喹诺里西啶类生物碱衍生物的制备方法和用途与流程

本发明属于医药化学领域，具体涉及一类新的用于肿瘤或癌症治疗的化合物，特别涉及一类具有抗肿瘤活性的喹诺里西啶类生物碱衍生物及其制备方法，以及此类化合物在作为药物特别是用于肿瘤或癌症治疗的药物的应用。

技术背景

槐定碱是从豆科植物苦豆子中提取分离得到的一种苦参型生物碱，该类生物碱具有喹诺里西啶结构，自1977年李雪梅教授发现其对实体瘤肉瘤180(S180)、宫颈癌、Lewis肺癌等多种动物移植瘤具有稳定的抗癌作用以来，槐定碱已经历了多年的药理学研究，相继有多位研究者证实了槐定碱对胃癌细胞、肝癌细胞、结肠腺癌细胞同样有稳定的抑制增殖作用。槐定碱是一种DNA拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂，能够阻止DNA的复制、转录、重组，影响细胞周期，有效抑制癌细胞增殖，与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂喜树碱类化合物比较，槐定碱存在着来源丰富，结构简单，毒副作用小等优点。槐定碱有望成为继喜树碱之后新型的topo I抑制剂，但槐定碱抗肿瘤活性有限，且极性较大，水溶性强，使之不能广泛的应用于临床。

氮芥类抗肿瘤药物自上世纪就用于肿瘤的治疗，至今仍是临床中一类重要的抗癌药物，氮芥属于生物烷化剂，其能在体内形成缺电子的乙撑亚胺离子，进而与DNA、RNA或某些重要的酶结合，发挥抗肿瘤作用，烷基化部分(双-β-氯乙氨基)是抗肿瘤活性的功能基，氮芥类化合物抗肿瘤活性较强，但由于细胞毒性较大，也限制了其在临床的广泛应用。

基于此，本发明设想将喹诺里西啶类生物碱基团和氮芥基团拼合在一个分子中，设计合成系列喹诺里西啶类生物碱衍生物，期望合成得到的新化合物能发挥二者的协同作用，一方面提高氮芥类选择性，降低毒性，另一方面增强喹诺里西啶类生物碱抗肿瘤活性。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于，公开一类新型结构的喹诺里西啶类生物碱衍生物及其药用盐。

本发明的另一个目的在于，公开一类喹诺里西啶类生物碱衍生物及其药用盐的制备方法。

本发明的再一个目的在于，公开一类以喹诺里西啶类生物碱衍生物及其药用盐为主要活性成份的药物组合物。

本发明还有一个目的在于，公开一类喹诺里西啶类生物碱衍生物及其药用盐用于抗肿瘤的药物方面的用途。

现结合本发明目的，对本发明内容进行详细阐述。

本发明具体涉及式Ⅰ结构的化合物及其药学上可接受的盐：

其中

X＝O，S，N；

5位碳原子立体构型为R-或者S-构型；

R₁为氢，C_1-5直链或支链烷基，环烷基，碳酰基，磺酰基，磷酰基，芳环或取代芳环，苄基，取代苄基，芳杂环，取代芳杂环，芳杂环苄基，取代芳杂环苄基等R₂为氢，C_1-5直链或支链烷基，芳环，取代芳环，苄基，取代苄基，芳杂环，取代芳杂环，芳杂环苄基，取代芳杂环苄基等；

n等于0，1或2。

优先以下化合物及其药学上可接受的盐：

Ⅰ a‐1.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐2.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(p-甲基苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐3.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(p-甲氧基苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐4.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(4-氯苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐5.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(4-硝基苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐6.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(m-甲基苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐7.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(3,4-二甲基苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐8.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(3-硝基苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐9.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(4-氟苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐10.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(4-溴苯氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐11.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(4-甲氧基-4-羰基丁酯)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸；

Ⅰ a‐12.甲基-4-((3aR,3a1S,10aS)-2-((双(2-氯乙基)氨基)(萘-1-氧基)磷酰)-3a,10a-二甲基十二氢吡啶[3,2,1-ij][1,6]萘啶-1-基)丁酸。

式Ⅰ化合物药学上可接受的盐指：化合物与无机酸、有机酸成盐，其中优选：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、葡萄糖酸盐、氨基酸盐。

式Ⅰ化合物的制备路线如下：

原料在甲醇、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、N,N‐二甲基甲酰胺、乙腈、甲苯或乙酸乙酯等溶剂中，与二氯亚砜20～100℃反应，制得中间体II；

原料磷酰氯在甲醇、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、N,N‐二甲基甲酰胺、乙腈、甲苯或乙酸乙酯等溶剂中，与R₁XH在碳酸钾、三乙胺、吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂的催化下，20～100℃反应制得中间体Ⅲ；

中间体Ⅱ在甲醇、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、N,N‐二甲基甲酰胺、乙腈、甲苯或乙酸乙酯等溶剂中，与中间体Ⅲ在碳酸钾、三乙胺、吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂的催化下，20～100℃反应分别制得化合物Ⅰa、Ⅰb和Ⅰc。

