本发明提供一种新型咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺化合物，或此类化合物药学上可接受的盐，其制备方法，其药物组合物，以及其用于制备预防和/或治疗与蛋白激酶活性异常相关疾病的药物、特别是与bcr-abl蛋白激酶活性异常相关疾病的药物的方法。
背景技术：
蛋白激酶是将atp上的磷酸基团转移到蛋白质上特定的丝氨酸、苏氨酸、或酪氨酸残基上的酶。蛋白质的磷酸化导致信号传导途径的激活，对体内复杂的生物过程起了关键的作用，包括细胞生长、代谢、分化和死亡。由不正常或不适当的蛋白激酶活性引起的异常信号已知与很多疾病有关，包括癌症、炎症、自身免疫性疾病、代谢性疾病、感染、中枢神经系统疾病和心血管疾病等。因此，蛋白激酶是近年来药物开发的热门靶点(cohen,nat.rev.drugdiscovery2002,1,309)。
位于人体第9号染色体上的c-abl基因和第22号染色体长臂远端的bcr基因相互易位，产生了两个融合基因：位于22q-染色体上的bcr-abl基因和位于9q+染色体上abl-bcr基因。bcr-abl基因是费城染色体，它表达210kd的蛋白质(p210bcr-abl)。bcr-abl蛋白质的abl部分含有abl的酪氨酸激酶，它在原型的c-abl中是受严密调节的，但在bcr-abl融合蛋白质中被连续地激活，从而导致细胞生长的失控。bcr-abl存在95％的cml的患者中，以及10-25％急性淋巴细胞白血病(all)的患者中。伊马替尼(imatinib)是一种bcr-abl酪氨酸激酶的抑制剂，并已临床证明是一种治疗cml的有效制剂(drukeretal.n.engl.j.med.2006,355,2408)。然而，尽管持续伊马替尼治疗，一些cml患者在晚期或爆炸危机阶段会复发，原因是产生对药物的抗药性。抗药性的分子基础是bcr-abl的激酶结构区域出现对伊马替尼抗性的变体。目前，第二代bcr-abl激酶抑制剂已经上市，主要有达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、博舒替尼(bosutinib)和普纳替尼(ponatinib)。虽然这些药物在上市初期均能显示出令人鼓舞的成效，但一些研究者报道它们使用后将在bcr-abl激酶区引发新的突变。因此，开发更新的针对突变体的bcr-abl激酶抑制剂显得很有必要。
技术实现要素：
本发明提供一种咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl激酶抑制剂，其为具有如下通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐：
上述通式i中：
(a)r1是独立的氢，或者甲基；r2是任意取代的n元环烃基，其中n＝3-11，并且环上包括至多n-1个杂原子，这些杂原子独立的选自氮、氧、硫和磷，或者
(b)r1和r2连接形成一个任意取代的m元氮杂环烃基，其中m＝3-11，并且环上包括至多m-2个另外的杂原子，这些杂原子独立的选自氮、氧、硫和磷。
本发明提供如通式i中所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述的药学上可接受的盐包括但不限于盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐、酒石酸盐等。
本发明提供一种药用组合物，其包括单位剂量的如通式i所述的化合物、一种药学上可接受的载体和赋形剂，以及可选的其他bcr-abl激酶活化介导病症治疗剂。
本发明提供如通式i所述的化合物的前体药物。
本发明提供如通式i所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗由bcr-abl激酶活化介导的病症药物中的应用。所述bcr-abl激酶活化介导病症可为增殖性疾病。所述增殖性疾病具体可选自：实体瘤、肉瘤、cml、慢性粒细胞白血病、胃肠道间质瘤(gist)、急性粒细胞白血病(all)、甲状腺癌、胃癌、直肠癌、多发性骨髓瘤、瘤形成以及其他增生性或增殖性疾病、或其组合。
在具体的实施方案中：
本发明提供如通式i所示化合物或其药学上可接受的盐，其中(a)r1
是独立的氢，或者甲基；r2是任意取代的n元环烃基，其中n＝3-11，并且环上包括至多n-1个杂原子，这些杂原子独立的选自氮、氧、硫和磷。
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(a)r1是独立的氢，或者甲基；r2是任意取代的n元环烷基，其中n＝3-11，并且环上包括至多n-1个杂原子，这些杂原子独立的选自氮、氧、硫和磷。
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(a)r1是独立的氢，或者甲基；r2是任意取代的n元环烷基，其中n＝6-11，并且环上包括至少1个氮原子，和至多n-2个杂原子，这些杂原子独立的选自氮、氧、硫和磷。
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(a)r1是独立的氢，或者甲基；r2是任意取代的n元氮杂环烷基，其中n＝6-11，并且环上取代基选自甲基，卤素取代基，羟基和氨基。
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(a)r1是独立的氢，或者甲基；r2是甲基取代的n元氮杂环烷基，其中n＝6-11。
本发明提供如权利要求1所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(a)r1是独立的氢，或者甲基；r2选自下述基团：
