一种富含茶儿茶素的茶黄素产品的制作方法

本发明涉及一种茶黄素产品，特别涉及一种富含茶儿茶素的茶黄素产品。
背景技术：
：茶树鲜叶(camelliasinensis(l.)o.ktze)含有茶儿茶素类多酚类物质及其对应的多酚氧化酶，在适度的温度和氧气作用下，接触反应能够生成茶黄素类(theaflavins)多酚类化合物。即表儿茶素(epi-catechin,ec)联合表没食子儿茶素(epigallo-catechin,egc)、ec联合表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallo-catechingallate,egcg)、表儿茶素没食子酸酯(epi-catechingallate,ecg)联合egc、ecg联合egcg组合物经多酚氧化酶(teapolyphenoloxidase,tppo)酶促氧化缩聚而成茶黄素类化合物。茶黄素类多酚类化合物通常包括简单茶黄素(tf)和酯型茶黄素，其中酯型茶黄素主要涉及的成分为茶黄素-3-单没食子酸酯(tf-3-g)、茶黄素-3′-单没食子酸酯(tf-3′-g)和茶黄素-3,3′-双没食子酸酯(tf-3,3′-g)。茶黄素类多酚类化合物具有体外抗氧化、降低心脑血管疾病、诱导肿瘤细胞凋亡、调节免疫细胞功能、抗流感病毒及hiv病毒等独特的作用。茶黄素的酶促合成既可以在纯水相中进行，也可以在酯水双液相中进行。茶多酚酶促氧化在水与水不相混溶的有机溶剂组成双液相体系反应条件下，可提高茶黄素含量(萧伟祥,钟瑾,胡耀武,萧慧.双液相系统酶化学技术制取茶色素.天然产物研究与开发,2001,13(5):49-52.||李立祥,萧伟祥.茶多酚双液相氧化制取茶色素参数优化.茶叶科学,2002,22(2):119-124.||李立祥,萧伟祥.茶多酚双液相氧化制取茶色素工艺研究,南京农业大学学报,2004,27(2):99-104.)。相关文献在明确以乙酸乙酯和水组成作为反应体系的条件下，进行了较为详细的参数优化研究。研究结果均表明，在反应体系中加入适量乙酸乙酯，可以提高茶黄素的生成量(鲜殊.茶鲜叶匀浆悬浮发酵在高茶黄素含量茶色素制备中的应用研究.安徽农业大学硕士学位论文,2012.||周洁.茶黄素酶促氧化合成条件的优化.西南大学硕士学位论文.2013.)。中国专利cn200810023581.5公开了制备茶黄素的新工艺，其制备是从绿茶中以乙酸乙酯提取茶多酚作为原料，并以充分粉碎的新鲜茶叶为发酵酶，在通入纯氧下进行搅拌发酵后，再通过分离、浓缩、水洗、等步骤，得到合格的茶黄素产品。同时，中国专利cn200910153520.5也公开了一种茶黄素的产业化制备方法，该专利所采用的以乙酸乙酯和水组成作为反应体系中各组份分别为粉碎的茶鲜叶:富含茶多酚的乙酸乙酯溶液：乙酸乙酯：缓冲溶液的用量比等于800kg：600-900kg：15-25l：1-2l。本发明人在重复上述实验的过程中发现，以乙酸乙酯和水组成的双液相作为反应体系的条件下，虽然可以较好的合成茶黄素，但是茶儿茶素过度消耗，且双酯型茶黄素得不到有效合成。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用茶树鲜叶自身所含有的茶儿茶素和茶多酚氧化酶来酶促合成制备茶黄素产品。本发明的再一个目的是在提高茶黄素产率的前提下最大程度的保留未被转化的茶儿茶素。本发明提供的一种富含茶儿茶素的茶黄素产品，通过如下步骤实现：(1)将茶树(camelliasinensis)鲜叶或嫩茎充分研磨粉碎；(2)按一定比例将正已烷或石油醚加入水饱和的乙酸乙酯中，制成特定水饱和的乙酸乙酯混合溶剂；(3)将步骤(1)粉碎的茶树鲜叶或嫩茎与步骤(2)中的特定水饱和的乙酸乙酯混合溶剂按一定比例混合并水浴振荡进行酶促反应；(4)将步骤(3)的反应液在减压条件下用滤纸进行过滤，得过滤液；(5)减压充分浓缩步骤(4)的过滤液，获得浓缩浸膏；(6)向步骤(5)的浓缩浸膏中加入5%的乙醇水溶液，充分振荡提取目标物，得提取液；(7)浓缩步骤(6)的提取液；和(8)任选地干燥步骤(7)的产品，得富含茶儿茶素的茶黄素产品。优选地，其中步骤(2)中所述的正已烷或石油醚占特定水饱和的乙酸乙酯混合溶剂的2.5-35%(v/v)。优选地，其中步骤(3)中所述的茶树鲜叶与特定水饱和的乙酸乙酯混合溶剂固液比为1:20～1:40。优选地，其中步骤(3)中所述的酶促反应时间在5～120min，水浴温度在15～50℃。优选地，其中步骤(5)和(7)在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行。优选地，其中步骤(8)所涉及的富含茶儿茶素的茶黄素产品中，茶儿茶素是指表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素(egc)、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)和表儿茶素没食子酸酯(ecg)。优选地，其中步骤(8)所涉及的富含茶儿茶素的茶黄素产品中，茶黄素是指简单茶黄素(tf)、茶黄素-3-单没食子酸酯(tf-3-g)、茶黄素-3′-单没食子酸酯(tf-3′-g)和茶黄素-3,3′-双没食子酸酯(tf-3,3′-g)。优选地，其中步骤(6)的提取液以iso14502-2:2005(e)或按实施例中所述调整过的iso14502-2:2005(e)方法规定的高效液相色谱检测的各成分积分面积的关系中，egcg>tf-3,3′-g，0.7<(tf-3,3′-g/ecg)<1，且tf-3,3′-g大于其余各茶黄素单体间两者之和。有益效果采用本发明所实施的方案，可以一方面降低茶儿茶素的损耗率；另一方面可以提高双酯型茶黄素的转化生成率，从而可以实现较好茶儿茶素利用率和较佳的经济效益。附图说明图1是实施例1-3所分析的高效液相色谱图。图2是实施例4-5所分析的高效液相色谱图。图3是实施例6-7所分析的高效液相色谱图。图4是实施例8-10所分析的高效液相色谱图。图5是实施例11-13所分析的高效液相色谱图。图6是实施例14-16所分析的高效液相色谱图。具体实施方式下面结合实施例，更进一步阐述本发明的主旨。下述实施例用来解释而非限制本发明，在本发明的精神和权利要求前提下，对本发明作出的任何修改均被认为落入本发明的保护范围。下述实施例中目标产物的分析采用高效液相色谱法。waters高效液相色谱仪(1525泵、柱温箱、2487紫外可见双通道检测器、717-plus自动进样器、breeze控制软件包)，色谱柱为phenomenexluna5µmphenyl-hexyl,250mm×4.6mm，柱温为35℃，检测波长为278nm，进样量10µl。