基因和2m基因；以及

修饰基因模块，所述修饰基因模块包括：2o基因、2i基因、2e基因、2p1基因和2p2基因。

发明人惊奇的发现，本发明实施例的j1001-2化合物的生物合成基因簇可以控制j1001-2化合物的生物合成。

根据本发明的实施例，所述2a1基因编码seqidno：1所示的氨基酸序列；所述2a2基因编码seqidno：2所示的氨基酸序列；所述2a3基因编码seqidno：3所示的氨基酸序列；所述2a4基因编码seqidno：4所示的氨基酸序列；所述2a5基因编码seqidno：5所示的氨基酸序列；所述2a6基因编码seqidno：6所示的氨基酸序列；所述2a7基因编码seqidno：7所示的氨基酸序列；所述2a8基因编码seqidno：8所示的氨基酸序列；所述2a9基因编码seqidno：9所示的氨基酸序列；所述2a10基因编码seqidno：10所示的氨基酸序列；所述2a11基因编码seqidno：11所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述2g1基因编码seqidno：12所示的氨基酸序列；所述2g2基因编码seqidno：13所示的氨基酸序列；所述2g3基因编码seqidno：14所示的氨基酸序列；所述2g4基因编码seqidno：15所示的氨基酸序列；所述2g5基因编码seqidno：16所示的氨基酸序列；所述2g6基因编码seqidno：17所示的氨基酸序列；所述2g7基因编码seqidno：18所示的氨基酸序列；所述2g8基因编码seqidno：19所示的氨基酸序列；所述2m基因编码seqidno：20所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述2o基因编码seqidno：21所示的氨基酸序列；所述2i基因编码seqidno：22所示的氨基酸序列；所述2e基因编码seqidno：23所示的氨基酸序列；所述2p1基因编码seqidno：24所示的氨基酸序列；所述2p2基因编码seqidno：25所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，该生物合成基因簇进一步包括：调节基因模块，所述调节基因模块包括：2r1基因、2r2基因、2r3基因、2r4基因、2t1基因、2t2基因、2t3基因、2t4基因和2t5基因。

根据本发明的实施例，所述2r1基因编码seqidno：26所示的氨基酸序列；所述2r2基因编码seqidno：27所示的氨基酸序列；所述2r3基因编码seqidno：28所示的氨基酸序列；所述2r4基因编码seqidno：29所示的氨基酸序列；所述2t1基因编码seqidno：30所示的氨基酸序列；所述2t2基因编码seqidno：31所示的氨基酸序列；所述2t3基因编码seqidno：32所示的氨基酸序列；所述2t4基因编码seqidno：33所示的氨基酸序列；所述2t5基因编码seqidno：34所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，沿着基因的3’-5’端，所述2t2基因、所述2t1基因、所述2g8基因、所述2g7基因、所述2g6基因、所述2r4基因、所述2r3基因、所述2p1基因、所述2a8基因、所述2a11基因、所述2a9基因、所述2p2基因、所述2i基因、所述2o基因、所述2a10基因、所述2e基因、所述2a7基因、所述2g5基因、所述2g1基因、所述2g2基因、所述2g3基因、所述2g4基因、所述2m基因、所述2a6基因、所述2a5基因、所述2a4基因、所述2a3基因、所述2a2基因、所述2a1基因、所述2r2基因、所述2r1基因、所述2t5基因、所述2t4基因和所述2t3基因依次串联。

根据本发明的实施例，所述生物合成基因簇具有seqidno：35所示的核苷酸序列。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物具有前述的生物合成基因簇。发明人惊人地发现，利用该微生物进行发酵处理，可以高效、简单和低成本地合成j1001-2化合物。

根据本发明的实施例，所述微生物为链霉菌。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种制备j1001-2化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前述的微生物进行发酵处理，以便得到发酵后的微生物；将所述发酵后的微生物进行破壁处理，以便得到含有所述j1001-2化合物的溶液；以及从所述含有所述j1001-2化合物的溶液中纯化所述j1001-2化合物，以便得到所述j1001-2化合物的纯品。

