BCR‑ABL抑制剂抗性相关突变的检测方法及使用该检测方法用于预测BCR‑ABL抑制剂抗性的数据获得方法与流程

文档序号：11528850阅读：330来源：国知局

本发明涉及一种慢性髓细胞性白血病等中的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法和使用该检测方法用于预测bcr-abl抑制剂抗性的数据获得方法。

背景技术：

慢性髓细胞性白血病(cml)在几乎所有的病例中可确认到称为ph染色体(费城染色体)的基因突变。ph染色体的9号染色体与22号染色体的各自长臂发生易位。由于该易位，22号染色体上的bcr(breakpointclusterregion，断裂点集簇区)与9号染色体的abl基因区域重叠而产生bcr-abl融合(嵌合)基因。该融合基因所编码的融合蛋白bcr-abl使酪氨酸激酶活性持续性亢进，是导致慢性髓细胞性白血病发生的根本原因。

另一方面，以伊马替尼(imatinib)为代表的bcr-abl抑制剂目前作为融合蛋白bcr-abl的分子靶向治疗药物，用作针对慢性髓细胞性白血病(cml)、ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病(ph+all)、kit(cd117)阳性胃肠道间质瘤(gist)的治疗药物。但是，对于bcr-abl抑制剂治疗，已知虽然在慢性髓细胞性白血病的进展期很多患者有良好应答，bcr-abl融合基因的表达量减少，但如果治疗中在bcr-abl融合基因中发生突变，则表现出治疗抗性。该突变的例子，作为表现出伊马替尼治疗抗性的突变，可举出253位酪氨酸(野生型)突变为苯丙氨酸或组氨酸(突变型)、255位谷氨酸(野生型)突变为赖氨酸或缬氨酸(突变型)、315位酪氨酸(野生型)突变为异亮氨酸(突变型)(非专利文献1)。

根据非专利文献1，显示出上述突变中除了315位酪氨酸(野生型)突变为异亮氨酸(突变型)之外的bcr-abl激酶结构域(kinasedomain)的突变对作为bcr-abl抑制剂的尼洛替尼(nilotinib)及达沙替尼(dasatinib)表现出敏感性，如果能对与bcr-abl抑制剂抗性相关的bcr-abl激酶结构域有无突变进行一次性评价，则能够采取包括治疗策略的制定及治疗方法的变更在内的对策。因此，需要对与上述的bcr-abl抑制剂抗性相关的突变进行简单准确地检测。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：o'haret、eideca、deiningermw.bcr-ablkinasedomainmutations,drugresistance,andtheroadtoacureforchronicmyeloidleukemia.blood2007；110:2242-2249.

技术实现要素：

发明所要解决的问题

但是，由于从受试者采集的生物样品中表达bcr-abl融合基因的细胞与没发生上述易位但表达abl基因的(正常)细胞混合存在，因此在对与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变进行检测时，有时对生物样品中所含有的来源于(正常)细胞的9号染色体上的abl激酶结构域所存在的该突变也进行检测，由于该abl激酶结构域的上述突变并不直接有助于bcr-abl抑制剂抗性，因此存在着对与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变不能准确地进行检测的问题。所以，本发明目的在于提供能够对慢性髓细胞性白血病等中与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变进行更高精度地检测的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，以及使用该检测方法用于预测bcr-abl抑制剂抗性的数据获得方法。

解决问题的技术方案

本发明人为了解决上述问题进行了专心研究，结果发现，通过对由易位而产生的bcr-abl融合基因进行特异性扩增，并对扩增的核酸中所含有的与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变进行检测，能够特异性检测该突变，从而完成了本发明。

本发明包含以下内容。

(1)一种bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，其包括如下步骤：

使用从受试者采集的生物样品，对包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的区域进行扩增的步骤，

使用在上述步骤扩增的核酸，对所述与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的基因型进行确定的步骤。

(2)如(1)所述的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，其特征在于，在确定所述基因型的步骤中，对于所述突变位点使用对应于野生型的野生型探针和对应于突变型的突变型探针，计算所述扩增的核酸中所含有的野生型和/或突变型的丰度比。

(3)如(2)所述的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，其特征在于，所述丰度比为：以与所述野生型探针特异性杂交的核酸量和与所述突变型探针特异性杂交的核酸量作为总量，将与所述野生型探针特异性杂交的核酸量相对于该总量的比作为野生型的丰度比，将与所述突变型探针特异性杂交的核酸量相对于该总量的比作为突变型的丰度比。

(4)如(2)所述的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，其特征在于，所述丰度比为：将与所述野生型探针特异性杂交的核酸量相对于使用在所述突变位点以外与所述扩增的核酸特异性杂交的探针测定的核酸量的比作为野生型的丰度比，将与所述突变型探针特异性杂交的核酸量相对于使用在所述突变位点以外与所述扩增的核酸特异性杂交的探针测定的核酸量的比作为突变型的丰度比。

(5)如(3)或(4)所述的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，其特征在于，在所述扩增的步骤中，使用具有荧光标记的引物进行核酸扩增反应，将与所述野生型探针特异性杂交的核酸量、与所述突变型探针特异性杂交的核酸量和所述扩增的核酸量表示为基于荧光强度的绝对值的值。

(6)如(1)所述的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，其特征在于，所述突变位点对应于所述bcr-abl融合基因所编码的蛋白中的bcr-abl激酶结构域。

(7)如(1)所述的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，其特征在于，所述突变位点对应于bcr-abl激酶结构域的315位苏氨酸(野生型)至异亮氨酸(突变型)的取代突变位点和该bcr-abl激酶结构域的253位酪氨酸(野生型)至组氨酸(突变型)的取代突变位点中的任一个或两个。

