技术领域本发明属于分子生物学领域，涉及一种与甜瓜白粉病抗性相关的SNP标记及其应用。
背景技术：
甜瓜(CucumismeloL.)是葫芦科黄瓜属甜瓜种的重要经济作物。白粉病是一种严重危害甜瓜生产的世界性病害，可导致植株光合能力下降，引起早衰甚至死亡，严重影响甜瓜的产量和品质。近年来，随着生产的规模化和商品化程度的提高，白粉病迅速蔓延，已成为国内外甜瓜等瓜类作物绿色生产的主要障碍。尽管白粉病可采用化学防治，但由于甜瓜白粉病的生理小种较多、分化快，易产生抗药性，化学药剂很难十分有效地保证无公害生产。因此，筛选和培育抗病品种是防治甜瓜白粉病病害最为经济、有效的途径。由于甜瓜白粉病病原菌属于专性寄生菌，只能在活体寄主上存活，白粉病的人工接种和田间抗病性鉴定，易受环境和季节的影响，导致采用传统的杂交、回交和表型选择进行甜瓜抗白粉病育种周期长、成本高；分子标记辅助育种可以从基因型上筛选种质资源，减少育种选择的盲目性，大大缩短育种进程，提高育种效率。获得与甜瓜抗白粉病基因连锁的分子标记，特别是针对目标基因的关键突变位点开发的功能性分子标记是利用分子标记辅助甜瓜抗白粉病性状转育，实现种质创新的前提条件。
技术实现要素：
本发明的目的是一种与甜瓜白粉病抗性相关的SNP标记及其应用。本发明所提供的应用具体为甜瓜基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测甜瓜基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定甜瓜对白粉病抗性中的应用；所述SNP位点在甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位；所述SNP位点处的核苷酸为C或G。本发明还提供了一种用于鉴定或辅助鉴定甜瓜对白粉病抗性的试剂。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定甜瓜对白粉病抗性的试剂，具体是用于检测甜瓜基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质；所述SNP位点在甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位；所述SNP位点处的核苷酸为C或G。所述“用于检测甜瓜基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质”可为能够鉴定所述SNP位点的单核苷酸多态性的任何物质，如为如下a)-d)中任一种：a)引物对A，为如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对；(a2)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；b)所述引物对A和限制性内切酶HphI或其同裂酶；c)成套单链DNA甲，为如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列5的第22-46位核苷酸所示的单链DNA、序列表中序列6的第22-46位核苷酸所示的单链DNA、和序列表中序列7所示的单链DNA组成的成套单链DNA；(c2)由将序列表中序列5的第22-46位核苷酸、序列表中序列6的第22-46位核苷酸和序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的三条单链DNA分子组成的，且与(c1)中所述成套单链DNA功能相同的成套单链DNA；d)成套单链DNA乙，为如下(d1)或(d2)：(d1)由序列表中序列5所示的单链DNA、序列表中序列6所示的单链DNA、和序列表中序列7所示的单链DNA组成的成套单链DNA；(d2)由将序列表中序列5、序列6和序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的三条单链DNA分子组成的，且与(d1)中所述成套单链DNA功能相同的成套单链DNA。含有所述试剂用于鉴定或辅助鉴定甜瓜对白粉病抗性的试剂盒也属于本发明的保护范围。具体的，所述试剂盒中还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A的核苷酸序列为序列表中序列5的第1-21位，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列为序列表中序列5的第1-21位的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团；所述荧光探针B的核苷酸序列为序列表中序列6的第1-21位，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列为序列表中序列6的第1-21位的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团。在本发明中，所述荧光基团A为FAM；所述荧光基团B为HEX；所述淬灭基团为BHQ。在本发明中，所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B是存在于KASPV4.02×MasterMix中的，其中所述KASPV4.02×MasterMix为英国LGC公司产品，其产品目录号为KBS-1016-002(适用于96/384孔板)或KBS-1016-011(适用于1536孔板)。所述试剂或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定甜瓜对白粉病抗性中的应用也属于本发明的保护范围。