高效液相色谱分析采用双相梯度洗脱的方式，其中a相为水相(含2%的醋酸和9%的乙腈，v/v)，b相为有机相(含2%的醋酸和80%的乙腈，v/v)。实施例1～10采用iso14502-2:2005(e)的洗脱的方式；实施例11～13在iso14502-2:2005(e)的洗脱条件基础上调整为0至10min(100%a)→10至21.25min(76%a)→21.25至29min(76%a)→29至29.2min(76%a,1.3mi/min)→29.2至39min(76%a,1.3mi/min)→39至39.2min(100%a)→39.2至45min(100%a)；实施例14～16在iso14502-2:2005(e)的洗脱条件基础上调整为0至10min(100%a)→10至21.25min(76%a)→21.25至39min(76%a)→39至41min(100%a)→41至46min(100%a)。下述实验例中所采用的茶树鲜叶或嫩茎采自2015年5月上旬，并放置冰箱中冷冻(-20℃)备用。下述实验例中所采用的茶树鲜叶或嫩茎为在研钵中充分粉碎研磨的鲜叶或嫩茎。下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1准确称取0.7257g粉碎研磨的嫩茎置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯，常温(15℃)振荡5min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图1中实施例-1和表1)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表1高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积2238262157493137064556072725751913019277150实施例2准确称取0.7023g粉碎研磨的嫩茎置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯，水浴(35℃)振荡120min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图1中实施例-2和表2)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表2高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积207622243586522939399851418620412256156880实施例3准确称取0.6411g粉碎研磨的嫩茎和0.2170g粉碎研磨的茶树鲜叶置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯，水浴(35℃)振荡120min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图1中实施例-3和表3)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表3高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积2749060未检出140670265097502498556447697563实施例4准确称取0.5g粉碎研磨的茶树鲜叶，微波高火40秒后，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯，振荡提取后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图2中实施例-4和表4)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表4高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积28398594821524853479832149218264198143545实施例5准确称取0.5g粉碎研磨的茶树鲜叶(作为实施例4的平行样)，微波高火40秒后，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯，振荡提取后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图2中实施例-5和表5)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表5高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积29632885378428272401097723761674837587189实施例6准确称取0.5g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯，水浴(35℃)振荡反应5min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图3中实施例-6和表6)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表6高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积281122887151349179600956135093150445393842实施例7准确称取0.5g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯，水浴(35℃)振荡反应30min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图3中实施例-7和表7)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表7高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积2780535未检出829488455256123762170850528947实施例8准确称取0.2481g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯，水浴(15℃)振荡反应120min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图4中实施例-8和表8)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表8高