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(b)r1和r2连接形成一个任意取代的m元氮杂环烃基，其中m＝3-11，并且环上包括至多m-2个另外的杂原子，这些杂原子独立的选自氮、氧、硫和磷。
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(b)r1和r2连接形成一个任意取代的m元氮杂环烷基，其中m＝3-11，并且环上包括至多m-2个另外的杂原子，这些杂原子独立的选自氮、氧、硫和磷。
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(b)r1和r2连接形成一个任意取代的m元氮杂环烷基，其中m＝5-7，并且环上包括至多m-2个另外的杂原子，这些杂原子独立的选自氮、氧、硫和磷。
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(b)r1和r2连接形成一个任意取代的m元氮杂环烷基，其中m＝5-7，并且环上包括0-1个另外的氮原子。
本发明提供如通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中(b)r1和r2连接形成一个任意取代的m元氮杂环烷基，其中m＝5-7，环上包括0-1个另外的氮原子，并且取代基选自甲基、卤素取代基、羟基和氨基。
本发明提供如通式i所示的化合物，其结构式选自下表：
本发明提供如通式i所示的化合物，其结构式如p16：
本发明提供如通式i所示的化合物，其结构式如p17：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl激酶抑制剂，是新型的具有抗bcr-abl激酶活性的化合物，在体外对bcr-abl激酶具有良好的抑制活性。bcr-abl激酶在细胞信号转导和转化中发挥重要作用，它通过磷酸化和活化一系列下游底物，促使cml成熟粒细胞无限增殖。bcr-abl在正常细胞中不表达，是治疗cml的理想靶标。bcr-abl抑制剂通过抑制bcr-abl激酶活性可达到治疗cml的目的。试验结果表明本发明所制备的咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl激酶抑制剂能够有效地抑制bcr-abl的活性并抑制肿瘤细胞的生长和增殖。说明此类咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl激酶抑制剂可用于制备bcr-abl抑制剂药物和抗肿瘤药物。
本发明提供的咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl激酶抑制剂的制备方法，具有原料易得，反应条件温和，反应过程操作简单，所用试剂便宜的优点。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的示例性实施方案。然而，这些实施方案仅为说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
定义
本文使用的以下术语和表达具有指定的含义。
“药学上可接受的盐”是指把母体化合物中的碱性基团转换成盐的形式。药学上可接受的盐包括，但不仅限于，碱性基团例如胺(氨)基的无机或有机酸盐类。本发明药学上可接受的盐可以由母体化合物合成，即母体化合物中的碱性基团与1-4当量的酸在一个溶剂系统中反应。
本发明还包括所述化合物的前药。前药是一个药理物质(药物)，由母体药物衍生出来。一旦进入体内，前药就被代谢转变成母体药物。前药可通过对母体药物的一个或多个官能团进行取代而制备，其取代基团在体内将被降解而释放出母体化合物来。
具体地讲，本发明所述的蛋白激酶还包括突变的激酶，如突变的abl和bcr-abl激酶。突变的abl和bcr-abl激酶包括，有一个或多个下列的突变体：g250e、e255v、t315i、f317l和m351t等。
“ic50”指特定的测试化合物在测试该效应的实验中产生50％最大抑制效应的数量、浓度或剂量。
制备方法
本发明的化合物可通过已知的化学反应和步骤来制备。下面展示了一些合成本发明的化合物的代表性的方法。众所周知，期望的目标化合物所需的取代基的性质往往决定了合成的优选方法。
本发明的另一方面涉及通式i化合物的制备方法。本发明的化合物可以使用以下的步骤和方法制备。
总体步骤
制备本发明实施例中的化合物可以采用方案1或方案2两种方案。较方案2相比，方案1需要用带有保护基(pg)的中间体(sm4)参与反应，在合成的最后一步脱除保护基即可得到目标化合物。
方案1
方案二
本专利保护的化合物可以使用此合成路线合成。3-碘-4-甲基苯甲酸甲酯(sm1)与三甲基硅基乙炔在双三苯基磷二氯化钯催化下发生sonogashira偶联反应得到中间体1。对中间体1实施脱三甲基硅基保护基得到中间体2。咪唑并[1,2-b]哒嗪(sm2)与n-碘代丁二酰亚胺在dmf中加热得到碘代中间体3。中间体2在dmf中与中间体3反应，用钯催化剂，如四(三苯基膦)钯，从而得到中间体4。中间体4在甲醇和四氢呋喃混合溶剂中用碱如氢氧化锂水解得到中间体5。2-氟-5-硝基三氟甲苯(sm3)与sm4或sm5在碱性条件下如碳酸钾于一种溶剂体系如乙腈中反应得到硝基化合物中间体6或8。将中间体6或8上的硝基在一种溶剂如甲醇中与氢气反应，用钯碳做催化剂，得到中间体7或9。中间体5和中间体7或9在dmf中用一种缩合剂如edci发生缩合反应，得到目标化合物或进一步在酸性条件下脱去保护基得到目标化合物p1-p19。
实施例1
4-甲基-3-((三甲基硅基)乙炔基)苯甲酸甲酯