本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测甜瓜为抗白粉病品种还是感白粉病品种的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测甜瓜为抗白粉病品种还是感白粉病品种的方法，具体可包括如下步骤：检测待测甜瓜的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为C还是G还是C和G，以确定所述待测甜瓜的基因型是C:C还是G:G还是C:G，根据所述待测甜瓜的基因型按照如下确定所述待测甜瓜为抗白粉病品种还是感白粉病品种：若所述待测甜瓜为C:C基因型或者C:G基因型，则所述待测甜瓜为或候选为抗白粉病品种；若所述待测甜瓜为G:G基因型，则所述待测甜瓜为或候选为感白粉病品种；所述SNP位点在甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位；所述SNP位点处的核苷酸为C或G；所述C:C基因型为甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C的纯合型；所述G:G基因型为甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为G的纯合型；所述C:G基因型为甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C和G的杂合型。在所述方法中，所述“检测待测甜瓜的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为C还是G还是C和G”的方法为测序分析法或酶切鉴定法或KASP检测法；所述测序分析法具体可包括如下两个步骤：PCR扩增和对所述PCR扩增所得产物进行测序从而确定所述SNP位点处的核苷酸为C还是G还是C和G；所述PCR扩增的模板为所述待测甜瓜的基因组DNA，所用的引物对满足如下条件：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产物的序列含有序列表中序列8；所述酶切鉴定法具体可包括如下两个步骤：PCR扩增和对所述PCR扩增所得产物采用限制性内切酶HphI或其同裂酶进行完全酶切从而确定所述SNP位点处的核苷酸为C还是G还是C和G；所述PCR扩增所用的引物对满足如下条件：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产物的序列含有序列表中序列8；所述KASP检测法具体可包括如下两个步骤：KASP扩增和对所述KASP扩增所得产物进行荧光扫描从而确定所述SNP位点处的核苷酸为C还是G还是C和G；所述KASP扩增的模板为所述待测甜瓜的基因组DNA，所用的KASP引物满足如下条件：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板进行KASP扩增所得扩增产物的序列含有序列表中序列8。在本发明中，在所述测序分析法中，所述引物对具体为所述引物对A(序列1和序列2)；在所述酶切鉴定法中，所述引物对具体为所述引物对A(序列1和序列2)；在所述KASP检测法中，所述KASP引物具体为所述成套单链DNA乙(由序列表中序列5、序列6和序列7所示的单链DNA组成的成套单链DNA)。进一步，所述测序分析法具体可包括如下步骤：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板，采用所述引物对A(序列1和序列2)进行PCR扩增，得到扩增产物；对所述扩增产物进行测序，根据测序结果按照如下确定所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C还是G还是C和G：若所述扩增产物为331bp单一DNA片段，且第87位为C，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C；若所述扩增产物为327bp单一DNA片段，且第83位为G，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为G；若所述扩增产物为331bp和327bp两个DNA片段，且331bpDNA片段的第87位为C，327bpDNA片段的第83位为G，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C和G(其中，第……位是以所述扩增产物中具有序列8所示序列的DNA链来说的)；所述酶切鉴定法包括如下步骤：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板，采用所述引物对A(序列1和序列2)进行PCR扩增，得到扩增产物；对所述扩增产物采用限制性内切酶HphI进行完全酶切(所述完全酶切是指限制性内切酶HphI的用量相对于所述扩增产物而言是过量的，足以切割所有能够被切割的所述扩增产物)，根据酶切结果按照如下确定所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C还是G还是C和G：若所得酶切产物为255bp和76bp两个DNA片段，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C；若所得酶切产物为327bp单一DNA片段，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为G；若所得酶切产物为255bp、76bp和327bp三个DNA片段，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C和G。