作为JAK抑制剂的吡咯并嘧啶化合物的结晶的制作方法

本申请属于药物合成领域，具体而言，本申请涉及作为jak抑制剂的吡咯并嘧啶化合物(3r)-3-[3-氨基-4-(7h-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈(i)的结晶。
背景技术：
：蛋白激酶(proteinkinases，pk)又称蛋白质磷酸化酶(proteinphosphakinase)，是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。蛋白激酶通过催化蛋白的磷酸化从而发挥其生理学功能，包括细胞生长、存活和分化、器官形成和形态变化、新血管的生成、组织修复和再生。除了正常生理功能外，许多蛋白激酶在人类的疾病(例如癌症)中起着重要的作用。蛋白激酶的一个亚组致癌蛋白激酶在失调时可引起肿瘤的形成和生长，并进一步导致肿瘤转移和发展。迄今，致癌蛋白激酶是癌症疾病治疗最重要的靶标之一。蛋白激酶可分为受体型和非受体型。非受体型酪氨酸激酶(ptk)的亚家族中包括两面神激酶(jak)，对于非受体型酪氨酸激酶的详细情况可参见bolenjb.nonreceptortyrosineproteinkinases.oncogene.1993,8(8):2025-31。两面神激酶(januskinase，jak)是一类非受体型酪氨酸激酶(ptk)，其存在于细胞内，通过jak-stat通路传导细胞因子刺激信号。jak-stat通路将细胞外的化学信号经细胞膜传导入位于细胞核内dna上的基因启动子上，最终影响细胞中dna转录与活性水平发生改变。jak-stat通路由三个主要部分组成：1)受体；2)两面神激酶(jak)和3)信号转导和转录激活蛋白(stat)。所述受体可由干扰素、白细胞介素、生长因子或其它化学信使激活，激活导致jak自身磷酸化；接下来stat蛋白与磷酸化受体结合，使得stat被jak磷酸化；然后磷酸化stat蛋白从受体上分离、二聚并易位到细胞核中，以结合到特异性dna位点并改变转录(scott,m.j.,c.j.godshalletal.(2002).“jaks,stats,cytokines,andsepsis”clindiagnlabimmunol9(6):1153-9)。jak家族在涉及免疫应答的细胞增殖和功能性细胞因子依赖性调节中产生作用。目前，有四种已知的哺乳动物jak家族成员：jak1、jak2、jak3和tyk2(tyrosinekinase2)。jak蛋白的大小范围在120-140kda，其包含7个保守的jak同源性(jh)结构域；其中之一为功能性催化激酶结构域，而另一个为假性激酶(pseudokinase)结构域，其有效地发挥调节功能和/或作为stat的停靠位点起作用(scott,godshalletal.2002，supra)。目前，已有多种两面神激酶的抑制剂已有报道，其中申请日为2014年12月16日的申请号为201410784461.2中国专利申请中公开了多个jak抑制剂(在此全文引入作为参考)，包括如下式i所示的(3r)-3-[3-氨基-4-(7h-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈化合物：除了治疗效力外，药物研发者试图提供具有作为药物的性质的活性分子的适合形式。因此，发现具有所需性质的形式对药物研发至关重要。发明概述本申请一方面提供式i所示化合物的结晶a，以及该结晶a的制备方法，包含该结晶a的结晶组合物，包含该结晶a或其结晶组合物的药物组合物，以及它们的医药用途。本申请一方面提供式i所示化合物的结晶b，以及该结晶b的制备方法，包含该结晶b的结晶组合物，包含该结晶b或其结晶组合物的药物组合物，以及它们的医药用途。技术实现要素：本申请一方面提供了式i所示化合物的结晶a：其特征在于，在x-射线衍射(xrd)图谱中，具有2θ＝9.35°、11.93°、16.32°、21.23°、23.13°、25.58°±0.2°的衍射峰；典型地具有2θ＝9.35°、11.93°、16.32°、18.82°、20.54°、21.23°、23.13°、25.58°±0.2°的衍射峰；更典型地具有2θ＝9.35°、10.93°、11.93°、14.46°、16.32°、18.82°、20.54°、21.23°、21.66°、23.13°、25.58°、26.34°±0.2°的衍射峰；进一步典型地具有2θ＝9.35°、10.93°、11.93°、14.46°、16.32°、17.28°、18.82°、19.25°、20.54°、21.23°、21.66°、22.15°、23.13°、24.09°、25.58°、26.34°±0.2°的衍射峰。在本申请的部分实施方式中，本申请的式i所示化合物的结晶a的x-射线衍射(xrd)图谱中，相对强度最大的峰出现在2θ＝11.93°、16.32°或21.23°±0.2°的衍射峰位置；优选地，相对强度最大的峰出现在2θ＝11.93°±0.2°的衍射峰位置。在本申请的部分实施方式中，本申请的式i所示化合物的结晶a的x-射线衍射(xrd)图谱中，相对强度前三位的峰出现在2θ＝9.35°、11.93°、16.32°、21.23°、23.13或25.58±0.2°的衍射峰位置。在本申请的部分实施方式中，本申请的式i所示化合物的结晶a的x-射线衍射峰具有如下特征：序号2θ±0.2(°)相对强度(％)序号2θ±0.2(°)相对强度(％)19.3543.11120.5441.6210.8216.01221.2375.9310.9317.01321.6638.1411.93100.01422.1526.9513.6515.81523.1355.5614.4618.61623.4714.5716.3258.11724.0923.5817.2813.91825.5854.3918.8240.91926.3433.81019.2522.32030.0215.8在本申请的部分实施方式中，所述式i所示化合物的结晶a的x-射线衍射图谱如图1所示。在本申请的部分实施方式中，所述式i所示化合物的结晶a的x-射线衍射图谱如图3所示。在本申请的部分实施方式中，所述式i所示化合物的结晶a的x-射线衍射图谱如图4所示。本申请另一方面提供式i所示化合物的结晶a的制备方法，该方法包括以下步骤：1)使式i所示化合物溶于结晶溶剂中；2)析晶、过滤、洗涤、干燥。