将3-碘-4-甲基苯甲酸甲酯(sm1)(30g,0.471mol)溶解在四氢呋喃(1200ml)中。加入三甲基硅基乙炔(92.3g,0.942mol)和二异丙基乙基胺(72.9g,0.565mol)。体系抽真空，然后充氮气。加入碘化亚铜(8.92g,0.047mol)和双三苯基磷二氯化钯(16.5g,0.024mol)。体系抽真空，然后充氮气。在氮气氛围下于80℃搅拌4小时，冷却至室温后，该混合物用硅藻土过滤，硅藻土用乙酸乙酯彻底洗涤。滤液依次用水和饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤和浓缩至干。粗产物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:50)，得到标题化合物(95.1g，82.6％)为棕色固体。lc-ms(m/z)＝247.6[m+h]+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(s,1h),7.86(d,j＝8.4hz,1h),7.30(d,j＝8.4hz,1h),3.41(s,3h),2.32(s,3h),0.11(s,9h)。
3-乙炔基4-甲基苯甲酸甲酯
将4-甲基-3-((三甲基硅基)乙炔基)苯甲酸甲酯(95g,0.386mol)和氟化钾(67.2g,1.158mol)搅拌溶于1000ml甲醇，室温搅拌过夜。浓缩至干，粗品经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:50)，得到标题化合物(51g，76.1％)为黄色固体。lc-ms(m/z)＝175.2[m+h]+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.29(s,1h),7.82(d,j＝8.4hz,1h),7.34(d,j＝8.4hz,1h),4.15(s,1h),3.85(s,3h),2.41(s,3h)。
3-碘咪唑并[1,2-b]哒嗪
将咪唑并[1,2-b]哒嗪(40g,0.336mol)，n-碘代丁二酰亚胺(90g,0.402mol)溶于n，n-二甲基甲酰胺(500ml)，置换氮气3次。将混合物80℃加热3小时，加入另外一批n-碘代丁二酰亚胺(45g,0.201mol)，继续在80℃加热4小时。冷却，将反应混合物倒入水(250ml)中，并用二氯甲烷(2×150ml)萃取。收集有机相，na2so4干燥，过滤、浓缩至干。粗品经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:10)，得标题化合物(45g，54.9％)为棕色固体。lc-ms(m/z)＝246.1[m+h]+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.46(d,j＝4.4hz,1h),7.92(d,j＝9.2hz,1h),7.85(s,1h),7.08(dd,j＝4.4,9.2hz,1h)。
3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酸甲酯
向100ml瓶中加入3-碘咪唑并[1,2-b]哒嗪(10g,0.041mol)，3-乙炔基4-甲基苯甲酸甲酯(7.14g,0.041mol)，四(三苯基膦)钯(1.42g,0.0021mol)，碘化亚铜(0.778g,0.0041mol)，二异丙基乙基胺(6.35g,0.049mol)和n’n-二甲基甲酰胺(50ml)。将混合物置换氮气三次后加热80℃搅拌4小时，然后冷却，将反应混合物倒入水(150ml)中，并用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。收集有机相，na2so4干燥，过滤和浓缩至干。粗品经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:5)，得标题化合物(10g，84.7％)为白色固体。lc-ms(m/z)＝292.6[m+h]+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.76(d,j＝3.2hz,1h),8.29(s,1h),7.98(dd,j＝3.2hz,9.2hz,1h),7.90(d,j＝8.4hz,1h),7.85(s,1h),7.34(d,j＝8.4hz,1h),7.22(d,j＝9.2hz,1h),3.86(s,3h),2.35(s,3h)。
3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酸
将3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酸甲酯(10g,0.034mol)溶于四氢呋喃/甲醇/水(2:2:1,200ml)后加入氢氧化锂(3.3g,0.137mol)。反应体系在室温下搅拌过夜。反应结束后，体系在减压下除去有机溶剂，所得物用6n盐酸溶液调至ph5～6。体系中生成的白色沉淀经过滤，洗涤、干燥后得标题化合物(9g,94.6％)为淡黄色固体。lc-ms(m/z)＝276.1[m-h]-。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.03(s,1h),8.76-8.75(d,j＝3.2hz,1h),8.45(s,1h),8.07-8.05(d,j＝8.4hz,1h),7.97-7.94(dd,j1＝3.2hz,j2＝9.2hz,1h),7.85(s,1h),7.44-7.42(d,j＝8.4hz,1h),7.23-7.20(d,j＝9.2hz,1h),2.47(s,3h)。
(r)-(1-(4-硝基-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