(8)如(7)所述的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，其特征在于，对于所述bcr-abl激酶结构域的315位的取代突变位点，使用含有对应于野生型的ctatatcatcactgagttcatg(序列号1)的野生型探针和含有对应于突变型的ctatatcatcattgagttcatg(序列号2)的突变型探针，

对于所述bcr-abl激酶结构域的253位的取代突变位点，使用含有对应于野生型的gccagtacggggaggtgtac(序列号3)的野生型探针和含有对应于突变型的gccagcacggggaggtgtac(序列号4)的突变型探针。

(9)一种用于预测bcr-abl抑制剂抗性的数据获得方法，其包括如下步骤：通过如(1)至(8)中任一项所述的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法，根据对从受试者采集的生物样品中所含的bcr-abl融合基因而确定的基因型对所述受试者的bcr-abl抑制剂抗性进行判定。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请第2014-212228号中的公开内容。

发明效果

本发明的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法是对包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的区域进行扩增，并对于扩增的核酸确定基因型。由此，根据本发明的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法能够高精度地确定上述突变位点的基因型。

另外，根据本发明的用于预测bcr-abl抑制剂抗性的数据获得方法，由于利用对于与上述bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点能够高精度地确定的基因型信息，由此能够高精度地进行与bcr-abl抑制剂抗性相关的预测。

具体实施方式

本发明的bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法及使用该方法用于预测bcr-abl抑制剂抗性的数据获得方法(以下，统称为本方法)中，首先使用从受试者采集的生物样品，对包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点(例如，bcr-abl激酶结构域的突变位点)的区域进行扩增。而且，本方法中使用扩增的核酸确定与上述bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点基因型，根据确定的基因型对上述受试者的bcr-abl抑制剂抗性进行判定。

这里，受试者是指可以是正常者，也可以是患有bcr-abl抑制剂所适用的各种疾病的患者。作为bcr-abl抑制剂所适用的各种疾病，并没有特别限定，例如bcr-abl抑制剂如果为伊马替尼，则可举出慢性髓细胞性白血病(cml)、ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病(ph+all)、kit(cd117)阳性胃肠道间质瘤(gist)。特别优选受试者为患有慢性髓细胞性白血病的患者。此外，作为受试者，可以是开始进行bcr-abl抑制剂给药的患者，也可以是bcr-abl抑制剂给药开始前的患者。予以说明，作为bcr-abl抑制剂，并不限定于伊马替尼，也可举出例如尼洛替尼和达沙替尼等。

特别地，本方法是对于具有9号染色体与22号染色体的一部分发生易位而形成bcr-abl融合基因的受试者评价该bcr-abl融合基因中因bcr-abl激酶结构域的突变导致的bcr-abl抑制剂抗性的方法。所以，作为受试者具有9号染色体与22号染色体发生易位而形成的bcr-abl融合基因。

另外，作为来源于受试者的生物样品，并没有特别限定，可举出血液、血浆、血清、脑脊髓液、胰液、尿、粪便、组织液等。特别是作为生物样品，优选使用血液、血浆、血清。

“使用生物样品对包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的区域进行扩增”是指从生物样品中所含的细胞提取总rna或mrna，将提取的总rna或mrna逆转录而产生的cdna作为模板进行核酸扩增反应。作为核酸的提取手段，并没有特别限定。例如可利用使用苯酚/氯仿、乙醇、氢氧化钠、ctab等的rna提取法。

在该核酸扩增反应中对包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的区域进行扩增，同时也可以对其他区域进行扩增。作为核酸扩增反应，并没有特别限定，可适宜使用聚合酶链反应(pcr)法及lamp(loop-mediatedisothermalamplification，环介导等温扩增)法、tma(transcription-mediatedamplification，转录介导扩增)法、trc(transcription-reversetranscriptionconcertedreaction，转录逆转录协调反应)法、sda(stranddisplacementamplification，链置换扩增)法、ican(isothermalandchimericprimer-initiatedamplificationofnucleicacids，等温和嵌合引物引发核酸扩增)法等。例如pcr法中设计扩增目的区域侧翼的一对引物，准备含有聚合酶和底物等的试剂。而且，将由上述生物样品提取的总rna或mrna逆转录而产生的cdna作为模板，按照规定的温度循环条件进行核酸扩增反应，以便能够由一对引物特异性扩增目的区域。予以说明，核酸扩增反应是含有核酸扩增与标记所需的缓冲剂、耐热dna聚合酶、对扩增区域特异的引物、标记的核苷三磷酸(具体地是附加荧光标记等的核苷三磷酸)、核苷三磷酸和氯化镁等的反应系。

特别是希望附加标记以能够在核酸扩增反应中鉴别扩增区域。这时，作为对扩增的核酸进行标记的方法，并没有特别限定，例如可以使用对扩增反应中使用的引物进行预先标记的方法，使用在扩增反应中将标记核苷酸用作底物的方法。作为标记物质，并没有特别限定，可以使用放射性同位素及荧光色素、或者地高辛配基(dig)及有机化合物如生物素等等。

即，应用pcr法时，通过使用设计为在“包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的区域”侧翼的一对引物，能够按照规定方法对该区域进行特异性扩增。予以说明，也可以应用除了pcr法之外的其他核酸扩增方法，按照各核酸扩增反应的原理能够对该区域进行特异性扩增。