所述KASP检测法具体包括如下步骤：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒(KASP扩增所用引物为所述成套单链DNA乙，扩增试剂中含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A的核苷酸序列为序列表中序列5的第1-21位，5’末端连接荧光基团FAM；所述淬灭探针A的核苷酸序列为序列表中序列5的第1-21位的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团BHQ；所述荧光探针B的核苷酸序列为序列表中序列6的第1-21位，5’末端连接荧光基团HEX；所述淬灭探针B的核苷酸序列为序列表中序列6的第1-21位的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团BHQ)进行KASP扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C还是G还是C和G：若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为G；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜基因组中所述SNP位点处的核苷酸为C和G。所述试剂或所述试剂盒或所述方法在甜瓜育种中的应用也属于本发明的保护范围。如下(A)或(B)的方法也属于本发明的保护范围：(A)培育抗白粉病甜瓜品种的方法，包括选择C:C基因型的甜瓜作为亲本进行育种的步骤；所述C:C基因型为甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C的纯合型；(B)培育感白粉病甜瓜品种的方法，包括选择G:G基因型的甜瓜作为亲本进行育种的步骤；所述G:G基因型为甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为G的纯合型。在本发明中，所述SNP位点也可描述为：以甜瓜基因组DNA为模板，采用由序列表中序列5所示的单链DNA和序列表中序列6所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第46位核苷酸；所述SNP位点处的核苷酸为C或G(其中，第……位是以所述扩增产物中具有序列8所示序列的DNA链来说的)。相应的，所述C:C基因型也可描述为：以甜瓜基因组DNA为模板，采用由序列表中序列5所示的单链DNA和序列表中序列6所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得的扩增产物的自5’末端起第46位核苷酸为C的纯合型；所述G:G基因型也可描述为：以甜瓜基因组DNA为模板，采用由序列表中序列5所示的单链DNA和序列表中序列6所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第46位核苷酸为G的纯合型；所述C:G基因型也可描述为：以甜瓜基因组DNA为模板，采用由序列表中序列5所示的单链DNA和序列表中序列6所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第46位核苷酸为C和G的杂合型(其中，第……位是以所述扩增产物中具有序列8所示序列的DNA链来说的)。在本发明中，所述甜瓜具体可选自如下中任一种：K7-1，K7-2，K7-1和K7-2的杂交后代(如F2或RILs群体)，PMR45，PMR6，PI124111，Topmark，Védrantais，WMR29，NantaisOblong，Edisto47，PI414723，PMR5，IranH，MR1，AR5以及K7-1和长香玉、伽师瓜或伊丽莎白的回交后代(如BC4F2群体)。在本发明中，所述白粉病具体为由白粉病菌P.xanthii2F引起的白粉病。在本发明中，所述抗白粉病是指对白粉病的病情分级标准为0级、1级或2级；所述感白粉病是指对白粉病的病情分级标准为3级、4级或5级。其中，所述对白粉病的病情分级标准为采用孢子悬浮液喷雾接种白粉病菌P.xanthii2F后甜瓜苗期对白粉病的病情分级标准，具体如下：0级：整个植株没有任何病斑；1级：子叶病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的20％以下；2级：子叶病斑和茎病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的20％至50％(不含20％，含50％)、茎病斑面积占茎总面积的20％以下；3级：子叶病斑和茎病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的50％至70％(不含50％，含70％)、茎病斑面积占茎总面积的20％至50％(不含20％，含50％)；4级：子叶病斑、茎病斑和真叶病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的70％以上(不含70％)、茎病斑面积占茎总面积的50％以上(不含50％)和真叶病斑面积占真叶总面积的20％以下；5级：整个植株均布满白粉或植株因感病而死亡。本发明对甜瓜白粉病抗病基因Pm-2F在抗/感病材料中的核酸序列和氨基酸序列进行分析和比对，获得甜瓜抗白粉病基因Pm-2F在抗/感病材料中多态性，根据该白粉病抗病基因Pm-2F的关键SNP位点开发了高通量分析的KASP标记。