技术领域本发明属于病毒的检测领域，尤其涉及一种一步法直接检测犬细小病毒的荧光定量PCR的引物、探针、试剂盒及其检测方法。
背景技术：
犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)是引起犬科动物以剧烈的呕吐、出血性肠炎、非化脓性心肌炎和白细胞显著减少为主要特征的烈性传染病毒。犬细小病毒病是一种具有高度接触性的烈性传染病，以呕吐、腹泻和白细胞减少为特征。自然感染犬细小病毒的病例经常发生，即使CPV疫苗免疫后也会发病，幼犬的死亡率非常高(20％-30％)。随着犬饲养业的快速发展，尤其是实验用犬和宠物犬饲养量的大幅增加，犬感染细小病毒病日趋严重，给犬饲养业造成了重大的经济损失。犬细小病毒是一条单负链DNA病毒，无包膜，对物理化学因素具有很强的抵抗力，病毒在粪便中可以存活很长时间，致病力不会降低，传染性很强。病犬是主要的传染源，动物主要通过接触感染发病。犬细小病毒分为1型和2型，其中2型又分为2a、2b和2c三个亚型，CPV-2a、2b与CPV-2相比，只有几个氨基酸的差异。犬细小病毒2型(CPV-2)是引起犬细小病毒病的主要病原微生物。病毒颗粒直径约20-25nm，基因组长5323bp，有两个主要的开放读码框(ORF)：NS读码框和S读码框，前者产物NS1和NS2两种非结钩蛋白，为基因复制和转录所必需，后者主要编码衣壳蛋白VP1(70-90kD)、VP2(62-76kD)及VP3(39-69kD)。VP2是构成病毒衣壳的主要成分，决定了病毒的宿主范围和抗原性。目前检测犬细小病毒的方法主要是观察临床症状，病毒检测方法有试纸条，也有报道用传统PCR和荧光定量PCR，但试纸条的准确性普遍较差，而传统PCR方法耗时较长且灵敏度偏低。但是目前存在的荧光定量PCR虽然相比传统PCR方法和试纸条检测的方法灵敏度和准确度提高，但是仍然存在着检测成本偏高、耗时较长、操作复杂等缺陷。例如，在荧光定量PCR时，需要利用核酸提取液对样本进行预处理并提取病毒核酸(例如：DNA和RNA等)，如果核酸提取的质量不好，会对后续的实验进行影响，尤其是RNA容易发生降解，所以提取的步骤都较为复杂且严格。也有利用生物条形码进行检测犬细小病毒的方法，但是该方法需要用于检测犬细小病毒的生物条形码、与条形码配合使用的互补探针NP链及其核苷酸序列配合使用，并且该方法操作更加复杂，而且成本较高，不利于大样本量检测和流行病学调查研究。
技术实现要素：
鉴于目前犬细小病毒检测方法的局限性，本发明建立了检测犬细小病毒的一步法直接定量PCR检测方法，具有操作简便、成本低、灵敏度高和特异性好等优点，为临床检测提供保障。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：用于犬细小病毒检测的引物，包括：上游检测引物CPV-F包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为5′-GAAGGTATAAATTCACCAGGTTGC-3′；下游检测引物CPV-R包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.2所示的核苷酸序列为：5′-GTGCAAGGTCCACTACGTCC-3′。优选地，所述上游检测引物CPV-F为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游检测引物CPV-R为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。利用上述引物可以扩展目的片段的长度为112bp。本发明的有益效果是：利用上述引物进行检测时，具有很好的特异性。只需对样本进行简单预处理，不需抽提核酸，直接用样本进行检测，具有步骤更简便、成本更低、操作误差更小、耗时更短、灵敏度更高等优点，能够实现快速简便地完成检测。本发明还提供一种用于犬细小病毒检测的探针，包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为5′-AGACACAAGCGGCAAGCAATCCTC-3′。优选地，所述探针为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。发明人通过反复检测、筛选和验证，意外的获得了该条探针，具有特异性较高等优点。进一步，所述探针的5′端具有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3和Cy5中的任一种。采用上述进一步方案的有益效果是：具有合适的、高效的(强烈的)激发和发射波长范围，并且具有光稳定性好等优点。