更具体地，作为pcr法中使用的一对引物，可根据来源于bcr-abl融合基因中的bcr基因的区域和来源于bcr-abl融合基因中的abl基因的区域分别设计。予以说明，一对引物中可含有所谓的正向引物与反向引物(与双链dna中相互不同的链杂交)，可根据来源于bcr-abl融合基因中的bcr基因的区域和来源于abl基因的区域中任一个设计正向引物，根据另外一个设计反向引物。

另外，与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点是指例如存在于bcr-abl激酶结构域，与bcr-abl抑制剂导致的治疗效果下降的现象相关的氨基酸突变所伴有的突变位点。bcr-abl抑制剂导致的治疗效果下降的现象是指换言之为bcr-abl抑制剂导致的bcr-abl融合蛋白中的酪氨酸激酶活性抑制效果下降。作为与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变，可举出bcr-abl激酶结构域的氨基酸取代突变。具体地，作为与bcr-abl抑制剂抗性相关的bcr-abl激酶结构域的突变，可举出m237v、i242t、m244v、k247r、l248v、g250e/r、q252r/h、y253f/h、e255k/v、e258d、w261l、l273m、e275k/q、d276g、t277a、e279k、v280a、v289a/i、e292v/q、i293v、l298v、v299l、f311l/i、t315i、f317l/v/i/c、y320c、l324q、y342h、m343t、a344v、a350v、m351t、e355d/g/a、f359v/i/c/l、d363y、l364i、a365v、a366g、l370p、v371a、e373k、v379i、a380t、f382l、l384m、l387m/f/v、m388l、y393c、h396p/r/a、a397p、s417f/y、i418s/v、a433t、s438c、e450k/g/a/v、e453g/k/v/q、e459k/v/g/q、m472i、p480l、f486s、e507g等。予以说明，在上述突变的记载中，数值表示突变的位点，是以bcr-abl融合蛋白n末端的甲硫氨酸计数为1的值。

特别是，作为与bcr-abl抑制剂抗性相关的bcr-abl激酶结构域的突变位点，优选使用t315i和y253h。换言之优选一对引物设计为在bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和包含与伊马替尼抗性相关的t315i和/或y253h的区域的侧翼。

予以说明，ph染色体是由t(9；22)(q34；q11)形成的小染色体，其中位于9q34的c-abl基因融合到位于22q11的bcr(breakpointclusterregion，断裂点集簇区)基因。bcr基因的断裂位点集中于内含子1(次要bcr，m-bcr)或内含子2或3(主要bcr，m-bcr)，以首尾连接(headtotail)与c-abl的一部分融合。m-bcr上有断裂点时，bcr外显子2(b2)或外显子3(b3)与a2连接而成的b2-a2mrna或b3-a2mrna转录并产生融合蛋白p210bcr-abl。另一方面，m-bcr上有断裂点时，外显子1(b1)与c-abl的exon2(a2)连接而成的b1-a2mrna转录并产生融合蛋白p190bcr-abl。

予以说明，将b2-a2mrna的一部分序列作为dna序列示于序列号5中，将b3-a2mrna的一部分序列作为dna序列示于序列号6中，将b1-a2mrna的一部分序列作为dna序列示于序列号7中。此外，将编码b2-a2mrna中所含有的bcr-abl融合蛋白的区域所含有的dna序列示于序列号8中。

根据上述的见解，可以适当设计用于“对包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的区域进行扩增”的引物。详细地例如可如下所述设计引物。

首先，确定检测对象的突变(例如t315i)。接着，对于设计位置，由在bcr基因序列(序列号9或10)中形成bcr-abl融合基因的区域设计正向引物。予以说明，序列号9和10中由5’末端到3304位为形成bcr-abl融合基因的区域。此外，在abl基因序列(序列号11)中在形成bcr-abl融合基因的区域且自突变位点(例如t315i)起到3’末端侧作为互补链设计反向引物。予以说明，序列号11中自445位到3’末端为形成bcr-abl融合基因的区域。也可以由abl基因序列设计正向引物，由bcr基因序列设计反向引物。

作为引物的设计方法，可使用一般的设计方法，将碱基长、tm和gc含量等作为参数。

予以说明，由一对引物扩增的区域长度只要包含融合位点与突变位点则没有特别限定，例如可以为10～10k碱基，优选为50～6k碱基，更优选为500～3k碱基，最优选为800～2k碱基。通过将扩增的区域长度在此范围内，能够包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点。

通过使用如上所述设计的一对引物，能够对“包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的区域”进行特异性扩增。换言之，使用如上所述设计的一对引物时，如果9号染色体与22号染色体未发生易位，则核酸扩增反应不进行，不能确认到扩增片段。

接着，本发明的数据获得方法中使用扩增的核酸，对上述与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点基因型进行确定。基因型的确定方法并没有特别限定，基于何种的方法、原理均可。例如，作为基因型的确定方法，可举出对于突变位点的野生型等位基因、突变型等位基因利用特异性杂交探针的方法。作为基因型的确定方法，利用探针的方法并没有限定，例如可举出确定扩增片段的碱基序列的方法、利用pcr法等核酸扩增反应的方法等。

特别优选使用在基板上固定探针而成的dna微阵列(microarray)(有时也称为dna芯片)，对扩增的核酸中所含有的上述与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点基因型进行确定。这是因为通过利用固定探针而成的dna微阵列，能够用简单且简便的步骤准确地确定基因型。