根据本发明实施例的制备j1001-2化合物的方法，利用前述的微生物进行发酵处理，可以高效地合成j1001-2化合物。然后，通过微生物破壁处理和分离纯化处理，可以高效、简单和低成本地获得j1001-2化合物纯品。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的j1001-2化合物的生物合成基因簇序列结构示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的制备j1001-2化合物的方法的流程示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的j1001-2化合物的生物合成途径的流程示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的j1001-2化合物的图谱示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种j1001-2化合物的生物合成基因簇。根据本发明的实施例，该生物合成基因簇包括：

ⅰ型线性聚酮合成酶基因模块，所述ⅰ型线性聚酮合成酶基因模块包括：2a1基因、2a2基因、2a3基因、2a4基因、2a5基因、2a6基因、2a7基因、2a8基因、2a9基因、2a10基因和2a11基因；

糖基合成相关基因模块，该糖基合成相关基因模块包括：2g1基因、2g2基因、2g3基因、2g4基因、2g5基因、2g6基因、2g7基因、2g8基因和2m基因；以及

修饰基因模块，该修饰基因模块包括：2o基因、2i基因、2e基因、2p1基因和2p2基因。

发明人惊奇的发现，本发明实施例的j1001-2化合物的生物合成基因簇可以控制j1001-2化合物的生物合成。

根据本发明的实施例，该生物合成基因簇(在本发明中，也简称为“基因簇”)为链霉菌的生物合成基因簇，具有seqidno：35所示的核苷酸序列，具体如下：

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以该链霉菌的生物合成基因簇为例，对生物合成基因簇进行解释说明，该生物合成基因簇包括ⅰ型线性聚酮合成酶基因模块、糖基合成相关基因模块和修饰基因模块。下面对该链霉菌的生物合成基因簇各模块进行详细描述，具体如下：

其中，ⅰ型线性聚酮合成酶基因模块包括2a1，2a2，2a3，2a4，2a5，2a6，2a7，2a8，2a9，2a10和2a11共11个基因，具体如下：

根据本发明的实施例，2a1基因编码seqidno：1所示的氨基酸序列。具体如下：

根据本发明的实施例，2a1基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第92698-101334个碱基处，长度为8637个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为2878个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a2基因编码seqidno：2所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a2基因位于该链霉菌的基因簇序列第85970-92683个碱基处，长度为6714个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为2237个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a3基因编码seqidno：3所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a3基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第73776-85781个碱基处，长度为12006个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为4001个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a4基因编码seqidno：4所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a4基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第62077-73755个碱基处，长度为11679个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3892个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a5基因编码seqidno：5所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a5基因簇位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第50179-62031个碱基处，长度为11853个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3950个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a6基因编码seqidno：6所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a6基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第45212-50158个碱基处，长度为4947个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为1648个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a7基因编码seqidno：7所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a7基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第33430-38406个碱基处，长度为4977个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为1658个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a8基因编码seqidno：8所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a8基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第7986-19214个碱基处，长度为11229个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为3742个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a9基因编码seqidno：9所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a9基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第25758-28115个碱基处，长度为2358个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为785个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a10基因编码seqidno：10所示的氨基酸序列，具体如下：

mepieestgdsrlaerlatatpeereqllrglvlrhaaeileapeldeesnfvengltsl60

ralqlskalmndtgleaplvaivehptptllgkflsetyeadaa(seqidno：10)

根据本发明的实施例，2a10基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第32185-32499个碱基处，长度为315个碱基对，编码聚酮合成酶的acp蛋白，长度为104个氨基酸。

根据本发明的实施例，2a11基因编码seqidno：11所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2a11基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第19227-25730个碱基处，长度为6504个碱基对，编码聚酮合成酶，长度为2167个氨基酸。