进一步，所述探针的3′端具有淬灭基团，所述淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、TAMRA。采用上述进一步方案的有益效果是：用于接收荧光报告基团发射的荧光信号，采用上述种类的淬灭基团具有灵敏度高等优点。进一步，所述探针的5′端为FAM，3′端为BHQ-1。探针(名称命名为CPV-probe)带有荧光报告基团和淬灭基团的序列为：5’FAM-AGACACAAGCGGCAAGCAATCCTC-3’BHQ-1。采用上述进一步方案的有益效果是：BHQ-1本身不产生荧光，荧光背景低，灵敏度进一步提高。本发明还提供一种用于犬细小病毒检测的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物和/或上述的探针。采取上述技术方案的有益效果为：上述探针与上述引物配合使用，在检测时，只需对样本进行简单预处理，不需抽提核酸，直接用样本进行检测，具有步骤更简便、成本更低、操作误差更小、耗时更短、灵敏度更高等优点，能够实现快速简便地完成检测。进一步，该试剂盒还包括反应液A混合物、阳性对照和阴性对照中的一种或几种；所述反应液A混合物包括Taq酶和PCR反应缓冲液；所述阳性对照为包括CPV-NS基因的DNA片段、质粒或菌株；所述阴性对照为灭菌水。所述CPV-NS基因的GenBank序列号为M19296。包括CPV-NS基因的DNA片段、质粒或菌株可以采用本领域的常规方法制备。例如：可以根据CPV-NS基因的序列设计引物进行PCR扩增，获得DNA片段；可以将获得的DNA与适当的载体连接，获得含有该基因的质粒；也可以将该质粒转入菌株中，获得含有该基因的菌株。本发明提供一种犬细小病毒检测的方法，包括以下步骤：1)采集样品并进行预处理；2)荧光定量PCR进行扩增：将上述的引物、探针、Taq酶、PCR反应缓冲液和步骤1)的样品混合，配制PCR反应体系，得到实验组；同时设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组中的样品为阳性对照，阴性对照组中的样品为阴性对照；之后将实验组、阳性对照组和阴性对照组进行荧光定量PCR进行扩增；3)结果分析和判定：a)在同一次试验中满足阴性对照组的Ct值为空白且阳性对照组的Ct值小于30，说明本次实验有效，否则本次实验无效；b)在步骤a)说明本次实验有效的情况下，若所测样品的扩增曲线不呈S型或Ct值为空白，则实验结果判定为阴性；若所测样品的扩增曲线呈S型且Ct值＜36，则实验结果判定为阳性；若40＞Ct值≥36，则为实验灰度区，需重复实验一次，若重复实验结果增长曲线为S型且Ct值＜40，判定为阳性，否则判定为阴性。进一步，步骤1)中，所述样本包括固体样本和/或液体样本，所述液体样本的预处理方法为离心后取上清，所述固体样本的预处理方法为加入悬浮液混匀后离心取上清。采用上述进一步方案的有益效果是：本发明所述的检测方法首先对临床标本离心，取上清，然后直接利用本发明的探针和上述方法进行定量PCR检测，只需一步即可判断待测样品中是否存在犬细小病毒，是一步法直接检测犬细小病毒的检测方法。该检测方法检测效率高、特异性和敏感性好，能够满足临床检测和疫情监控的目的。进一步，步骤2)中荧光定量PCR进行扩增反应的条件为：采用上述进一步方案的有益效果是：合适的扩增条件有利于保证扩增的准确性。本发明还提供上述用于犬细小病毒检测的引物、探针及试剂盒在检测犬细小病毒中的应用。附图说明图1为一步法荧光定量PCR检测CPV的敏感性实验，从左到右依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的标准病毒液扩增结果；图2为荧光定量PCR产物电泳图，其中，M为DNA分子量maker；N为阴性质控品，其余为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的标准病毒液的检测样品。图3为普通PCR方法检测CPV病毒结果，其中M为DNA分子量maker；D为阳性质控品；N为阴性质控品，其余为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的标准病毒液的检测样品。图4为一步法荧光定量PCR检测CPV的特异性实验，由图4可以看出，CPV为阳性(包括强阳性和弱阳性)，CDV、CAV-II及阴性质控品均为阴性；图5为一步法荧光定量PCR检测犬粪便标本中的CPV，由左至右，第二个为阳性指控品，其余29个阳性为29份病犬粪便标本，5个阴性分别为4个正常犬粪便标本和1个阴性质控品。图6为一步法荧光定量PCR检测犬血清标本中的CPV，22个阳性血清标本均检测出犬细小病毒，阴性对照为正常犬血清标本，检测结果为阴性。