更具体地，作为用于确定突变位点的t315i基因型的探针，可示例为包含对应于野生型的ctatatcatcactgagttcatg(序列号1)的野生型探针和包含对应于突变型的ctatatcatcattgagttcatg(序列号2)的突变型探针。此外，作为用于确定突变位点的y253h基因型的探针，可示例为包含对应于野生型的gccagtacggggaggtgtac(序列号3)的野生型探针和包含对应于突变型的gccagcacggggaggtgtac(序列号4)的突变型探针。予以说明，这些野生型探针和突变型探针为22mer或20mer，碱基长并未作任何限定。作为探针的长度，例如，可以为10mer～50mer，优选为15mer～40mer，更优选为20mer～30mer，最优选为20mer～25mer。这样用于确定基因型的探针，即使为任何长度也可以根据上述abl基因的碱基序列进行适当设计。

予以说明，用于确定基因型的探针，优选为核酸，更优选为dna。dna中可包含双链和单链二者，优选为单链dna。用于确定基因型的探针，例如，可以通过核酸合成装置进行化学合成而获得。作为核酸合成装置，可以使用称为dna合成仪、全自动核酸合成装置、核酸自动合成装置等的装置。

用于确定基因型的探针，优选将其5'末端在载体上固定化，以微阵列(例如dna芯片)的形式使用。作为载体的材料，可以使用本技术领域内公知的材料，并没有特别限制。此外，作为载体，优选使用在表面上有碳层和化学修饰基团的载体。

特别优选使用具有微细平板状结构的载体。形状为长方形、正方形和圆形等并不限定，通常使用1～75mm正方形的载体，优选为1～10mm正方形的载体、更优选为3～5mm正方形的载体。从容易制造微细平板状结构的载体出发，优选使用由硅材料、树脂材料形成的基板，特别更优选在由单结晶硅形成的基板表面上具有碳层和化学修饰基团的载体。

将探针在载体上固定并没有特别限定，可适用如下方法：将探针溶解于点样用缓冲剂来配制点样用溶液，将其分注到96孔或384孔塑料板，通过点样装置等将分注的溶液点样到载体上。此外，也可以用微量移液器对点样溶液手动进行点样。

点样后，为了使探针与载体结合的反应进行，优选进行孵育。孵育通常在-20～100℃、优选为0～90℃的温度，通常0.5～16小时、优选为在1～2小时内进行。孵育希望在高湿度的环境中，例如，在湿度50～90％的条件下进行。孵育之后，为了除去未与载体结合的dna，优选用清洗液(例如，50mmtbs/0.05％tween20、2×ssc/0.2％sds溶液、超纯水等)进行清洗。

通过使用如上所述制作的dna微阵列，能够确定受试者中与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点基因型。具体地，如上所述进行扩增的核酸与探针的杂交反应，对与探针杂交的核酸量，例如通过检测标记进行测定。来自标记的信号，例如使用荧光标记时，使用荧光扫描仪进行荧光信号检测，对其通过图像分析软件进行分析而能够将信号强度转换为数值化。此外，例如，通过使用含有已知量dna的试样制作校准曲线，也能够对与探针杂交的扩增核酸进行定量。杂交反应优选在严格条件下实施。严格条件是指形成特异性杂交，但不形成非特异性杂交的条件，例如是指在50℃下进行16小时杂交反应后，在2×ssc/0.2％sds、25℃、10分钟和2×ssc、25℃、5分钟的条件下清洗的条件。或者，作为杂交的温度，盐浓度为0.5×ssc时，可设定为42～54℃，在探针链长较短时，更优选杂交温度设为42～48℃，探针链长较长时，更优选杂交温度设为46～54℃。予以说明，如果盐浓度提高则具有特异性的杂交温度升高，反之如果盐浓度降低则具有特异性的杂交温度下降。

另外这时，在dna微阵列上，除了用于确定突变位点基因型的探针之外，也可以固定与扩增的核酸中除了与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点以外的区域杂交的探针。无论突变位点基因型如何，该探针均能够与扩增的核酸杂交。所以，通过使用固定该探针的dna微阵列，能够对目标核酸是否由核酸扩增反应得到扩增进行判定。

本方法根据与对于与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点而设计的探针杂交的上述扩增的核酸量，来确定该突变位点基因型。特别是在本方法中由于对包括bcr-abl融合基因中所含有的融合位点和与bcr-abl抑制剂抗性相关的突变位点的区域进行扩增，因此能够不受到9号染色体上的abl基因中该突变位点基因型的影响，而对bcr-abl融合基因中突变位点基因型进行确定。

特别是对于使用从受试者采集的生物样品，将逆转录mrna而得到的cdna作为模板扩增的核酸，通过确定突变位点基因型，能够对于野生型的bcr-abl融合基因与突变型的bcr-abl融合基因求出表达量的比。换言之在这种情况下，对于从受试者采集的生物样品，能够推算出具有bcr-abl抑制剂抗性的细胞(克隆)群相对于bcr-abl抑制剂敏感性的细胞的丰度比。由此，针对bcr-abl抑制剂所适用的各种疾病(cml、ph+all和gist等)，可以恰当地判断继续给药bcr-abl抑制剂还是变更为其他治疗药物的治疗方针。

更具体地对于上述突变位点使用对应于野生型的野生型探针和对应于突变型的突变型探针，计算上述扩增的核酸中所含有的野生型和/或突变型的丰度比。而且，野生型的丰度比在一定值以下、或者突变型的丰度比在一定值以上时，例如，能够判断为疾病复发风险高。这时，作为突变型的丰度比的阈值，例如，可以适当设定判断为疾病复发风险高的值、判断为bcr-abl抑制剂的无给药效果的值、判断为bcr-abl抑制剂更换为其他药剂的值等。