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积1820408未检出1538888658108142926108894171845实施例9准确称取0.525g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml特定水饱和的乙酸乙酯(水饱和的乙酸乙酯和石油醚体积之比为40:1)，水浴(35℃)振荡反应30min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图4中实施例-9和表9)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表9高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积2960583未检出782014493280134249177667608392实施例10准确称取0.5025g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml特定水饱和的乙酸乙酯(水饱和的乙酸乙酯和石油醚体积之比为20:1)，水浴(35℃)振荡反应30min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图4中实施例-10和表10)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表10高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-g+tf-3,3′-g积分面积3253717未检出742215472706136650192368703953实施例11准确称取0.5115g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml特定水饱和的乙酸乙酯(水饱和的乙酸乙酯和正已烷体积之比为8:1)，水浴(45℃)振荡反应30min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图5中实施例-11和表11)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表11高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-gtf-3,3′-g积分面积3383546未检出717187586483135748197222159649457178实施例12准确称取0.5391g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml特定水饱和的乙酸乙酯(水饱和的乙酸乙酯和石油醚体积之比为8:1)，水浴(18℃)振荡反应60min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图5中实施例-12和表12)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表12高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-gtf-3,3′-g积分面积31101592957963873573040133102182781152277441419实施例13准确称取0.5146g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml特定水饱和的乙酸乙酯(水饱和的乙酸乙酯和石油醚体积之比为8:1)，水浴(18℃)振荡反应120min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图5中实施例-13和表13)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表13高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-gtf-3,3′-g积分面积3080455未检出512429486095129237193550153854438713实施例14准确称取0.5082g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯和5ml石油醚，充分混合并水浴(35℃)振荡反应30min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图6中实施例-14和表14)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表14高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-gtf-3,3′-g积分面积3239301未检出61771224738140088243423193513757353实施例15准确称取0.5261g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入20ml水饱和的乙酸乙酯和10ml石油醚，充分混合并水浴(35℃)振荡反应30min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图6中实施例-15和表15)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表15高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分咖啡碱ecegcgecgtftf-3-gtf-3′-gtf-3,3′-g积分面积3395020未检出41575658083387182871130266551148实施例16准确称取0.5479g粉碎研磨的茶树鲜叶，置于100ml平底三角烧瓶中，加入10ml水饱和的乙酸乙酯和10ml石油醚，充分混合并水浴(35℃)振荡反应30min后，迅速以滤纸减压过滤，得过滤液，过滤液在真空度-0.07mpa～-0.1mpa和温度50℃以下进行充分浓缩后，加入5%的乙醇水溶液20ml，充分振荡提取目标物并定容于25ml容量瓶中，摇匀后进样10μl进行高效液相色谱分析(结果见图6中实施例-16和表16)，其余溶液浓缩干燥得富含茶儿茶素的茶黄素产品。表16高效液相色谱分析图中各成分积分面积成分egcgecgtftf-3-gtf-3′-gtf-3,3′-g积分面积59107804257955046436421161471当前第1页12