具体实施方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本领域的技术熟练人员根据本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。实施例11、特异性引物及探针的设计根据从Genbank上检索到的犬细小病毒的核酸序列，设计用于检测犬细小病毒的引物和探针，其序列如下：上游引物(CPV-F)：5′-GAAGGTATAAATTCACCAGGTTGC-3′，如SEQIDNO.1所示；下游引物(CPV-R)：5′-GTGCAAGGTCCACTACGTCC-3′,如SEQIDNO.2所示；荧光探针(CPV-probe)：5′FAM-AGACACAAGCGGCAAGCAATCCTC-3′BHQ-1。上述引物和荧光探针均由上海吉玛制药技术有限公司合成。上游引物、下游引物和荧光探针的浓度分别为0.2μM、0.2μM和0.2μM。利用上述引物和探针扩增的目的片段的长度为112bp。2、试剂盒组成成分本发明的试剂盒包括组成成分包括四部分：反应液A混合物(Mix-A)、反应液B混合物(Mix-B)、阳性质控品和阴性质控品。其中，Mix-A为Taq酶、PCR反应缓冲液和灭菌水的混合物；Mix-B包括引物CPV-F、引物CPV-R、荧光探针CPV-probe和灭菌水。配制的各组分的浓度和体积如下：其中，Mix-A为Taq酶(浓度为5U/μL，体积为0.5μL)、PCR反应缓冲液(体积为25μL)和灭菌水(体积为2.5μL)的混合物；Mix-B包括引物CPV-F(浓度为10μM，体积为0.5μL)、引物CPV-R(浓度为10μM，体积为0.5μL)、荧光探针CPV-probe(浓度为10μM，体积为0.5μL)和灭菌水(15.5μL)。Taq酶及PCR反应缓冲液购自天根生化科技(北京)有限公司，灭菌水由Millipore超纯水仪制备并高温高压蒸汽灭菌，阳性质控品(即阳性对照)为含有CPV-NS基因的质粒，阴性质控品(即阴性对照)为灭菌水。含有CPV-NS基因的质粒的构建方法参照：犬细小病毒NS1非结构蛋白可诱导细胞凋亡，潘红丽仲飞潘素敏李秀锦张峰张考陈慧慧，微生物学报，2012年第3期：367-373。3、标本的采集与预处理本发明所述方法适用标本类型包括犬的组织、血清、分泌排泄物(例如粪便等)。PBS的配制方法：8g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4)和0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，调pH7.2，定容至1L。组织标本的采集：在无菌条件下取组织约100-200mg左右，置于1.5mL洁净EP管中，加入等倍体积PBS洗涤组织，室温涡旋震荡1min，10000rpm离心2min，取上清保存待检；血清的采集：用一次性无菌注射器抽取受检动物静脉血3-5mL，留取血清，保存待检。分泌排泄物的采集：无菌条件下采集，若是液体标本直接离心取上清；若是固体标本加入等倍体积的PBS，洗涤，涡旋1min，10000rpm离心2min，取上清，保存待检。上述采集的标本应尽快送检，或者保存于-20℃。4、荧光定量PCR扩增反应体系配制如下：Mix-A28μL，Mix-B17μL，样本5uL。PCR反应条件为：hold95℃10s，cycle95℃5s、60℃15s，40个循环。实验组：样本为步骤3获得的待测样本；阳性对照组：样本为阳性质控品，即含有CPV-NS基因的质粒。阴性对照组：样本为阴性质控品，即水。5、结果分析和判定反应结束后，根据各类仪器的软件进行分析，调节阈值，尽量使阴性对照Ct值不出现任何数值。每次实验均应设置阳性对照和阴性对照。首先，在同一次试验中同时满足下面两个条件，即条件1和条件2：条件1：阴性对照组为阴性且Ct值为空白；条件2：阳性对照组为阳性且Ct值＜30。在同时满足条件1和条件2的前提下说明本次实验有效，否则，说明本次实验无效，需重新进行实验。其次，在实验有效的前提下，继续判断，有三种情况：(1)阴性结果判定：所测样品的扩增曲线不呈S型或Ct值为空白，则实验结果判定为阴性。(2)阳性结果判定：所测样品的扩增曲线呈S型，且Ct值＜36，则实验结果判定为阳性。(3)实验灰度区：如果40＞Ct值≥36，则为实验灰度区，需重复实验一次，若重复实验结果增长曲线为S型且Ct值＜40，判定为阳性，否则判定为阴性。实施例2灵敏度实验取成都军区疾病预防控制中心保存的犬细小病毒分离株(该分离株可以为公众所获得)，该犬细小病毒分离株的参考信息参照文献:犬细小病毒的分离鉴定，杜强邱薇范泉水刘华李作生郑颖张富强，2009年第30卷第3期55-58页。