将1-氟-4-硝基-2-(三氟甲基)苯(2g,9.57mmol)，r)-3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷(1.9g,10.5mmol)溶于乙腈(30ml)后加入碳酸钾(2.9g,21.1mmol)。反应体系在80℃下搅拌过夜，然后冷却，将反应混合物倒入水(20ml)中，并用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。收集有机相，na2so4干燥，过滤和浓缩至干。粗品经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:5)，得标题化合物(2.7g，74％)为白色固体。lc-ms(m/z)＝376.4[m+h]+。
(r)-(1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
将(r)-(1-(4-硝基-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(2.0g,5.3mmol)溶于甲醇(40ml)后加入pd/c(10％，200mg)。体系抽真空，然后充氢气。在氢气球氛围下于室温搅拌过夜，混合物用硅藻土过滤，硅藻土用甲醇彻底洗涤。滤液浓缩后所得粗产物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:1)，得到标题化合物(1.7g，91％)为白色固体。lc-ms(m/z)＝346.4[m+h]+。
(r)-n-(4-(3-氨基吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺
向20ml单口瓶中加入3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酸(100mg,0.36mmol)，(r)-(1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(125mg,0.36mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(104mg,0.54mmol)，4-二甲氨基吡啶(66mg,0.54mmol)，n’n-二甲基甲酰胺(5ml)。将混合物置换氮气三次后加热50℃搅拌3小时，然后冷却，将反应混合物倒入水(10ml)中，并用二氯甲烷(3×10ml)萃取。收集有机相，na2so4干燥，过滤和浓缩至干。粗品溶于三氟乙酸(0.5ml)的二氯甲烷(5ml)溶液，室温反应2小时。将反应混合物浓缩，用甲醇/二氯甲烷重结晶得标题化合物的三氟乙酸盐(113mg，43％)为白色固体。lc-ms(m/z)＝505.6[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.42(s,1h),8.74(dd,j＝1.6,4.4hz,1h),8.28(dd,j＝1.6,9.2hz,1h),8.24(s,1h),8.21(d,j＝1.6hz,1h),8.13(d,j＝2.4hz,1h),8.00(dd,j＝2.4,9.2hz,1h),7.96(dd,j＝1.6,7.6hz,1h),7.56(d,j＝8.4hz,1h),7.42(q,j＝4.4hz,1h),7.29(d,j＝8.4hz,1h),3.51-3.45(m,2h),3.27-3.22(m,2h),3.15-3.11(m,1h),2.55(s,3h),2.51-2.33(m,2h)。
以下实施例2-10皆按照方案1和实施例1的方法制备。
实施例2
(s)-n-(4-(3-氨基吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝505.1[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.42(s,1h),8.74(dd,j＝1.6,4.4hz,1h),8.28(dd,j＝1.6,9.2hz,1h),8.24(s,1h),8.21(d,j＝1.6hz,1h),8.13(d,j＝2.4hz,1h),8.00(dd,j＝2.4,9.2hz,1h),7.96(dd,j＝1.6,7.6hz,1h),7.56(d,j＝8.4hz,1h),7.42(q,j＝4.4hz,1h),7.29(d,j＝8.4hz,1h),3.70-3.77(m,2h),3.51-3.45(m,2h),3.27-3.22(m,2h),3.15(q,j＝4.8hz,1h),2.61(s,3h)。
实施例3
(r)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-(3-(甲胺基)吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝519.4[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.52(s,1h),9.24-9.16(m,1h),9.82(dd,j＝1.2,4.4hz,1h),8.37(s,1h),8.34(dd,j＝1.2,9.2hz,1h),8.22(d,j＝2.0hz,1h),8.17(d,j＝2.4hz,1h),8.03(dd,j＝2.4,8.8hz,1h),7.98(dd,j＝2.0,8.8hz,1h),7.56-7.50(m,1h),7.42(d,j＝9.2hz,1h),3.87-3.80(m,1h),3.51-3.46(m,1h),3.35-3.29(m,2h),3.23-3.17(m,1h),2.61(s,3h),2.60-2.57(m,3h),2.33-2.28(m,1h),2.12-2.03(m,1h)。
实施例4
n-(4-((3s,4s)-3-氨基-4-羟基吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺，和n-(4-((3r,4r)-3-氨基-4-羟基吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺混合物