另外，野生型或者突变型的丰度比可以作为一例如下所述进行确定。即，以与上述野生型探针特异性杂交的核酸量和与上述突变型探针特异性杂交的核酸量作为总量，将与上述野生型探针特异性杂交的核酸量相对于该总量的比作为野生型的丰度比，将与上述突变型探针特异性杂交的核酸量相对于该总量的比作为突变型的丰度比。或者，上述丰度比为：将与上述野生型探针特异性杂交的核酸量相对于使用在突变位点以外特异性杂交的探针测定的核酸量的比作为野生型的丰度比，将与上述突变型探针特异性杂交的核酸量相对于使用在突变位点以外特异性杂交的探针测定的核酸量的比作为突变型的丰度比。

在这两种情况下，扩增的核酸也就是以野生型bcr-abl融合基因和突变型bcr-abl融合基因的量作为总量，将野生型bcr-abl融合基因相对于该总量的量作为野生型的丰度比，将突变型bcr-abl融合基因相对于该总量的量作为突变型的丰度比。由此，能够合理地推算出从受试者采集的生物样品中所含的bcr-abl抑制剂抗性克隆的丰度比。

实施例

以下，通过实施例进一步详细地说明本发明，本发明的技术范围并不限定于以下实施例。

〔实施例1〕

<试样的制作>

本实施例中准备了归纳于下表中的5种试样。

[表1]

<试样1的制作方法>

对细胞株k562进行细胞培养，细胞使用tc20全自动细胞计数仪(bio-rad公司制)确认为1.25×10⁶个/ml。向15ml离心管中加入10ml的培养液，以300×g进行5分钟离心操作形成沉淀。小心地完全除去上清后，用rneasyminikit(qiagen公司制)提取rna。使用nanodrop2000(赛默飞世尔科技公司制)测定rna浓度。

<试样2的制作方法>

对细胞株hl60进行细胞培养，与试样1的制作同样地用rneasyminikit(qiagen公司制)提取rna。使用nanodrop2000(赛默飞世尔科技公司制)测定rna浓度。

<试样3的制作方法>

将由细胞株k562提取的2mg总rna作为对象，用引物〔引物序列5(ccggaattctccgctgaccatcaataagga：序列号12)、引物序列6(ataagaatgcggccgcacgtcggacttgatggagaact：序列号13)〕进行rt-pcr。将1203bp的cdna片段用5’bcr特异的引物和3’abl特异的引物的pcr进行扩增。

将pcr产物连接到pcdna3.1(+)克隆载体(invitrogen公司制)，转化到大肠菌dh5α感受态细胞(东洋纺株式会社)。对插入的pcr产物进行测序，以确认野生型序列已插入。

<试样4的制作方法>

以在试样3中得到的野生型克隆载体为对象，利用定点突变试剂盒(site-directedmutagenesis)(东洋纺株式会社制)，在315位苏氨酸导入为异亮氨酸的点突变。pcr中使用引物序列7(ccccgttctatatcatcattgagttcatgacctacg：序列号14)和引物序列8(cgtaggtcatgaactcaatgatgatatagaacgggg：序列号15)。反应液组成示于下表2(单位为μl)中。

[表2]

pcr按照以下条件进行。即，以95℃2分钟、98℃2分钟和68℃10分钟为1次循环进行10次循环。

而且，用限制性内切酶dpni(东洋纺株式会社)切断模板野生型克隆载体，将导入目的突变的pcr产物转化到大肠菌dh5α感受态细胞(东洋纺株式会社制)中(转化)。对插入的pcr产物进行测序，确认t315i突变型序列已插入。

<试样5的制作方法>

以试样3中得到的野生型克隆载体为对象，利用定点突变试剂盒(site-directedmutagenesis)(东洋纺株式会社制)，在253位酪氨酸导入为组氨酸的点突变。pcr中使用引物序列9(caagctgggcgggggccagcacggggaggtgtacgagg：序列号16)和引物序列10(cctcgtacacctccccgtgctggcccccgcccagcttg：序列号17)。与制作试样4的条件同样地进行pcr，对插入的pcr产物进行测序，确认y253h突变型序列已插入。

<芯片的制作>

制作用于检测bcr-abl融合基因的融合位点的探针(探针1)、用于检测bcr-abl融合基因突变的t315i的探针(探针2和3)。各探针的碱基序列如下所示。

探针1(融合)：cccttcagcggccagtagcatctga(序列号18)

探针2(野生型)：ctatatcatcactgagttcatg(序列号1)

探针3(突变型)：ctatatcatcattgagttcatg(序列号2)

〔实施例1-1〕引物对的评价

本实施例中使用对包含bcr-abl融合基因的融合位点和突变位点的区域进行特异性扩增的引物对a(引物1和2)。引物1和引物2的碱基序列如下所示。予以说明，引物2中附加有cy5。

引物1：tccgctgaccatcaayaagga(序列号19、y＝c或t)

引物2：acgtcggacttgatggagaact(序列号20)

使用引物对a以下表3(单位为μl)组成的反应液进行rt-pcr，对包含bcr-abl融合基因的融合位点和突变位点的区域进行扩增。这时，本实施例中作为模板使用由试样1提取的人rna。

[表3]

rt-pcr进行条件如下：在以42℃15分后95℃10秒的条件下进行逆转录反应，然后，在以95℃30秒、60℃30秒和72℃3分为1次循环进行33次循环，然后72℃5分钟的条件下进行扩增反应。

反应完成后，将反应液与杂交缓冲液(2×ssc/0.2％sds/0.2nmcy5标记寡核苷酸dna(sigma-aldrich公司制))以1：1进行混合，取该溶液3μl，滴到原位杂交盖玻片的中央凸起部上，将其盖到芯片上，在设定为48℃的杂交盒装置(东洋钢钣株式会社制)反应1小时。