反应制得各种化合物或将所得产物溶于DMF、丙酮、甲醇、乙醇、DMSO或乙醚中滴加无机酸、有机酸制成药学上可接受的盐。

具体是将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，于冰水浴下滴加盐酸乙醚至pH＝2，制成盐酸盐；或将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，加入等摩尔牛磺酸，加热搅拌得其牛磺酸盐；抑或将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，于冰水浴下滴加浓硫酸至pH＝3，制成硫酸盐，等等。

本发明式Ⅰ化合物可以与其它活性成分组合使用，只要它不产生其他不利作用，例如过敏反应。

本发明式Ⅰ所示的活性化合物可作为唯一的抗癌药物使用，或者可以与一种或多种其他抗癌药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。

本发明式Ⅰ化合物还包括其异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物，本发明式Ⅰ化合物以及它的异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物，例如水合物、醇合物等。上述化合物还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术。一般来说，对于本发明的目的，与药学可接受的溶剂如水、乙醇等的溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。

本发明提供了一种喹诺里西啶结构衍生物及其药学上可接受的盐，较喹诺里西啶生物碱相比，抗肿瘤活性有了明显的提高，扩大了抗肿瘤药物的种类，给癌症患者多了一种治疗的选择。

体外抗肿瘤作用

(1)实验材料

人肝癌SMMC-7721、人结肠癌LoVo、人乳腺癌MCF-7、人白血病K562、小鼠骨肉瘤S180、小鼠肝癌H22及小鼠成纤维细胞L929等细胞株常规培养于含10％小牛血清的1640培养基中，37℃，5％CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，3-4d传代1次。由天津市医药科学研究所细胞室提供。

MTT(批号：0793Scientific research spescial公司)；RPMI1640培养基(批号：NTF0886Hyclone公司)；新生牛血清(批号：090605杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)等其余试剂均为国产分析纯。

仪器CO₂培养箱型号(BB16/BB5060上海力创科学仪器有限公司)，美国；酶联免疫检测仪(型号：Infinite M200Tecan公司瑞士产)；倒置显微镜(型号：CK奥林巴斯公司日本产)超净工作台(北京半导体设备一厂)。

(2)实验操作

用本发明的部分化合物处理人肝癌SMMC-7721、人结肠癌LoVo、人乳腺癌MCF-7、人白血病K562、小鼠骨肉瘤S180、小鼠肝癌H22及小鼠成纤维细胞L929等细胞株，用MTT法确定化合物的抗增殖活性。

MTT实验方法为：取处于指数生长期的状态良好的细胞，制成每毫升含5×10³个细胞的悬液。将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔100μL，分样品组、对照组(不加样品)和空白组(只有培养基)，每组设定4个复孔。置于恒温CO₂培养箱中培养24h换液，加入相应浓度的受试化合物，培养48h加入MTT，每孔10μL，于培养箱中反应4h后吸去上清液，每孔加入150μL DMSO，在平板摇床上振摇5min，用酶联免疫检测仪在波长570nm处测定每孔的吸收度，计算细胞抑制率后再由统计软件求出IC₅₀值。

(3)实验结果

本发明的部分化合物的抗肿瘤活性通过IC₅₀值来表示，结果如表1所示。

表1化合物对肿瘤细胞及正常细胞的生长增殖抑制作用

(4)结论

药理实验结果表明：在以槐定碱和磷酰氮芥二氯为对照药、与本发明的化合物同时给药的情况下，研究化合物对选定的六种肿瘤细胞和一种正常细胞的生长抑制作用，通过比较它们的抑制率和IC₅₀值发现：本发明的化合物的抗肿瘤性都优于所选定的对照药，且抗肿瘤活性远高于对照药槐定碱；本发明的化合物对肿瘤细胞的生长增殖抑制作用小于对正常细胞的生长增殖抑制，说明化合物有选择性抑制肿瘤细胞，且对K562、S180和H22这三种细胞株的抑制作用为最强。