lc-ms(m/z)＝521.6[m+h]+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.61(dd,j＝1.6,4.4hz,1h),8.14(d,j＝2.0hz,1h),8.08(dd,j＝1.6,9.2hz,1h),8.05(s,2h),7.90-7.86(m,2h),7.46(s,1h),7.36-7.30(m,2h)，4.25-4.22(m，1h),3.68-3.58(m,3h)，3.35-3.33(m,1h),3.25-3.22(m,2h),3.20-3.10(m,1h),2.64(s,3h)。
实施例5
(r)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-(哌啶-3-基-氨基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝519.4[m+h]+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(d,j＝1.2hz,2h),7.74-7.72(m,2h),7.62-7.60(m,2h),7.32(d,j＝8.0hz,2h),6.78(d,j＝8.8hz,2h),6.58(br,1h),3.53-3.51(m,1h),3.21(dd,j＝2.4,11.6hz,1h),2.91-2.86(m,1h),2.77-2.71(m,1h),2.64-2.59(m,1h),2.48(s,3h),1.94-1.92(m,1h),1.60-1.51(m,3h)。
实施例6
(r)-n-(4-(3-氨基哌啶-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝519.4[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.59(s,1h),8.20-8.09(m,5h),7.96(d,j＝7.6hz,1h),7.57-7.53(m,2h),7.40-7.37(m,2h),3.16-3.13(m,2h),2.85-2.83(m,1h),2.72-2.70(m,2h),2.60(s,3h),2.04-2.01(m,1h),1.84-1.81(m,1h),1.64-1.56(m,1h),1.50-1.45(m,1h)。
实施例7
(s)-n-(4-(3-氨基哌啶-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝519.5[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.57(s,1h),8.74(d,j＝7.6hz,1h),8.21-8.18(m,2h),8.12(dd,j＝1.6,8.8hz,1h),8.03(m,2h),7.96(dd,j＝1.6,7.6hz,1h),7.58(t,j＝8.8hz,2h),7.41(m,1h),3.23(m,1h),3.15-3.12(m,1h),2.86-2.83(m,1h),2.74-2.68(m,2h),2.60(s,3h),2.03-2.00(m,1h),1.85-1.82(m,1h),1.65-1.56(m,1h),1.48-1.41(m,1h)。
实施例8
(r)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-(3-(甲胺基)哌啶-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝533.6[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.58(s,1h),8.75-8.71(m,3h),8.21-8.19(m,2h),8.12(d,j＝8.0hz,1h),7.96(d,j＝8.0hz,1h),7.59-7.54(m,2h),7.41(m,1h),3.24-3.19(m,2h),2.87-2.84(m,1h),2.73(q,j＝10.0hz,2h),2.61(s,6h),2.12-2.09(m,1h),1.88-1.84(m,1h),1.65-1.55(m,1h),1.49-1.44(m,1h),1.27-1.16(m,1h)。
实施例9
n-(4-(4-氨基哌啶-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝519.5[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.55(s,1h),8.74(d,j＝3.6hz,1h),8.20(s,1h),8.17(d,j＝1.6hz,1h),8.09-8.03(m,3h),7.95(d,j＝8.0hz,1h),7.57(t,j＝8.0hz,2h),7.40(m,1h),2.97-2.94(m,2h),2.85-2.76(m,3h),2.60(s,3h),1.99-1.97(m,2h),1.72-1.64(m,2h)。
实施例10