病毒滴度滴定TCID50为10-4，依次10倍倍比稀释，稀释倍数分别为：稀释1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍，稀释后的溶液分别记为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，进行灵敏度实验，具体实验步骤参照上述实施例1。一步法CPV荧光检测灵敏度实验结果见如图1，扩增曲线从左至右依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的检测结果。扩增产物进一步用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2，但是检测结果区别不明显，可见对于微量的病毒，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，其结果不易判定。而荧光定量PCR设置阈值后，可通过Ct值进行准确判定，优于普通PCR法。另外同样的病毒标本，进一步采用目前较常用的VP2引物用普通PCR方法进行检测。VP2的上游引物：5′-AACGGATGGGTGGAAATCAC-3′，序列如SEQIDNO.4所示；VP2的下游引物：5′-TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3′，序列如SEQIDNO.5所示。利用VP2的上游引物和VP2的下游引物扩增的目标产物大小为826bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳。检测结果见图3，结果表明，普通PCR方法检测灵敏度比本发明建立的荧光定量PCR方法低100倍。结果证实本方法检测灵敏度较高，对于TCID50为10-4的病毒，稀释100万倍仍能检测到，完全能够满足临床犬标本的检测，并且其灵敏度明显优于普通PCR方法。发明人还采用市售的荷兰英特威犬瘟热-细小二联疫苗进行灵敏度实验，也能得到一致的结论。本发明所述的方法检测灵敏度较高，完全能够满足临床犬标本的检测，并且其灵敏度明显优于普通PCR方法。实施例3特异性实验根据上述实施例1的检测方法，分别从动物标本中分离的犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒-II毒株为待测样品，上述待测样品均保存在成都军区疾病预防控制中心实验室，可以为公众所获得，具体的详细信息可以参照文献：犬瘟热病毒Yunnan株H基因的克隆与表达，聂福平李作生邱薇张富强张连江宋贵强龙贵伟廖金任玉莹余方芳张泉鹏王灵强范泉水，动物医学进展2008年第29卷第1期：2-12页。CDV,CPV,CAV三联DNA疫苗的实验免疫研究，郑颖邱薇李丽红聂福平龙贵伟李作生张富强李江范泉水，云南大学学报：自然科学版，2007，29(5)：529～535。同时设立水为模板的阴性对照，进行验证实验。结果证实本发明所述上游检测引物CPV-F、下游检测引物CPV-R、荧光探针以及检测方法具有很好的特异性，未出现过假阳性，准确率为100％，实验结果见图4。由图4可以看出，检测结果犬细小病毒为阳性，犬瘟热病毒和犬腺病毒-II及阴性质控品为阴性。实施例4犬粪便标本中CPV的检测采集病犬的粪便(5份)和正常犬的粪便(2份)，加入等倍体积的PBS溶液，混匀1min，10000rpm离心，取上清5uL，按上述实施例1所述的反应体系和反应条件等方法进行一步法PCR扩增，结果见图5。由图5可以看出，5份病犬粪便标本及阳性质控品检测结果判定为阳性，2份正常犬粪便及阴性质控品检测结果判定为阴性。又进一步进行了29份病犬的粪便和4份正常犬的粪便进行检测，准确率为100％。实施例5犬血清标本中CPV的检测采集病犬和正常犬的血清，取上清5uL，按上述步骤(4)所述的反应体系和反应条件进行一步法PCR扩增，结果见图6。由图6可以看出，1份病犬血清标本及阳性质控品均检测结果判定为阳性，1份正常犬血清标本结果判定为阴性。又进一步进行了22份病犬的血清和4份正常犬的血清进行检测，准确率为100％。以上结果说明本发明所述的荧光探针、引物及方法，具有较高的灵敏度和良好的特异性，并经过多次重复试验验证，具有很好的重复性和稳定性。并且经过临床犬粪便标本的检验，检测效果较好。本方法具有快速简便，不需抽提核酸，直接取动物标本，经简单处理即可用于检测。经过反复的实验验证，该方法具有很好的灵敏度、特异性和重复性。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。。