本发明提供的基于甜瓜抗白粉病Pm-2F基因序列的CAPS分子标记以及KASP高通量分子标记，应用于甜瓜抗白粉病Pm-2F基因的转育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速甜瓜白粉病抗性向优异骨干自交系的转育。本发明为甜瓜抗白粉病品种的选育和分子育种提供了技术支撑，在甜瓜抗白粉病品种选育方面具有重要的应用价值。附图说明图1为利用CAPS-HphI分子标记分析来源于不同遗传背景的甜瓜材料的基因型的部分检测结果。图中标记为a、b、h的三个泳道分别为K7-1(即C:C基因型)、K7-2(即G:G基因型)、K7-1和K7-2的杂交F1(即C:G基因型)。图2为利用甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F高通量分子标记分析96孔样品板SNP分型结果示意图。其中，NTC表示空白对照(黑色)，？表示由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型(粉色)，G:G为红色，C:G为绿色，C:C为蓝色。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。甜瓜品种K7-1：为日本厚皮类型，高抗单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)2F生理小种的甜瓜品种。记载于“ZhangCQ,RenY,GuoSG,etal(2013).ApplicationofcomparativegenomicsindevelopingmarkerstightlylinkedtothePm-2Fgeneforpowderymildewresistanceinmelon(CucumismeloL.).Euphytica,190:157-168”一文，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得该甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。甜瓜品种K7-2：为感白粉病新疆哈密瓜(CucumismeloL.ssp.meloconvar.ameri(Pang.)Greb.)的甜瓜品种。记载于“ZhangCQ,RenY,GuoSG,etal(2013).ApplicationofcomparativegenomicsindevelopingmarkerstightlylinkedtothePm-2Fgeneforpowderymildewresistanceinmelon(CucumismeloL.).Euphytica,190:157-168”一文，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得该甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。甜瓜品种PMR45、PMR6、PI124111、Topmark、Védrantais、WMR29、NantaisOblong、Edisto47、PI414723、PMR5、IranH和MR1：用于白粉病生理小种鉴定的鉴别寄主。记载于“ZhangCQ,RenY,GuoSG,etal(2013).ApplicationofcomparativegenomicsindevelopingmarkerstightlylinkedtothePm-2Fgeneforpowderymildewresistanceinmelon(CucumismeloL.).Euphytica,190:157-168”一文，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得这些甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。甜瓜品种AR5：记载于“朱栋梁，胡静，张强.Vat抗性甜瓜研究进展[J].贵州农业科学,2005,33(2)94-96.”一文，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得该甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。甜瓜品种伽师瓜：记载于“巴雪丽,刘婷婷,钟俐.白粉病胁迫下甜瓜叶片Hsp70差异表达分析[J].生物技术,2014,05期.”一文，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得该甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。甜瓜品种伊丽莎白：记载于“马鸿艳,祖元刚,栾非时.甜瓜种质资源苗期抗白粉病鉴定[J].东北农业大学学报,2009,12期:18-23.”一文，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得该甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。甜瓜品种长香玉：记载于“张棵,柳唐镜,彭德旗等.2013年海南省西甜瓜主导品种推介.中国蔬菜,2013(3)：36-37”一文，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得该甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。