(r)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-(甲基(哌啶-3-基)氨基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝533.2[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.53(s,1h),8.74(dd,j＝1.6,4.4hz,1h),8.28(dd,j＝1.6,9.2hz,1h),8.21(d,j＝2.0hz,1h),8.17(d,j＝2.4hz,1h),8.09(dd,j＝2.4,8.8hz,1h),7.96(dd,j＝1.6,8.0hz,1h),7.63-7.57(m,2h),7.56(d,j＝8.0hz,1h),7.42(q,j＝4.4hz,1h),3.02(d,j＝11.6hz,1h),2.85-2.82(m,2h),2.61(s,3h),2.56(s,3h),2.36-2.31(m,2h),1.85-1.82(m,1h),1.63-1.59(m,1h),1.24(m,2h)。
实施例11
(r)-n,n-二甲基-1-(4-硝基-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-胺
将1-氟-4-硝基-2-(三氟甲基)苯(300mg,1.4mmol)，(r)-(+)-3-二甲氨基吡咯烷双盐酸盐(261mg,1.4mmol)溶于乙腈(20ml)后加入碳酸钾(387mg,2.8mmol)。反应体系在80℃下搅拌过夜，然后冷却，将反应混合物倒入水(10ml)中，并用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。收集有机相，na2so4干燥，过滤和浓缩至干。得粗品标题化合物(320mg)为黄色固体直接用于下一步反应。lc-ms(m/z)＝304.4[m+h]+。
(r)-1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)-n,n-二甲基吡咯烷-3-胺
将(r)-n,n-二甲基-1-(4-硝基-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-胺(310mg,1mmol)溶于甲醇(15ml)后加入pd/c(10％，31mg)。体系抽真空，然后充氢气。在氢气球氛围下于室温搅拌过夜，混合物用硅藻土过滤，硅藻土用甲醇彻底洗涤。滤液浓缩后所得粗产物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1:1)，得到标题化合物(265mg，97％)为黄色固体。lc-ms(m/z)＝274.2[m+h]+。
(r)-n-(4-(3-(二甲基胺)吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺
向20ml单口瓶中加入3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酸(100mg,0.36mmol)，(r)-1-(4-氨基-2-(三氟甲基)苯基)-n,n-二甲基吡咯烷-3-胺(96mg,0.36mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(140mg,0.72mmol)，4-二甲氨基吡啶(88mg,0.72mmol)，n’n-二甲基甲酰胺(10ml)。将混合物置换氮气三次后加热50℃搅拌3小时，然后冷却，将反应混合物倒入水(15ml)中，并用二氯甲烷(3×15ml)萃取。收集有机相，na2so4干燥，过滤和浓缩至干。粗品经柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷＝1:20)，得到标题化合物(35mg，13％)为黄色固体。lc-ms(m/z)＝533.6[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.41(s,1h),8.72(dd,j＝1.6,4.4hz,1h),8.47(s,1h),8.26(dd,j＝1.2,9.2hz,1h),8.24(d,j＝3.2hz,1h),8.21(d,j＝1.6hz,1h),8.18(d,j＝2.8hz,1h),7.95(dd,j＝1.6,8.0hz,1h),7.53(d,j＝5.6hz,1h),7.51(d,j＝6.4hz,1h),7.39(dd,j＝4.4,9.2hz,1h),4.02(s,1h),3.43-3.34(m,2h),3.28-3.23(m,1h),3.14-3.08(m,1h),2.83-2.81(d,j＝9.2hz,3h),2.60(s,3h),2.56-2.53(m,3h),2.37-2.30(m,1h),2.18-2.13(m,1h)。
以下实施例12-19皆按照方案2和实施例11的方法制备。
实施例12
n-(4-((3r,4r)-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯
基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺，和
n-(4-((3s,4s)-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺混合物
lc-ms(m/z)＝547.8[m+h]+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.55(d,j＝2.0hz,1h),8.11(dd,j＝1.2,8.8hz,1h),8.07(s,1h),8.06(d,j＝2.0hz,1h),7.99(s,1h),7.89(dd,j＝2.0,8.8hz,1h),7.82(dd,j＝2.0,8.0hz,2h)，7.40(d,j＝8.0hz，1h),7.24-7.18(m,2h)，4.35-4.29(m,1h),4.05-4.02(m,1h),3.77(q,j＝4.4hz,1h),3.60(q,j＝4.4hz,1h),3.23-3.14(m,2h),2.65(s,3h),2.05(s,1h)。
实施例13