其中，糖基合成相关基因模块包括2g1、2g2、2g3、2g4、2g5、2g6、2g7、2g8和2m共9个基因，具体如下：

根据本发明的实施例，2g1基因编码seqidno：12所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2g1基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第40030-40842个碱基处，长度为813个碱基对，编码葡萄糖-1-磷酸：ttp胸苷基转移酶，长度为270个氨基酸。

根据本发明的实施例，2g2基因编码seqidno：13所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2g2基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第40839-41831个碱基处，长度为993个碱基对，编码dtdp葡萄糖-4,6-脱水酶，长度为330个氨基酸。

根据本发明的实施例，2g3基因编码seqidno：14所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2g3基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第41895-43199个碱基处，长度为1305个碱基对，编码ndp-d-葡萄糖-3，4-脱水酶，长度为434个氨基酸。

根据本发明的实施例，2g4基因编码seqidno：15所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2g4基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第43196-44194个碱基处，长度为999个碱基对，编码ndp-d-葡萄糖-4，6-脱水酶，ndp-d-葡萄糖-4-异构酶，ndp-d-葡萄糖-4-还原酶长度为332个氨基酸。

根据本发明的实施例，2g5基因编码seqidno：16所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2g5基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第38479-39750个碱基处，长度为1272个碱基对，编码糖基转移酶，长度为423个氨基酸。

根据本发明的实施例，2g6基因编码seqidno：17所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2g6基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第3445-4629个碱基处，长度为1185个碱基对，编码糖基转移酶，长度为394个氨基酸。

根据本发明的实施例，2g7基因编码seqidno：18所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2g7基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第1169-2848个碱基处，长度为1680个碱基对，编码糖基转移酶，长度为559个氨基酸。

根据本发明的实施例，2g8基因编码seqidno：19所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2g8基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第1-1116个碱基处，长度为1116个碱基对，编码内切葡聚糖酶，长度为371个氨基酸。

根据本发明的实施例，2m基因编码seqidno：20所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2m基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第44191-45117个碱基处，长度为927个碱基对，编码甲基转移酶，长度为308个氨基酸。

其中，修饰基因，包括2o、2i、2e、2p1和2p2共5个基因，具体如下：

根据本发明的实施例，2o基因编码seqidno：21所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2o基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第30711-32147个碱基处，长度为1437个碱基对，编码环氧化物酶，长度为478个氨基酸。

根据本发明的实施例，2i基因编码seqidno：22所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2i基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第29661-30569个碱基处，长度为909个碱基对，编码酮甾异构酶，长度为302个氨基酸。

根据本发明的实施例，2e基因编码seqidno：23所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2e基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第32547-33428个碱基处，长度为882个碱基对，编码环氧化物水解酶，长度为293个氨基酸。

根据本发明的实施例，2p1基因具有seqidno：24所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2p1基因位于该链霉菌的基因簇氨基酸序列第6809-7960个碱基处，长度为1152个碱基对，编码细胞色素p450蛋白，长度为383个氨基酸。

根据本发明的实施例，2p2基因编码seqidno：25所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2p2基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第28182-29462个碱基处，长度为1281个碱基对，编码细胞色素p450蛋白，长度为426个氨基酸。

根据本发明的实施例，该生物合成基因簇进一步包括：调节基因模块，该调节基因模块包括：2r1基因、2r2基因、2r3基因、2r4基因、2t1基因、2t2基因、2t3基因、2t4基因和2t5基因，上述基因的序列信息具体如下：

根据本发明的实施例，2r1基因编码seqidno：26所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2r1基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第103016-103636个碱基处，长度为621个碱基对，编码调节蛋白，长度为206个氨基酸。

根据本发明的实施例，2r2基因编码seqidno：27所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2r2基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第102065-102829个碱基处，长度为765个碱基对，编码调节蛋白，长度为254个氨基酸。

根据本发明的实施例，2r3基因编码seqidno：28所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2r3基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第5548-6558个碱基处，长度为1011个碱基对，编码转录调节因子，长度为336个氨基酸