白粉病菌P.xanthii2F：记载于“ZhangCQ,RenY,GuoSG,etal(2013).ApplicationofcomparativegenomicsindevelopingmarkerstightlylinkedtothePm-2Fgeneforpowderymildewresistanceinmelon(CucumismeloL.).Euphytica,190:157-168”一文，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得该白粉病病原菌，仅用于重复本发明相关实验使用。实施例1、与甜瓜白粉病抗性相关的SNP的获得前期研究中本发明的发明人所在团队利用图位克隆技术克隆得到Pm-2F基因(参见“发明名称为“植物白粉病抗性相关蛋白Pm-2F及其编码基因与应用”，申请公布号为CN105198977A的中国专利申请)，将Pm-2F基因的全长序列利用F2重组单株与抗感亲本中序列进行比较发现，其中F2重组单株中Pm-2F基因在第23bp和第45bp(相对于基因的起始密码子ATG，其中A为+1位)的变异位点与感病亲本一致，而其它位置所有突变位点均与抗病亲本保持一致(该单株的表型鉴定结果为感病)，进一步分析发现第23bp处的C-G碱基突变使得编码氨基酸由T(苏氨酸)变为S(丝氨酸)。而第45bp处的碱基突变为无义突变，所以推测第23bp处的碱基突变可能是引起甜瓜对白粉病生理小种P.xanthii2F抗感变化的关键SNP变异位点。该SNP位点在甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位；所述SNP位点处的核苷酸为C或G。该SNP突变位点可以应用于开发抗白粉病分子标记。实施例2、基于抗白粉病基因Pm-2F的关键SNP位点设计CAPS标记及其应用一、基于抗白粉病基因Pm-2F的关键SNP位点设计CAPS标记本发明利用实施例1得到的Pm-2F基因在白粉病抗感材料中的SNP位点(在甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位；所述SNP位点处的核苷酸为C或G)，依据突变碱基处酶切位点设计引物，开发设计与抗/感白粉病紧密连锁的CAPS分子标记(命名为CAPS2-HphI分子标记)，其中正向和反向扩增引物分别为：Pm-2F-CAPS2-HphI-F：5'-CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3'(序列1)；Pm-2F-CAPS2-HphI-R：5'-GAAAGATTCATAGGAGAACTCGTCC-3'(序列2)。由于实施例1所得SNP位点的关系(SNP＝C/G)，使得：当为C时形成限制性内切酶HphI的识别序列(↓(N)7TCACC，下划线处为突变碱基，↓表示酶切位置)，可以被HphI切开；而当为G时不能形成限制性内切酶HphI的识别序列，因而不能被HphI切开。通过上述引物(Pm-2F-CAPS2-HphI-F/Pm-2F-CAPS2-HphI-R)对双亲材料(抗病材料K7-1和感病材料K7-2)进行PCR扩增，并结合HphI内切酶对PCR产物进行完全酶切，分别获得抗/感病特异条带，其中抗病条带大小为331bp，抗病条带经HphI酶切消化为255bp和76bp两条带，而感病条带扩增大小为327bp，不含HphI酶切位点，酶切消化后条带大小为327bp。具体操作方法如下：(1)PCR扩增CAPS引物进行PCR扩增反应体系(15μL)：1.5μL含15mMMgCl2的10×Buffer；0.5μL浓度为2.5mM的dNTPs；0.5UTaqDNA聚合酶；1.0μL浓度为10μMPCR上、下游混合引物；20ng模板DNA；ddH2O补足到15μL。其中，TaqDNA聚合酶及反应缓冲液，dNTPs均为北京全式金生物技术有限公司产品。PCR扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，58℃30s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持。其中，PCR仪为AppliedBiosystems公司的Veriti96wellThermalCycler。(2)HphI完全酶切PCR扩增产物酶切反应的反应体系10μL：1.0μL10×Buffer，0.5μL限制内切酶HphI，1.0μLPCR产物，7.5μLH2O；HphI限制内切酶为Fermantas公司产品。酶切反应程序为：37℃酶切12～16h后65℃变性20min，4℃保存。其中酶切所用PCR仪为AppliedBiosystems公司的Veriti96wellThermalCycler。(3)结果判定方法一(不经HphI酶切，直接测序)：若所述扩增产物为331bp单一DNA片段，且第87位为C(即序列3)，则所述待测甜瓜为C:C基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C的纯合型)。若所述扩增产物为327bp单一DNA片段，且第83位为G(即序列4)，则所述待测甜瓜为G:G基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为G的纯合型)。若所述扩增产物为331bp(序列3)和327bp(序列4)两个DNA片段，且331bpDNA片段的第87位为C，327bpDNA片段的第83位为G，则所述待测甜瓜为C:G基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C和G的杂合型)。方法二(经HphI完全酶切)：若所得酶切产物为255bp和76bp两个DNA片段(对应的电泳条带带型记作a)，则所述待测甜瓜为C:C基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C的纯合型)。