n-(4-((3s,4r)-3-羟基-4-甲基吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺，和n-(4-((3r,4s)-3-羟基-4-甲基吡咯烷-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺混合物
lc-ms(m/z)＝520.4[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.32(s,1h),8.72(dd,j＝1.6,4.4hz,1h),8.26(dd,j＝1.6,9.2hz,1h),8.23(s,1h),8.19(d,j＝2.0hz,1h),8.08(d,j＝2.4hz,1h),7.94(dd,j＝2.0,8.0hz,1h),7.89(dd,j＝2.4,9.2hz,1h),7.53(d,j＝8.0hz,1h),7.39(dd,j＝4.4,9.2hz,1h),7.11(d,j＝9.2hz,1h),5.07(d,j＝4.4hz,1h),3.86-3.84(m,1h),3.51-3.44(m,2h),3.11(dd,j＝4.8,9.6hz,1h),2.94(dd,j＝6.4,9.2hz,1h),2.60(s,3h),2.10-2.06(m,1h),1.01(d,j＝6.8hz,3h)。
实施例14
(r)-n-(4-(3-(二甲胺基)哌啶-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝547.6[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.58(s,1h),10.12(s,1h),8.73(d,j＝3.2hz,1h),8.28-8.19(m,3h),8.11(d,j＝8.8hz,1h),7.96(d,j＝8hz,1h),7.57(d,j＝8.8hz,1h),7.55(d,j＝8hz,1h),7.40(m,1h),3.29-3.27(m,2h),2.89-2.70(m,8h),2.61(s,3h),2.16-2.13(m,1h),1.90-1.87(m,1h),1.63-1.53(m,2h),
1.24-1.21(m,1h)。
实施例15
3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝533.7[m+h]+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.02(d,j＝4.0hz,1h),8.54(s,1h),8.46(d,j＝9.2hz,2h),8.15(d,j＝2.0hz,1h),7.91(dd,j＝2.0,8.0hz,1h),7.90-7.86(m,2h),7.74(dd,j＝2.4,8.0hz,1h)，7.46(d,j＝8.0hz，1h),7.01(d,j＝9.2hz,1h)，3.60(d,j＝13.2hz,2h),3.26-3.20(m,2h),2.92(d,j＝7.6hz,3h),2.63(s,3h),2.31(d,j＝14.0hz,2h),2.16-2.14(m,1h),1.86-1.76(m,2h)。
实施例16
3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-(甲基(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝547.2[m+h]+。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.63(dd,j＝1.6,4.4hz,1h),8.17(d,j＝1.6hz,1h),8.10(dd,j＝1.6,4.4hz,2h),8.07(s,1h),7.97(dd,j＝2.8,8.4hz,1h),7.89(dd,j＝2.0,8.0hz,1h),7.54(d,j＝8.8hz,1h)，7.48(d,j＝8.0hz，1h),7.36(q,j＝8.8hz,1h)，3.03(d,j＝8.4hz,2h),2.72(s,3h),2.65(s,3h),2.41(s,3h),2.34-2.28(m,3h),1.91-1.87(m,2h),1.66-1.58(m,2h)。
实施例17
3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-(4-甲基-1-高哌嗪
基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝533.4[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.84(s,1h),8.73(dd,j＝1.6,4.4hz,1h),8.26(dd,j＝1.6,9.2hz,1h),8.24(s,1h),8.21(d,j＝1.6hz,1h),8.18(d,j＝2.4hz,1h),8.11(dd,j＝2.4,8.4hz,1h),7.96(dd,j＝2.0,8.0hz,1h),7.62(d,j＝8.4hz,1h),7.53(d,j＝8.4hz,1h),7.40(dd,j＝4.4,9.2hz,1h),3.50-3.43(m,3h),3.45-3.28(m,2h),3.20-3.09(m,3h),3.05-3.03(m,1h),2.84(s,3h),2.60(s,3h),2.14-2.09(m,1h)。
实施例18
