技术领域本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于北极海洋放线菌的发酵培养基及发酵方法。
背景技术：
北极海洋具备常年低温、高辐射、动态冰雪覆盖、受气候变化影响明显等特征，属于极端环境。生存其中的微生物在长期的适应与进化过程中，形成了生境相关的生理生化与遗传机制。相比陆地和近海，人类对于北极海洋及其微生物认识和探索较少。两方面的原因使得来自该环境中的微生物可能给人类带来新的发现与资源。已有少量的研究表明来自北极海洋环境中的微生物确实能产生新颖的次级代谢产物，有望开发成为天然药源。放线菌是生产微生物天然产物的主力军之一，例如氯霉素、万古霉素等在生活中发挥重要作用的药物均来自于放线菌。授权公告号为CN102181387B的专利文献本发明公开了一种海洋链霉菌及利用其制备星形孢菌素和K-252d的方法。星形孢菌素和K-252d是从海洋链霉菌(Streptomycessp.)SCSIO1667的发酵培养物中制备得到的。申请公布号为CN103555619A的专利文献公开了用于北极海洋放线菌Streptomycessp.R-527F生产大环四重内酯类化合物的培养基。该培养基适于北极放线菌的生长，且可大大提高大环四重内酯类化合物Dinactin的产量。放线菌Streptomycessp.604F由中国极地研究中心自北冰洋楚科奇冠445米水深的沉积物样品中分离得到，该菌株16SrRNA基因序列可查阅NCBIGenBank数据库(登录号KJ017969)，且有相关文章进行过报道(Liaoetal.,BMCMicrobiology.2016；陈瑞勤等，微生物学报.2014)。该菌株在2216E平板上菌落呈乳白圆形、菌落周围光滑，在2216E液体培养基中形成桔黄色菌丝球。该菌株对白色念珠菌具有强抑制作用，而且基因筛选表明具有多个跟次级代谢产物合成相关的基因，如PKS(聚酮合酶)、NRPS(非核糖体多肽合成酶)、卤化酶等。因此，该菌株具有良好的天然产物研究潜力。然而微生物合成次级代谢产物受到多种因素的影响，例如培养基组成、发酵温度、时间、发酵方式等，在不同培养条件下可能发酵产物差异很大，尤其对于来自极地低温环境中的菌株，温度可能会产生较大影响。通过高通量测序技术获得的基因组信息表明，放线菌Streptomycessp.604F的大多数基因簇在常规的培养条件下都处于沉默状态，即不合成对应的化合物产物。如何使得菌株合成次级代谢产物的潜力最大化，获得最丰富的产物种类，仍然需要针对该菌株进行多种探索和优化。HPLC-TOFMS(高效液相色谱/电喷雾飞行时间质谱联用)技术可以用于快速检测发酵产物中化合物丰富程度，并便于进行横向比较。HPLC-TOFMS结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力，是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段。质谱能逐个分析高效液相色谱分离开的有机物，获得分子量，结合数据库搜索，可以获得一些化合物的分子式，为推断可能的产物提供信息。
技术实现要素：
本发明提供了一种发酵培养基，用于北极海洋放线菌Streptomycessp.604F发酵，显著提高该菌株次级代谢产物多样性，有助于充分发掘该菌株产生新的次级代谢产物的潜能。一种北极海洋放线菌的发酵培养基，以人工海水为溶剂，每100mL培养基中含有：麦芽提取物0.5-5g、酵母提取物0.25-3g、葡萄糖0.25-3g，所述培养基的pH值为6-8。所述人工海水参照国际标准ASTMD1141-98配制。作为优选，配制100mL人工海水的原料包括：氯化钠0.01-3g、硫酸钠0.1-1.2g、碳酸氢钠0.001-0.2g、溴化钾0.001-0.5g、硼酸0.001-0.3g、六水氯化镁0.1-1g、七水硫酸镁0.01-0.5g、一水硫酸锰0.001-0.4g、无水氯化钙0.01-1g，余量为水。更为优选，配制100mL人工海水的原料包括：氯化钠0.25g、硫酸钠0.5g、碳酸氢钠0.02g、溴化钾0.005g、硼酸0.003g、六水氯化镁0.5g、七水硫酸镁0.04g、一水硫酸锰0.05g、无水氯化钙0.1g，余量为水。作为优选，所述的发酵培养基，以人工海水为溶剂，每100mL培养基中含有：麦芽提取物0.8-2g、酵母提取物0.4-1g、葡萄糖0.4-1g，所述培养基的pH值为7-8。