根据本发明的实施例，2r4基因编码seqidno：29所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2r4基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第4589-5539个碱基处，长度为951个碱基对，编码转录调节因子，长度为316个氨基酸。

根据本发明的实施例，2t1基因编码seqidno：30所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2t1基因位于该链霉菌的seqidno：35所示的基因序列片段外，长度为1428个碱基对，编码膜整合型转移蛋白，长度为475个氨基酸。

根据本发明的实施例，2t2基因具有seqidno：31所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2t2基因位于该链霉菌的seqidno：35所示的基因序列片段外，具有seqidno:36所示的核苷酸序列，长度为687个碱基对，编码abc转移因子，长度为228个氨基酸。

根据本发明的实施例，2t3基因编码seqidno：32所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2t3基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第106595-107239个碱基处，长度为645个碱基对，编码双组分反馈调节因子，长度为214个氨基酸。

根据本发明的实施例，2t4基因编码seqidno：33所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2t4基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第105490-106689个碱基处，长度为1200个碱基对，编码化学受体，长度为399个氨基酸。

根据本发明的实施例，2t5基因编码seqidno：34所示的氨基酸序列，具体如下：

根据本发明的实施例，2t5基因位于该链霉菌的基因簇核苷酸序列第104394-105497个碱基处，长度为1104个碱基对，编码双组分传感器组氨酸激酶，长度为367个氨基酸。

参考图1，根据本发明的实施例，沿着基因的5’-3’端，2t2基因、2t1基因、2g8基因、2g7基因、2g6基因、2r4基因、2r3基因、2p1基因、2a8基因、2a11基因、2a9基因、2p2基因、2i基因、2o基因、2a10基因、2e基因、2a7基因、2g5基因、2g1基因、2g2基因、2g3基因、2g4基因、2m基因、2a6基因、2a5基因、2a4基因、2a3基因、2a2基因、2a1基因、2r2基因、2r1基因、2t5基因、2t4基因和2t3基因依次串联。

此外，需要说明的是，本发明中，“串联”仅表示基因的连接顺序，相邻基因间即可以是直接连接，也可以是存在其它基因片段或者连接处的部分序列存在相互重叠。

根据本发明的一些实施例，2t2基因、2g7基因、2r4基因、2r3基因、2p2基因、2g5基因、2g3基因、2g4基因、2m基因、2a6基因、2a5基因、2a4基因、2a3基因、2a2基因、2a1基因、2t5基因和2t3基因的表达方向相同。

根据本发明的一些实施例，2t1基因、2g8基因、2g6基因、2p1基因、2a8基因、2a11基因、2a9基因、2i基因、2o基因、2a10基因、2e基因、2a7基因、2g1基因、2g2基因、2r2基因、2r1基因、2t4基因的表达方向相同。

微生物

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种微生物。根据本发明的实施例，该微生物具有前述的生物合成基因簇。发明人惊人地发现，利用该微生物进行发酵处理，可以高效、简单和低成本地合成j1001-2化合物。

根据本发明的实施例，所述微生物为链霉菌。根据本发明的具体实施例，微生物为streptomyceshygroscopicus亚型链霉菌。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种制备j1001-2化合物的方法。参考图2，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：

s100发酵处理

根据本发明的实施例，利用前述的微生物进行发酵处理，得到发酵后的微生物。

根据本发明的具体实施例，发酵培养基条件：可溶性淀粉(30g/l),黄豆饼粉(10g/l),酵母提取物(2.5g/l)，碳酸钙(3g/l)。由此，发酵效果好，j1001-2化合物产量高。

根据本发明的具体实施例，发酵处理的时间为7-8天。

s200破壁处理

根据本发明的实施例，将发酵后的微生物进行破壁处理，得到含有j1001-2化合物的溶液。

s300纯化

根据本发明的实施例，从含有所述j1001-2化合物的溶液中纯化所述j1001-2化合物，得到j1001-2化合物产品。

根据本发明的一些实施例，将含有j1001-2化合物的溶液后旋干，采用乙酸乙酯萃取，浓缩后，用硅胶柱粗分离，后用半制备hplc进一步纯化得到目标产物。

根据本发明实施例的制备j1001-2化合物的方法，利用前述的微生物进行发酵处理，可以高效地合成j1001-2化合物。然后，通过微生物破壁处理和分离纯化处理，可以高效、简单和低成本地获得j1001-2化合物纯品。