3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-(((3ar,5r,6as)-2-甲基八氢环戊烷[c]吡咯-5-基)氨基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝559.3[m+h]+。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.27(s,1h),10.04(s,1h),8.73(d,j＝4.4hz,1h),8.28-8.26(m,2h),8.18(d,j＝1.6hz,1h),7.97-7.96(m,1h),7.93(dd,j＝1.6,8.0hz,1h),7.85(d,j＝9.2hz,1h),7.52(d,j＝8.0hz,1h),7.40(dd,j＝4.4,9.2hz,1h),7.01-6.98(m,1h),4.41(s,1h),3.83-3.75(m,2h),3.14-3.07(m,2h),2.86(s,3h),2.60(s,3h),2.44-2.39(m,2h),2.30-2.27(m,1h),1.60-1.53(m,1h),1.42-1.34(m,2h)。
实施例19
3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基-n-(4-(甲基((3ar,5r,6as)-2-甲基八氢环戊烷[c]吡咯-5-基)氨基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
lc-ms(m/z)＝573.6[m+h]+。
本发明的化合物对bcr-abl蛋白激酶活性和细胞增殖的抑制是使用以下描述的程序进行测试的。
实施例a：bcr-abl蛋白激酶酶活性的测试
激酶abl购自carna公司，底物atp购自sigma公司，底物tksubstrate-biotin和检测试剂盒htrfkinease-tkkit购自cisbio公司，选用htrf(homogeneoustimeresolvedfluorescence，均相时间分辨荧光)方法检测目标化合物的抑酶活性，操作方法按照试剂盒说明进行。将atp(10mm)和tksubstrate-biotin(500μm)用缓冲液(hepes50mmph7.2,mgcl210mm,egta5mm,edta2mm,mncl22mm,cisbioseb50nm,na3vo40.1mm,bsa0.1mg/ml,dtt1mm)稀释配制成atp(13.2μm)-tksubstrate-biotin(2.2μm)的底物混合溶液(2.2×)；abl激酶用上述缓冲液稀释配制成abl(wt1.8nm,t315i1.1nm,e255k0.66nm)的2.2×酶工作溶液备用；
将目标化合物(p1-p19)和阳性对照药(ponatinib)用上述缓冲液分别配制成1.0×10-4mol/l，3.3×10-5mol/l，1.1×10-5mol/l，3.7×10-6mol/l，1.2×10-6mol/l，4.1×10-7mol/l,1.4×10-7mol/l,4.6×10-8mol/l,1.5×10-8mol/l,5.1×10-9mol/l浓度梯度的样品溶液(dmso浓度为11％)，于384孔板上每孔依次加入5μl酶溶液和1μl样品溶液；空白孔加5μl缓冲液和1μl11％的dmso溶液；26℃孵育15分钟，再加入5μlatp-tksubstratebiotin底物混合溶液起始反应；26℃下孵育60分钟；加入htrf检测试剂10μl，在26℃下孵育60分钟。采用perkinelmer多功能酶标仪的tr-fret模块测定每孔的荧光值，计算本发明咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl抑制剂对abl的抑制率和ic50。
实施例b：k562细胞活性测试
采用celltiter-glo法检验本发明咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl抑制剂对肿瘤细胞的生长抑制活性：取对数生长期的人慢性粒细胞白血病细胞(k562细胞)，用添加10％fbs的rpmi1640培养基稀释成3×104个/ml的细胞溶液，平行接种于96孔培养板中(3000个/孔)，每孔接种体积为100μl，37℃、5％co2培养箱中培养过夜；每孔加入不同浓度的待测化合物5μl，使孔中化合物的终浓度为1×10-7mol/l，3.3×10-8mol/l，1.1×10-8mol/l，3.7×10-9mol/l，1.2×10-9mol/l，4.1×10-10mol/l，1.4×10-10mol/l，4.5×10-11mol/l，1.5×10-11mol/l，5.1×10-12mol/l，每个浓度设2个复孔，阴性对照加细胞不加化合物，设10个复孔，ponatinib为阳性对照，继续培养72h；每孔加入celltiter-glo50μl，振荡10分钟，采用perkinelmer多功能酶标仪的化学发光模块测定每孔化学发光值，然后计算细胞抑制率，并根据抑制率求出ic50值。
本发明提供的咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl激酶抑制剂对bcr-abl激酶和k562细胞的抑制活性结果，如表1所示：
表1抑制剂对bcr-abl激酶抑制活性结果(ic50)
nd：未检测
结果显示本发明的化合物咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl激酶抑制剂对bcr-abl激酶和k562细胞生长具有较强的抑制活性。bcr-abl激酶在细胞信号转导中发挥很重要的作用，它通过磷酸化和活化一系列下游底物，促使cml成熟粒细胞无限增生。bcr-abl在正常细胞中不表达，是治疗cml的理想靶标。上述咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类bcr-abl激酶抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制效果良好，可用作抗肿瘤药物。