杂交反应完成后，将清洗用不锈钢固定器浸入在1×ssc/0.1％sds溶液中，将剥离原位杂交盖玻片的芯片安置在固定器上。上下数次振动后，将固定器浸入在1×ssc溶液(室温)中直到检测芯片荧光强度。

将盖玻片覆盖到芯片后，用fla8000(富士胶卷株式会社制)以5μm像素、pmt80％检测荧光强度。使用软件(arraygaugever2.1，富士胶卷株式会社制)对fla8000得到的数据进行分析。

予以说明，用于比较，代替引物对a，使用扩增bcr-abl融合基因突变的引物对b(引物3和4)同样地进行rt-pcr、杂交反应和荧光检测。引物3和引物4的碱基序列如下所示。

引物3：aagaccttgaaggaggacaccat(序列号21)

引物4：acgtcggacttgatggagaact(序列号22)

分别使用引物对a、使用引物对b测定荧光强度的结果如表4所示。如下表4所示，使用引物对a时，在具有bcr-abl融合基因的试样1中，融合位点和突变位点两者均得到信号。与此相对，使用引物对b时，在具有bcr-abl融合基因的试样1中，突变位点能被检测到，但融合位点未能检测到。由此可知，使用引物对a时，融合位点和突变位点能一并进行检测。

予以说明，未能检测的判定值设为43以下。予以说明，该判定值是由分析不含信号的背景区域中荧光信号的结果计算出的值。

[表4]

〔实施例1-2〕引物对的评价

本实施例中作为bcr-abl融合基因中的突变位点，使用固定有除了检测t315i突变的探针还有检测y253h突变的探针的dna芯片，对试样中所含的bcr-abl融合基因中的突变位点进行检测。本例中使用由试样2的细胞株提取的人rna100ng和由试样5的细胞株提取的人dna1ng作为模板。

本例中除了探针1～3，还设计用于检测bcr-abl融合基因突变的y253h的探针(探针4和5)，制作固定化有探针1～5的dna芯片。

探针4(野生型)：gccagtacggggaggtgtac(序列号3)

探针5(突变型)：gccagcacggggaggtgtac(序列号4)

与实施例1-1同样地，使用引物对a时测定荧光强度的结果如表5所示。如下表5所示，使用引物对a时，能够对融合位点和多个突变位点(至少为y253h和t315i)同时进行检查。

[表5]

〔实施例2-1〕引物对的评价

本实施例中对于引物对a和引物对b能否分别区分具有bcr-abl融合基因的试样1和不具有bcr-abl融合基因的试样2进行了验证。实际中对于来自受试者的生物样品，在确定bcr-abl融合基因中突变位点基因型时，同时对来源于正常细胞的c-abl基因中该位点的基因型进行检测，结果有bcr-abl融合基因中突变比被低估的可能性。本实施例中验证了在使用引物对a和引物对b时是否产生这样的不良情况。

本实施例中使用试样1和2，与实施例1-1同样地测定来自dna芯片的荧光强度。其结果如表6所示。如表6所示，使用引物对a时，在具有bcr-abl融合基因的试样1中测定到荧光信号，能够在突变位点进行野生型的鉴别。另一方面，使用引物对a时，在不具有bcr-abl融合基因的试样2中未测定到荧光信号，可知没有来源于bcr-abl融合基因的突变。由以上可表明，使用引物对a时，能够明确区分试样1和试样2。

与此相对，使用引物对b时，即使在不具有bcr-abl融合基因的试样2中，突变位点也测定到荧光信号，不能区分试样1和试样2。

[表6]

〔实施例2-2〕引物对的评价

本实施例中试样3和试样4的混合总量设为10ng，分别使用以100：0、50：50和0：100的比的混合试样作为模板。予以说明，利用pcr、dna芯片的杂交反应、随后的荧光检测等与实施例1-1同样地进行。

不含有来源于正常细胞的c-abl基因的试样3和4中，分别使用引物对a和引物对b测定荧光强度的结果如表7所示。如表7所示，使用引物对a和引物对b时两种情况中，可得到作为模板混合的试样混合比与基于信号强度的突变比之间有相关性。

[表7]

〔实施例2-3〕引物对的评价

本实施例中使用加入试样41ng和试样2100ng作为模板。予以说明，利用pcr、dna芯片的杂交反应、随后的荧光检测等与实施例1-1同样地进行。

在含有具有来源于正常细胞的c-abl基因的试样2时，使用引物对a和引物对b分别测定荧光强度的结果如表8所示。如下表8所示，使用引物对a时，可得到作为模板使用的bcr-abl融合基因的突变比(突变型100％)与检测的信号强度有相关性。与此相对，使用引物对b时，作为模板混合的突变比与检测的信号强度发生逆转，可知受到不具有bcr-abl融合基因的试样2的影响很大。由此可知，使用引物对a时，不受到来源于正常细胞的c-abl基因的影响，能够准确地判定突变位点突变。

[表8]

本说明书中引用的全部刊物、专利和专利申请直接并入本说明书中。

序列表

<110>东洋钢钣株式会社

国立大学法人山口大学

<120>bcr-abl抑制剂抗性相关突变的检测方法及用于

预测bcr-abl抑制剂抗性的数据获得方法

<130>h088pct

<150>jp2014-212228

<151>2014-10-17

<160>22

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成dna

<400>1

ctatatcatcactgagttcatg22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成dna

<400>2

ctatatcatcattgagttcatg22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成dna