根据本发明的一些实施例，通过基因预测，推测出j1001-2化合物的生物合成途径如图3。一方面由聚酮合成基因簇催化丙酰辅酶a和甲基丙二酰辅酶a的延伸合成最终形成长链脂肪酸链，在通过2o、2i和2e基因的修饰并得到j1001-2的中间产物，另一方面通过2g1、2g2、2g3、2g4和2m等基因催化得到糖基，再由糖基转移酶2g5、2g6、2g7将糖基转移到脂肪酸链上，最后由p450酶2p1和2p2作用形成j1001-2。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自illumina公司。

实施例1

将streptomyceshygroscopicus亚型链霉菌接种于sfm平板，培养三天到四天左右。待sfm培养基中形成菌落时，挑单菌落至种子培养基中培养三天到四天左右，按照1％的量接菌至发酵培养基(发酵培养基的成份为可溶性淀粉30g/l，黄豆饼粉10g/l，酵母抽提物2.5g/l，caco33g/l，ph7.2)中。培养条件：30度，220转速，培养7到8天时间。

待培养到第7或8天时，收取发酵液，高速离心使上清与菌丝体分离，菌丝体加入等量的丙酮破菌，超声20min，旋蒸丙酮，上清与菌丝体采用等量的乙酸乙酯萃取，重复一次。旋蒸浓缩至干，后用硅胶柱粗分离，得到粗品用hplc检测产物，鉴于hplc结果显示该该菌的产量比较高，因此，我们也对浓缩完的样品进行了tlc点板，并在碘缸里显色，将很明显的点抠下，用甲醇溶解，高速离心取上清做质谱确定目标点的位置结果如图4所示，表明该化合物为j1001-2化合物。

实施例2

以streptomyceshygroscopicus亚型链霉菌为研究对象，研究j1001-2化合物生物合成基因簇的序列信息，具体方法如下：

1、提取dna

(1)将streptomyceshygroscopicus亚型链霉菌接种于tsby培养基中培养2天后，7000rpm×5min收集菌体。

(2)将收集的菌体弃上清，加30mlsetbuffer，打散，离心7000rpm，5分钟。再次弃上清，加10mlsetbuffer，打散菌体，加300μl溶菌酶(100mg/ml)，37℃水浴30-60分钟，再加100μl蛋白酶k(100mg/ml)，10μlrnase(10mg/ml)，37℃水浴30分钟。

(3)向步骤(2)得到的混合物中加入1.2ml10％sds,55℃水浴2小时，每隔15分钟轻摇至液体逐渐澄清。

(4)向步骤(3)得到的液体中加入4ml5mnacl，混匀，冷却至37℃。加10ml氯仿，轻轻混匀30分钟，离心12000rpm，15分钟。

(5)取步骤(4)离心的上清液，再次加10ml氯仿，轻轻混匀30分钟，离心12000rpm，15分钟。

(6)取步骤(5)离心的上清液，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混旋至出现丝状dna。

(7)挑出dna于ep管中，加70％的乙醇洗，然后倒掉乙醇，自然风干，溶于一定量的双蒸水中，提取获得链霉菌的dna。

2、dna序列分析

将该基因组送至测序公司进行基因组测序，得到其基因组信息，对组装后的基因组，使用genemarks进行编码蛋白基因的预测。随后利用antismash软件预测出与j1-001化合物合成基因簇相似的区域，并综合j1-001化合物合成基因簇中蛋白在该菌编码基因数据集中比对结果，挖掘出j1001-2合成相关基因。基因簇的结构如图2所示，负责化合物j1001-2的生物合成，各个基因的功能分析见表1。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。