若所得酶切产物为327bp单一DNA片段(对应的电泳条带带型记作b)，则所述待测甜瓜为G:G基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为G的纯合型)。若所得酶切产物为255bp、76bp和327bp三个DNA片段(对应的电泳条带带型记作h)，则所述待测甜瓜为C:G基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C和G的杂合型)。二、CAPS2-HphI分子标记在不同遗传背景甜瓜材料中的应用分析1、在RIL-F8群体和F2群体单株中的应用供试材料：(1)RIL-F8群体：父本K7-1(抗白粉病)与母本K7-2(感白粉病)进行杂交获取F1代群体，该F1代单粒传自交8代获得的包含106个株系的RILs群体，即为RIL-F8群体。(2)F2群体为：父本K7-1(抗白粉病)与母本K7-2(感白粉病)进行杂交获取F1代群体，该F1代自交获得的2200株F2代分离群体。一方面，利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记对106个RIL-F8株系和2200株F2遗传群体中的甜瓜材料进行PCR和HphI酶切分析(具体方法参见步骤一，以供试材料的基因组DNA为模板)；另一方面，对106个RIL-F8株系和2200株F2遗传群体中的甜瓜材料进行抗病表型鉴定。并进一步统计酶切结果与抗病表型的相关性。其中，甜瓜基因组DNA的提取方法参照Murray等(1980)的方法(MurrayM,ThompsonWF.RapidisolationofhighmolecularweightplantDNA[J].NuclAcidRes,1980,8:668-673.)的基础上改进而成；具体步骤如下：(1)取0.3-0.5g幼嫩叶片于8连排管，每管加300μlCTAB，放入2粒钢珠，用Retch仪进行打碎。(2)每管再加入300μlCTAB，混匀后65℃水浴60min，每隔10min颠倒混匀一次。(3)水浴后置于室温冷却10min，加入300μl氯仿：异戊醇(24:1，体积比)，充分混匀，4500rpm离心15min。(4)取400μl上清液，加入预先加好的400μl预冷的异丙醇中(于96孔深孔板)，轻轻混匀。-20℃放置30min。(5)于4500rpm离心30min，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀2-3次，室温下风干至无乙醇味。(6)加入50-100μl(含0.5-1μlRNase10mg/ml)ddH2O，37℃水浴30min。取5μl样品在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳检测，并以标准λDNA为对照，将样品浓度调为一致。对甜瓜进行抗病表型鉴定的方法具体如下：①苗期抗病接种鉴定：将供试甜瓜的种子浸种、消毒后置于28℃恒温培养箱中催芽18h，随后播种于装有灭菌营养土穴盘中；待子叶展平后，采用孢子悬浮液喷雾接种白粉病菌P.xanthii2F(孢子悬浮液浓度至2.0×105个/mL)，接种12至15d充分发病后开始调查供试植株的抗感反应；②苗期抗病接种鉴定的分级标准：评价甜瓜苗期病情的抗病性，采用如下病情分级标准进行：0级：整个植株没有任何病斑；1级：子叶病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的20％以下；2级：子叶病斑和茎病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的20％至50％(不含20％，含50％)、茎病斑面积占茎总面积的20％以下；3级：子叶病斑和茎病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的50％至70％(不含50％，含70％)、茎病斑面积占茎总面积的20％至50％(不含20％，含50％)；4级：子叶病斑、茎病斑和真叶病斑，子叶病斑面积占子叶总面积的70％以上(不含70％)、茎病斑面积占茎总面积的50％以上(不含50％)和真叶病斑面积占真叶总面积的20％以下；5级：整个植株均布满白粉或植株因感病而死亡。③根据病情分级确定对白粉病的抗感：其中0级、1级、2级为抗病，3级、4级、5级为感病。结果发现：(1)根据上述表型鉴定方法，106个RIL-F8株系中有58个抗病株系和48个感病株系。其中，这58个抗病株系利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记进行检测均显示为C:C基因型；另外48个感病株系利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记进行检测均显示为G:G基因型。(2)根据上述表型鉴定方法，2200个F2群体单株材料中有1673个抗病单株和527个感病单株。其中，这1673个抗病单株中有560个单株利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记进行检测均显示为C:C基因型，1113个单株系利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记进行检测均显示为C:G基因型；另外527个感病单株利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记进行检测均显示为G:G基因型。可见，C:C基因型或C:G基因型的甜瓜为抗白粉病表型，而G:G基因型的甜瓜为感白粉病表型，步骤一提供的CAPS2-HphI分子标记与抗病表型鉴定结果一致性达100％，为与目标性状共分离的分子标记。