<400>3

gccagtacggggaggtgtac20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成dna

<400>4

gccagcacggggaggtgtac20

<210>5

<211>922

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>5

gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtca60

ctgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagt120

tacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggag180

cagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc240

aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaa300

gcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgt360

tggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgtt420

gcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaag480

ctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggc540

caaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctgg600

taccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatcygctgagcagcgggatcaatggc660

agcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctrgccagaggtccatctcgctgagatac720

gaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcc780

tccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgac840

gggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggt900

gtgtcccccaactacgacaagt922

<210>6

<211>997

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>6

gcgaacaagggcagcaaagctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtca60

ctgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagt120

tacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggag180

cagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgacc240

aactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagat300

gatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggattt360

aagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctg420

agtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgac480

cccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcata540

actaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcc600

caaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctg660

gagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagc720

agcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtcc780

atctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggc840

aagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcat900

tcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaag960

cccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt997

<210>7

<211>1079

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>7

gtaccagccctaccagagcatctacgtcgggggcatgatggaaggggagggcaagggccc60

gctcctgcgcagccagagcacctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtc120

ctactccccccggagttttgaggattgcggaggcggctataccccggactgcagctccaa180

tgagaacctcacctccagcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtcccc240

aagccccaccacctaccgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgca300

acagtccttcgacagcagcagtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactg360

cccggttgtcgtgtccgaggccaccatcgtgggcgtccgcaagaccgggcagatctggcc420

caacgatggcgagggcgccttccatggagacgcagaagcccttcagcggccagtagcatc480

tgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttct540

cgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccag600

tggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatca660

caatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaacta720

catcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaa780

tgccgctgagtatcygctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtga840

gagcagtcctrgccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacag900

gatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccct960

ggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccatta1020

tccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt1079

<210>8

<211>6104

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>8

atggtggacccggtgggcttcgcggaggcgtggaaggcgcagttcccggactcagagccc60

ccgcgcatggagctgcgctcagtgggcgacatcgagcaggagctggagcgctgcaaggcc120

tccattcggcgcctggagcaggaggtgaaccaggagcgcttccgcatgatctacctgcag180

acgttgctggccaaggaaaagaagagctatgaccggcagcgatggggcttccggcgcgcg240

gcgcaggcccccgacggcgcctccgagccccgagcgtccgcgtcgcgcccgcagccagcg300

cccgccgacggagccgacccgccgcccgccgaggagcccgaggcccggcccgacggcgag360

ggttctccgggtaaggccaggcccgggaccgcccgcaggcccggggcagccgcgtcgggg420

gaacgggacgaccggggaccccccgccagcgtggcggcgctcaggtccaacttcgagcgg480

atccgcaagggccatggccagcccggggcggacgccgagaagcccttctacgtgaacgtc540

gagtttcaccacgagcgcggcctggtgaaggtcaacgacaaagaggtgtcggaccgcatc600

agctccctgggcagccaggccatgcagatggagcgcaaaaagtcccagcacggcgcgggc660

tcgagcgtgggggatgcatccaggcccccttaccggggacgctcctcggagagcagctgc720

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgagttgaacccccgcttcctgaaggacaacctg780

atcgacgccaatggcggtagcaggcccccttggccgcccctggagtaccagccctaccag840

agcatctacgtcgggggcatcatggaaggggagggcaagggcccgctcctgcgcagccag900

agcacctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtcctactccccccggagt960

tttgaggattgcggaggcggctataccccggactgcagctccaatgagaacctcacctcc1020

agcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtccccaagccccaccacctac1080

cgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgcaacagtccttcgacagc1140

agcagtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactgcccggttgtcgtgtcc1200

gaggccaccatcgtgggcgtccgcaagaccgggcagatctggcccaacgatgacgagggc1260

gccttccatggagacgcagatggctcgttcggaacaccacctggatacggctgcgctgca1320

gaccgggcagaggagcagcgccggcaccaagatgggctgccctacattgatgactcgccc1380

tcctcatcgccccacctcagcagcaagggcaggggcagccgggatgcgctggtctcggga1440

gccctggagtccactaaagcgagtgagctggacttggaaaagggcttggagatgagaaaa1500

tgggtcctgtcgggaatcctggctagcgaggagacttacctgagccacctggaggcactg1560

ctgctgcccatgaagcctttgaaagccgctgccaccacctctcagccggtgctgacgagt1620

cagcagatcgagaccatcttcttcaaagtgcctgagctctacgagatccacaaggagttc1680

tatgatgggctcttcccccgcgtgcagcagtggagccaccagcagcgggtgggcgacctc1740

ttccagaagctggccagccagctgggtgtgtaccgggccttcgtggacaactacggagtt1800

gccatggaaatggctgagaagtgctgtcaggccaatgctcagtttgcagaaatctccgag1860

aacctgagagccagaagcaacaaagatgccaaggatccaacgaccaagaactctctggaa1920

actctgctctacaagcctgtggaccgtgtgacgaggagcacgctggtcctccatgacttg1980

ctgaagcacactcctgccagccaccctgaccaccccttgctgcaggacgccctccgcatc2040

tcacagaacttcctgtccagcatcaatgaggagatcacaccccgacggcagtccatgacg2100

gtgaagaagggagagcaccggcagctgctgaaggacagcttcatggtggagctggtggag2160

ggggcccgcaagctgcgccacgtcttcctgttcaccgagctgcttctctgcaccaagctc2220

aagaagcagagcggaggcaaaacgcagcagtatgactgcaaatggtacattccgctcacg2280

gatctcagcttccagatggtggatgaactggaggcagtgcccaacatccccctggtgccc2340

gatgaggagctggacgctttgaagatcaagatctcccagatcaagagtgacatccagaga2400

gagaagagggcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggag2460

caggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaac2520

ggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaac2580

atccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcag2640

atgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaat2700

aaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaa2760

gccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaac2820

cttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaa2880

ggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaacc2940

aaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaa3000

cactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatcygctgagcagcggg3060

atcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctrgccagaggtccatctcg3120

ctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctc3180

tacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacg3240

gtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccact3300

gtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatg3360

aagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatac3420

agcctgacggtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttg3480

aaagaagctgcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctagtgcagctccttggggtc3540

tgcacccgggagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctg3600

gactacctgagggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggcc3660

actcagatctcgtcagccatggagtacctagagaagaaaaacttcatccacagagatctt3720

gctgcccgaaactgcctggtaggggagaaccacttggtgaaggtagctgattttggcctg3780

agcaggttgatgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaa3840

tggactgcacccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggca3900

tttggagtattgctttgggaaattgctacctatggcatgtccccttacccgggaattgac3960

cgttcccaggtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatgaagcgcccagaaggctgc4020

ccagagaaggtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccc4080

tcctttgctgaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagac4140

gaagtggaaaaggagctggggaaacaaggcgtccgtggggctgtgactaccttgctgcag4200

gccccagagctgcccaccaagacgaggacctccaggagagctgcagagcacagagacacc4260

actgacgtgcctgagatgcctcactccaagggccagggagagagcgatcctctggaccat4320

gagcctgccgtgtctccattgctccctcgaaaagagcgaggtcccccggagggcggcctg4380

aatgaagatgagcgccttctccccaaagacaaaaagaccaacttgttcagcgccttgatc4440

aagaagaagaagaagacagccccaacccctcccaaacgcagcagctccttccgggagatg4500

gacggccagccggagcgcagaggggccggcgaggaagagggccgagacatcagcaacggg4560

gcactggctttcacccccttggacacagctgacccagccaagtccccaaagcccagcaat4620

ggggctggggtccccaatggagccctccgggagtccgggggctcaggcttccggtctccc4680

cacctgtggaagaagtccagcacgctgaccagcagccgcctagccaccggcgaggaggag4740

ggcggtggcagctccagcaagcgcttcctgcgctcttgctccgtctcctgcgttccccat4800

ggggccaaggacacggagtggaggtcagtcacgctgcctcgggacttgcagtccacggga4860

agacagtttgactcgtccacatttggagggcacaaaagtgagaagccggctctgcctcgg4920

aagagggcaggggagaacaggtctgaccaggtgacccgaggcacagtaacgcctcccccc4980

aggctggtgaaaaagaatgaggaagctgctgatgaggtcttcaaagacatcatggagtcc5040

agcccgggctccagcccgcccaacctgactccaaaacccctccggcggcaggtcaccgtg5100

gcccctgcctcgggcctcccccacaaggaagaagcctggaaaggcagtgccttagggacc5160

cctgctgcagctgagccagtgacccccaccagcaaagcaggctcaggtgcaccagggggc5220

accagcaagggccccgccgaggagtccagagtgaggaggcacaagcactcctctgagtcg5280

ccagggagggacaaggggaaattgtccaggctcaaacctgccccgccgcccccaccagca5340

gcctctgcagggaaggctggaggaaagccctcgcagagcccgagccaggaggcggccggg5400

gaggcagtcttgggcgcaaagacaaaagccacgagtctggttgatgctgtgaacagtgac5460

gctgccaagcccagccagccgggagagggcctcaaaaagcccgtgctcccggccactcca5520

aagccacagtccgccaagccgtcggggacccccatcagcccagcccccgttccctccacg5580

ttgccatcagcatcctcggccctggcaggggaccagccgtcttccaccgccttcatccct5640

ctcatatcaacccgagtgtctcttcggaaaacccgccagcctccagagcggatcgccagc5700

ggcgccatcaccaagggcgtggtcctggacagcaccgaggcgctgtgcctcgccatctct5760

aggaactccgagcagatggccagccacagcgcagtgctggaggccggcaaaaacctctac5820

tcgttctgcgtgagctatgtggattccatccagcaaatgaggaacaagtttgccttccga5880

gaggccatcaacaaactggagaataatctccgggagcttcagatctgcccggcgacagca5940

ggcagtggtccagcggccactcaggacttcagcaagctcctcagttcggtgaaggaaatc6000

agtgacatagtgcagaggtagcagcagtcaggggtcaggtgtcaggcccgtcggagctgc6060

ctgcagcacatgcgggctcgcccatacccgtgacagtggctgag6104

<210>9

<211>6927

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>9

ggggggagggtggcggctcgatgggggagccgcctccagggggcccccccgccctgtgcc60

cacggcgcggcccctttaagaggcccgcctggctccgtcatccgcgccgcggccacctcc120

ccccggccctccccttcctgcggcgcagagtgcgggccgggcgggagtgcggcgagagcc180

ggctggctgagcttagcgtccgaggaggcggcggcggcggcggcggcacggcggcggcgg240

ggctgtggggcggtgcggaagcgagaggcgaggagcgcgcgggccgtggccagagtctgg300

cggcggcctggcggagcggagagcagcgcccgcgcctcgccgtgcggaggagccccgcac360

acaatagcggcgcgcgcagcccgcgcccttccccccggcgcgccccgccccgcgcgccga420

gcgccccgctccgcctcacctgccaccagggagtgggcgggcattgttcgccgccgccgc480

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