更为优选，所述的发酵培养基，以人工海水为溶剂，每100mL培养基中含有：麦芽提取物1g、酵母提取物0.5g、葡萄糖0.5g，所述培养基的pH值为7.3。本发明的培养基是在现有报道培养基中选择涵盖多种碳源、氮源和微量元素等成分的配方进行改进，使其更适合北极海洋放线菌Streptomycessp.604F的产物合成。次级代谢产物的合成需要一些初级代谢产物作为中间体，但过量的初级代谢终产物往往会抑制次级代谢产物的合成，只有在消耗掉这些过量的抑制剂后，才有利于大量合成次级代谢产物。葡萄糖作为碳源可以被菌株快速利用生长，因此能快速获得后续发酵所需要的菌体量，但不利于积累次级代谢产物，因此在发酵培养基中需要控制一定的量。而酵母、麦芽提取物等复杂有机碳源、氮源相对利用较慢，可以减弱代谢产物的阻遏作用，有利于合成和积累次级代谢产物。因此通过优化组合培养基中的氮源和碳源，获得所述培养基配方适合北极海洋放线菌Streptomycessp.604F次级代谢产物的合成。本发明所述的北极海洋放线菌Streptomycessp.604F自北冰洋楚科奇冠445米水深的沉积物样品中分离得到，保存于中国极地研究中心；相关文章对该菌株进行报道，如《北极海洋链霉菌604F的卤化酶基因克隆及特征》。本发明提供了所述的发酵培养基在北极海洋放线菌Streptomycessp.604F发酵中的应用。本发明还提供了一种北极海洋放线菌的发酵方法，包括以下步骤：(1)将活化的北极海洋放线菌Streptomycessp.604F菌株接种于种子培养基中，培养得到种子液；(2)将种子液接种于所述的培养基中，于15-25℃条件下发酵7-10天，获得发酵液。所述种子培养基为ISPII培养基。ISPII培养基的配方为：麦芽提取物10g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，人工海水配置1L，pH＝7.2。步骤(1)中，活化的菌株经二级种子扩大培养，得到所述种子液，所述种子液的OD600值为0.4-0.8。其中一级种子培养基和二级种子培养基均为ISPII培养基。作为优选，每级种子扩大培养的条件为：接种量为1-2％，在20-25℃、转速为150-180rpm条件下培养4-6天。步骤(2)中，种子液的接种量为1-3％。上述接种量为菌液占培养基的体积比。作为优选，步骤(2)中，发酵过程中，以转速为150-180rpm进行振荡培养。作为优选，步骤(2)中，发酵的温度为25℃。本发明研究证明，在其他条件相同的情况下，在25℃下得到的发酵产物的种类较15℃条件下的产物多出约36％。本发明具备的有益效果：(1)本发明培养基成分均为常见试剂，原料易得，成本低，制备方法简单，有利于大规模工业化生产；(2)本发明的培养基适合用于北极海洋放线菌Streptomycessp.604F的培养，在本发明的发酵条件下，能够显著提高次级代谢产物的多样性，有助于充分发掘该菌株产生新的次级代谢产物的潜能。附图说明图1为实施例1中发酵工艺流程图。图2为实施例1中北极海洋放线菌Streptomycessp.604F在六种培养基及两种发酵温度条件下产生的次级代谢产物的LC-MS检测结果图。具体实施方式下面用实施例进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规操作或者制造厂商所推荐的条件。本发明所述的北极海洋放线菌Streptomycessp.604F自北冰洋楚科奇冠445米水深的沉积物样品中分离得到，保存于中国极地研究中心。实施例11、种子的制备从-80℃取出菌株Streptomycessp.604F甘油保存管，化冻后划线接种到ISPII琼胶平板上，20℃静置培养4天。挑取单菌落接种3mLISPII液体培养基，20℃摇床150转每分钟培养4天，再取1mL接种到100mLISPII液体培养基，同样条件培养4-6天，制得种子液。2、发酵培养基的配置按照以下培养基的配方，每种培养基配置2L，用人工海水配置，最后调节pH值，配置好的培养基按照每个500mL的锥形瓶中加入200mL培养基进行分装，并在121℃高压蒸汽灭菌20分钟。培养基中用到的大豆粉需要先煮沸后过滤使用。培养基I：5.0％淀粉、1.0％葡萄糖、2％大豆粉、0.01％KH2PO4、0.01％KNO3，以人工海水配置，pH7.3。