上述内容充分证实了根据Pm-2F基因的SNP开发的CAPS2-HphI分子标记能够应用于甜瓜白粉病抗/感病筛选和分子辅助育种研究。2、在不同遗传背景的甜瓜种质资源中的应用为了充分验证Pm-2F基因的SNP分子标记在不同遗传背景中的贡献率，本发明选择了来源于不同遗传背景的15份甜瓜种质资源材料对步骤一开发的CAPS2-HphI分子标记进行了进一步验证。其中包括瓜类白粉病生理小种鉴别寄主(7份抗白粉病生理小种P.xanthii2F材料：PMR6、PI124111、WMR29、Edisto47、PI414723、PMR5、MR1，5份感白粉病生理小种P.xanthii2F材料：Topmark、Védrantais、NantaisOblong、IranH和PMR45)，K7-1(抗白粉病)，K7-2(感白粉病)和抗病材料AR5，这15份材料均来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心种质资源库。一方面，利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记进行PCR和HphI酶切分析；另一方面，进行抗病表型鉴定(具体方法参见步骤1)。并进一步统计酶切结果与抗病表型的一致性。结果显示：(1)根据上述表型鉴定方法，PMR6、PI124111、WMR29、Edisto47、PI414723、PMR5、MR1、AR5和K7-1为抗病表型；Topmark、Védrantais、NantaisOblong、IranH、PMR45和K7-2为感病表型。其中，所有具有抗病表型的甜瓜在利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记进行检测时均显示为C:C基因型；所有具有感病表型的甜瓜在利用步骤一设计的CAPS2-HphI分子标记进行检测时均显示为G:G基因型。采用CAPS2-HphI分子标记对来源于不同遗传背景的甜瓜材料的酶切图参见图1(标记为a\\b\\h分别为K7-1、K7-2、K7-1和K7-2的杂交F1)。可见，上述CAPS2-HphI标记可以有效地运用于甜瓜抗白粉病分子辅助育种，在鉴定甜瓜抗白粉病方面具有较高的利用价值。实施例3、基于抗白粉病基因Pm-2F的关键SNP位点设计高通量KASP分子标记引物及其应用一、高通量KASP分子标记引物的设计本发明利用实施例1得到的Pm-2F基因在抗感材料中的SNP位点(在甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位；所述SNP位点处的核苷酸为C或G)，设计高通量KASP分子标记。用于高通量筛选的标记引物序列如下：Pm-2F-F1：5’-CTATGGCAGAATCAATTCTGTTCAC-3’；Pm-2F-F2：5’-CAATGGCAGAATCAATTCTGTTCAG-3’；Pm-2F-R：5’-GTGGGAAAGAACCCAATTTTGTTGC-3’。针对SNP位点，上游引物Pm-2F-F1和Pm-2F-F2的3′端为等位变异碱基(粗体下划线部分的C或G)，将Pm-2F-F1和Pm-2F-F2在5’端加上相应的通用接头序列(荧光标签序列)，如下：Pm-2F-F1adaptor：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′(FAM荧光标签序列)；Pm-2F-F2adaptor：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′(HEX荧光标签序列)。得到相应的高通量KASP分子标记引物序列：Pm-2F_Allele-F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTATGGCAGAATCAATTCTGTTCAC-3’(序列5，其中下划线部分为FAM荧光标签序列)；Pm-2F_Allele-F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATGGCAGAATCAATTCTGTTCAG-3’(序列6，其中下划线部分为HEX荧光标签序列)；Pm-2F-R：5’-GTGGGAAAGAACCCAATTTTGTTGC-3’(序列7)。上述引物由上海生工公司北京合成部合成。二、利用高通量KASP分子标记检测实施例1中SNP的方法的建立1、KASP扩增以待测甜瓜基因组DNA为模板，用步骤一开发的高通量KASP标记的专用引物分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。KASP基因分型PCR反应体系：96孔板：10ng基因组DNA，5μlKASPV4.02×MasterMix，0.14μlKASP72×assaymix，加ddH2O至10μl。384孔板：5ng基因组DNA，2.5μlKASPV4.02×MasterMix，0.07μlKASP72×assaymix，加ddH2O至5μl。1536孔板：384孔板：5ng基因组DNA，2.5μlKASPV4.02×MasterMix，0.07μlKASP72×assaymix，加ddH2O至5μl。其中，KASPV4.02×MasterMix为LGC公司产品，其种用于96/384孔板的KASPV4.02×MasterMix的产品目录号为KBS-1016-002；用于1536孔板的KASPV4.02×MasterMix的产品目录号为KBS-1016-011。KASPV4.02×MasterMix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等组成。