附图说明

图1为化合物Ⅰa-1的¹H-NMR谱图；

图2为化合物Ⅰa-1的¹³C-NMR谱图；

图3为化合物Ⅰa-2的¹H-NMR谱图；

图4为化合物Ⅰa-2的¹³C-NMR谱图；

图5为化合物Ⅰa-3的¹H-NMR谱图；

图6为化合物Ⅰa-3的¹³C-NMR谱图；

图7为化合物Ⅰa-4的¹H-NMR谱图；

图8为化合物Ⅰa-4的¹³C-NMR谱图；

图9为化合物Ⅰa-5的¹H-NMR谱图；

图10为化合物Ⅰa-5的¹³C-NMR谱图；

图11为化合物Ⅰa-6的¹H-NMR谱图；

图12为化合物Ⅰa-6的¹³C-NMR谱图；

图13为化合物Ⅰa-7的¹H-NMR谱图；

图14为化合物Ⅰa-7的¹³C-NMR谱图；

图15为化合物Ⅰa-8的¹H-NMR谱图；

图16为化合物Ⅰa-8的¹³C-NMR谱图；

图17为化合物Ⅰa-9的¹H-NMR谱图；

图18为化合物Ⅰa-9的¹³C-NMR谱图；

图19为化合物Ⅰa-10的¹H-NMR谱图；

图20为化合物Ⅰa-10的¹³C-NMR谱图；

图21为化合物Ⅰa-11的¹H-NMR谱图；

图22为化合物Ⅰa-11的¹³C-NMR谱图；

图23为化合物Ⅰa-12的¹H-NMR谱图；

图24为化合物Ⅰa-12的¹³C-NMR谱图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。所述的化合物经高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)进行检测。随后可以采用诸如红外光谱(IR)，核磁共振谱(¹H NMR，¹³C NMR)，高分辨质谱(HRMS)等更进一步确证其结构。

实施例1：

中间体Ⅱ

在装有温度计、搅拌装置的反应瓶中加入原料(10mmol)、二氯亚砜(10mmol)和甲醇(20mL)，反应数小时，TLC显示反应完全，过滤，滤液减压浓缩后，得粗品，重结晶，得纯品，真空干燥。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:11.55(s,1H),9.43(d,J＝38.0Hz,2H),3.88(s,1H),3.73(d,J＝28.2Hz,4H),3.53–3.34(m,3H),3.21(d,J＝46.1Hz,2H),2.82(d,J＝60.2Hz,3H),2.35(d,J＝65.8Hz,4H),1.97(d,J＝45.2Hz,9H),1.70(d,J＝11.0Hz,1H),1.49(s,1H)；¹³C NMRδ:173.11,57.98,56.84,54.93,52.82,51.76,45.41,42.88,33.82,33.13,27.70,25.60,22.35,22.16,21.56,17.92；ESI-MS:C₁₆H₂₈N₂O₂(280.4)[M+H]⁺＝281.2。

实施例2：

中间体Ⅲ

在装有温度计、搅拌装置的反应瓶中加入原料磷酰氯(10mmol)、苯酚(10mmol)和二氯甲烷50mL，碳酸钾作为缚酸剂，反应数小时，TLC显示反应完全，过滤，滤液减压浓缩后，得到粗品，重结晶，得纯品，真空干燥¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(t,J＝7.5Hz,1H),7.29(d,J＝1.6Hz,1H),3.75(dd,J＝7.0,2.1Hz,2H),3.66(dd,J＝19.1,11.3Hz,2H)；¹³C NMRδ:130.08,126.25,120.47,120.42,49.88,49.84,41.46,41.44.ESI-MS:C₁₀H₁₃Cl₃NO₂P(316.5),[M+Na]⁺＝340.1

实施例3：

产物Ⅰa、Ⅰb和Ⅰc

在装有温度计、搅拌装置的反应瓶中加入中间体Ⅱ(50mmol)、中间体Ⅲ(50mmol)和二氯甲烷50mL，碳酸钾作为缚酸剂，反应数小时，TLC显示反应完全，过滤，滤液减压浓缩后，得到粗品，柱层析分离，得化合物Ⅰa。

在装有温度计、搅拌装置的反应瓶中加入中间体Ⅱ(50mmol)、中间体III(50mmol)和二氯甲烷50mL，碳酸钾作为缚酸剂，反应数小时，TLC显示反应完全，过滤，滤液减压浓缩后，得到粗品，柱层析分离，得化合物Ⅰb。

在装有温度计、搅拌装置的反应瓶中加入中间体Ⅱ(50mmol)、中间体III(50mmol)和二氯甲烷50mL，碳酸钾作为缚酸剂，反应数小时，TLC显示反应完全，过滤，滤液减压浓缩后，得到粗品，柱层析分离，得化合物Ⅰc。

以下为用本发明方法合成的部分化合物结构表征一览表：

表2化合物的结构、氢谱和碳谱

实施例4：

化合物Ⅰ‐1成盐酸盐：取化合物Ⅰ‐1白色固体产物2.0g，溶于8ml无水乙醇。冰水浴冷却至5℃，滴加11.1％盐酸乙醇溶液至pH为2，继续于冰水浴下搅拌约1h。过滤，真空干燥，得白色固体粉末。

实施例5：

化合物Ⅰ‐10成牛磺酸盐：取化合物Ⅰ‐2白色固体产物2.0g，溶于10ml无水甲醇。加热至回流后加入等摩尔牛磺酸，继续于回流下搅拌反应约1.5h。反应完毕，于室温下静置24h。析出浅黄色结晶，过滤，真空干燥。

实施例6：

化合物Ⅰ‐12成硫酸盐：取化合物Ⅰ‐5白色固体产物2.0g，溶于15ml丙酮。冰水浴冷却至0℃，滴加浓硫酸溶液至pH为3，继续于冰水浴下搅拌约1h。过滤，得白色固体。