培养基II：1％麦芽提取物、0.5％酵母提取物、0.5％葡萄糖，以人工海水配置，pH7.3。培养基III：1％淀粉、0.1％K2HPO4、0.1％MgSO4·7H2O、0.5％NaCl、0.1％(NH4)2SO4、0.1％CaCO3、微量的FeSO4·7H2O、MnCl2·7H2O、ZnSO4·7H2O(各1mg/L)，以人工海水配置，pH7.3。培养基IV：1％甘油、1％大豆粉、0.1％CaCO3、0.5％NaCl，以人工海水配置，pH6.8。培养基V：1.5％葡萄糖、1.5％淀粉、2％大豆粉、1％酵母提取物、0.5％NaCl、0.3％CaCO3、0.01％CuSO4·5H2O、0.05％ZnSO4·7H2O，以人工海水配置，pH7.3。培养基VI：2％葡萄糖、0.2％NH4Cl、0.1％NaCl、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O、0.002％CaCl2、0.001％柠檬酸铁铵、0.09％L-甘氨酸、0.04％L-谷氨酸、0.025％L-精氨酸、0.018％L-天冬氨酸、0.012％L-亮氨酸、0.01％L-酪氨酸、0.008％L-天冬酰胺、0.007％L-苯丙氨酸、3mL微量金属溶液(mg/L)(0.3H3BO3、0.2CoCl2、0.1ZnSO4、0.03Na2MO4、0.024MnCl2、0.02NiCl2、0.082CuSO4)，以人工海水配置。其中人工海水配方：氯化钠0.25％、硫酸钠0.5％、碳酸氢钠0.02％、溴化钾0.005％、硼酸0.003％、六水氯化镁0.5％、七水硫酸镁0.04％、一水硫酸锰0.05％、无水氯化钙0.1％，以去离子水配制。上述配方中各组分以质量体积百分比(g/100mL)计。本发明的培养基应用的组分(原料)均为商业化的普通化学产品。3、摇瓶发酵培养上述种子液按照1％(V/V)的接种量分别接种培养基I到VI六种培养基，各取1L的量分别放置在15℃和25℃的摇床中，设置转速为150转每分钟，同时进行培养。25℃培养的菌株在第7天时收集，而15℃的菌株在第10天时收集。其发酵工艺流程参见附图1。4、发酵粗提物制备分别收集上述十二种培养条件下的菌体发酵液共1L，在40℃下真空干燥，获得固体粗提物，加入150mL甲醇进行两次抽提，合并两次抽提液，并准确定容到300mL。5、HPLC-TOFMS分析取1mL上述提取液，微孔滤膜过滤，用于做HPLC-TOFMS分析。本发明中使用的仪器为安捷伦1290HPLC-6224TOFMS，采用的条件参数为：液相色谱部分：分析柱为YMCODS-AA12S03-L546WT(4.6×75mm,S-5μm,12nm)，进样量为10μL，流速为0.5mL/min，流动相为乙腈-水(都含有0.1％甲酸)梯度洗脱：0-1.2min5％乙腈，10min35％乙腈，15min65％乙腈，24min95％乙腈，27min95％乙腈，27.5min5％乙腈，30min5％乙腈。质谱部分：正离子模式ESI，氮气温度340℃，氮气流速8L/min，喷雾器压力40psi。结果提取质量范围为125到1800，峰高为50000。6、结果比较分析菌株Streptomycessp.604F在六种培养基(培养基I到VI)中分别在15和25℃下发酵后，获得的粗提物中产物总的液相色谱图如图2所示。峰的多少可以大致代表产物的多样性高低。从图2中可见，六种培养基对发酵产物的影响比较明显，其中以培养基VI获得的产物峰最少，而其他几种培养基出峰位置和数目也存在差异。图2的结果还表明，发酵温度对产物的影响也很显著，例如培养基I、III和V在15℃和25℃下发酵产物色谱峰差异较大。但培养基VI在这两个温度下产物峰变化较小。总体而言，25℃比15℃下发酵产物的色谱峰更加复杂。进一步提取质谱结果进行比较，如表1和表2所示。菌株Streptomycessp.604F在培养基II于25℃发酵时获得的产物多样性最高，其次为在培养基II于15℃发酵、培养基III于25℃发酵。产物多样性最低的条件为培养基VI在15℃发酵。因此，通过上述方案比较，获得提高北极菌株Streptomycessp.604发酵产物多样性的发酵条件为：培养基II、发酵温度为25℃。表1.15℃条件下发酵产物多样性检测表2.25℃条件下发酵产物多样性检测