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。KASP72×assaymix由步骤一设计引物Pm-2F_Allele-F1、Pm-2F_Allele-F2和Pm-2F-R分别稀释至浓度为100μM后，将Pm-2F_Allele-F1稀释液、Pm-2F_Allele-F2稀释液和Pm-2F-R稀释液与ddH2O按12:12:30:46的体积比混合得到。KASP基因分型PCR扩增反应的反应程序为：阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃20s，61-55℃(每个循环降0.6℃)1min，共循环10次；阶段3：94℃20s，55℃1min，共循环26次。其中PCR水浴热循环为Hydrocycler16-32高通量热循环系统，适用于96、384和1536孔板。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照，每个PCR板设置2个空白对照。2、PCR扩增产物的荧光扫描采用双向单激发读板仪PHERAstar对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm，HEX激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。每个PCR扩增产物样本设置至少3个重复。3、等位基因分型采用KrakenTM软件对双向单激发读板仪PHERAstar扫描数据分析(具体操作方法参考KrakenTM软件说明书，公众可以直接从LGC公司购买，见网址http://www.lgcgroup.com/products/genotyping-software/kraken/#.VhcaT9Kl8_M)，根据分析结果按照如下确定待测甜瓜性别基因的具体基因型：聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示粉色的样本可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型，左下角显示黑色的样本为空白对照。具体而言，如下：若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜为C:C基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C的纯合型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测甜瓜为G:G基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为G的纯合型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜为C:G基因型(即甜瓜基因组中对应于序列表中序列8所示核苷酸序列的第23位为C和G的杂合型)。三、高通量分子标记的验证1、供试材料选取供试体材料包括：以K7-1和K7-2为亲本获得的106个RIL-F8株系和2200株F2群体。以甜瓜亲本材料K7-1、K7-2，及F1代为对照。2、高通量KASP标记检测一方面，采用本发明步骤一开发高通量KASP标记检测步骤1中供试甜瓜的基因型，具体操作参见步骤二，获得各供试甜瓜的基因型。另一方面，对各供试甜瓜进行白粉病抗病表型鉴定，具体参见实施例2步骤二。并进一步统计酶切结果与抗病表型的一致性。另外，本发明的发明人还以实施例2开发的CAPS2-HphI分子标记作为对照。利用上述高通量KASP分子标记体系分析甜瓜亲本材料K7-1、K7-2，RIL-F8群体106个株系和F2群体单株基因型，以已知基因型的甜瓜亲本材料K7-1、K7-2和F1代为对照，检测结果如图2所示，根据Pm-2F基因的C-G关键变异位点设计的标记引物，将RIL-F8群体106个株系SNP分型得到C:C和G:G两种基因型，分别对应为：抗白粉表型和感白粉表型，除个别样品因DNA浓度过低(粉色点)，无法读取数据外，所有SNP检测结果均与表型相符合，准确率达到100％，与CAPS2-HphI酶切结果吻合率达到100％(表1)。将F2群体单株进行SNP分型得到C:C、C:G和G:G三种基因型，分别对应为：抗白粉表型、抗白粉表型和感白粉表型，除个别样品因DNA浓度过低(粉色点)，无法读取数据外，所有SNP检测结果均与表型相符合，准确率达到100％。表1RIL-F8群体CAPS2-HphI标记和KASP标记分析基因型结果与表型比较分析注：CAPS2-HphI标记分析带型与抗病亲本K7-1一致的基因型(即C:C基因型)统计记为a，与感病亲本K7-2(即G:G基因型)一致的记为b。四、高通量分子标记在白粉病抗性转育方面的应用以抗白粉病的K7-1为供体亲本，分别以感白粉病的长香玉、伽师瓜、伊丽莎白为轮回亲本进行甜瓜白粉病的回交转育，利用Pm-2F基因的高通量KASP分子标记进行基因型检测，其中BC群体保留检测基因型为C:G的植株，BC4F2群体保留基因型为C:C的植株。在BC群体单株两片子叶期进行田间对白粉病抗性表型的鉴定，验证田间调查结果是否与基因型检测结果吻合。通过对不同回交群体基因型和表型的数据统计分析，发现Pm-2F基因的高通量分子标记分析结果与表型调查结果均吻合。在回交转育的过程中，随着回交代数的增加果实品质和外观性状逐渐趋近于转育的轮回亲本。转育至BC4代果实品质和外观性状非常接近转育的轮回亲本，将BC4进行了自交，通过高通量分子标记对Pm-2F基因的筛选，培育出符合目标性状的高抗白粉病的甜瓜材料(基因型C:C)。