在本申请的部分实施方式中，制备式i所示化合物的结晶a的结晶溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇单甲醚、乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六环、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、二氯甲烷、氯仿、水或任意两种以上的混合溶剂；优选乙醇、异丙醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、水或任意两种以上的混合溶剂；更优选乙醇、乙醇-乙酸乙酯混合溶剂、乙醇-水混合溶剂、乙醇-异丙醚混合溶剂、丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷。在本申请的部分实施方式中，制备式i所示化合物的结晶a的结晶溶剂优选乙醇或包含乙醇的混合溶剂；更优选地，所述包含乙醇的混合溶剂中的其他溶剂选自甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇单甲醚、乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六环、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、二氯甲烷、氯仿或水。在本申请的部分实施方式中，当制备式i所示化合物的结晶a的结晶溶剂选自包含乙醇的混合溶剂时，乙醇的含量(以体积计算)为10％～90％；优选10％、20％、25％、30％、33％、40％、50％、60％、66％、70％、75％、80％或90％。在本申请的部分实施方式中，当制备式i所示化合物的结晶a的结晶溶剂选自包含乙醇的混合溶剂时，乙醇与其他溶剂比(以体积计算)为9:1～1:9；优选9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9。本申请另一方面提供了包括式i所示化合物的结晶a的结晶组合物。在本发明的部分实施方式中，式i所示化合物的结晶a占结晶组合物重量50％以上，较好的是80％以上，更好的是90％以上，最好的是95％以上。本申请的另一方面提供了包括式i所示化合物的结晶a的药物组合物，该药物组合物中包括有效量式i所示化合物的结晶a、或者包括式i所示化合物的结晶a的结晶组合物，此外，该药物组合物还可以含有或不含有药学上可接受的载体、赋形剂和/或介质。本申请的另一方面提供了式i所示化合物的结晶a或其结晶组合物或其药物组合物在制备治疗或预防两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。本申请一方面提供了式i所示化合物的结晶b：其特征在于，在x-射线衍射(xrd)图谱中，具有2θ＝8.97°、9.39°、12.90°、17.70°、20.31°、23.63°±0.2°的衍射峰；典型地具有2θ＝8.97°、9.39°、12.90°、16.54°、17.70°、19.20°、20.31°、22.78°、23.63°±0.2°的衍射峰；更典型地具有2θ＝8.97°、9.39°、11.24°、12.90°、14.56°、16.54°、17.70°、19.20°、20.31°、22.23°、22.78°、23.63°、25.55°±0.2°的衍射峰。在本申请的部分实施方式中，本申请的式i所示化合物的结晶b的x-射线衍射(xrd)图谱中，相对强度最大的峰出现在2θ＝9.39°、17.70°或23.63°±0.2°的衍射峰位置；优选地，相对强度最大的峰出现在2θ＝17.70°±0.2°的衍射峰位置。在本申请的部分实施方式中，本申请的式i所示化合物的结晶b的x-射线衍射峰具有如下特征：序号2θ±0.2(°)相对强度(％)序号2θ±0.2(°)相对强度(％)18.9740.71120.3136.129.3947.41220.4124.3311.2417.91321.0321.3412.9034.41421.9618.6512.9632.81522.2318.9614.5614.41622.7823.1716.5422.11723.5046.9817.1540.41823.6365.0917.70100.01925.5517.31019.2024.4------------在本申请的部分实施方式中，所述式i所示化合物的结晶b的x-射线衍射图谱如图5所示。本申请所述的式i所示化合物的结晶b是溶剂合物，优选是乙腈合物或丙腈合物。本申请另一方面提供式i所示化合物的结晶b的制备方法，该方法包括以下步骤：1)使式i所示化合物溶于结晶溶剂中；2)析晶、过滤、洗涤、干燥。在本申请的部分实施方式中，制备式i所示化合物的结晶b的结晶溶剂选自含有氰基的溶剂，优选乙腈、丙腈、包含乙腈的混合溶剂或包含丙腈的混合溶剂。所述包含乙腈的混合溶剂或包含丙腈的混合溶剂中的其他溶剂选自甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇单甲醚、乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六环、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、二氯甲烷、氯仿或水。在本申请的部分实施方式中，当制备式i所示化合物的结晶b的结晶溶剂选自包含乙腈的混合溶剂或包含丙腈的混合溶剂时，乙腈或丙腈的含量(以体积计算)为10％～90％，优选10％、20％、25％、30％、33％、40％、50％、60％、66％、70％、75％、80％或90％。在本申请的部分实施方式中，当制备式i所示化合物的结晶b的结晶溶剂选自包含乙腈的混合溶剂或包含丙腈的混合溶剂时，乙腈或丙腈与其他溶剂比(以体积计算)为9:1～1:9，优选9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9。本申请另一方面提供了包括式i所示化合物的结晶b的结晶组合物。在本发明的部分实施方式中，式i所示化合物的结晶b占结晶组合物重量50％以上，较好的是80％以上，更好的是90％以上，最好的是95％以上。本申请的另一方面提供了包括式i所示化合物的结晶b的药物组合物，该药物组合物中包括有效量式i所示化合物的结晶b、或者包括式i所示化合物的结晶b的结晶组合物，此外，该药物组合物还可以含有或不含有药学上可接受的载体、赋形剂和/或介质。本申请的另一方面提供了式i所示化合物的结晶b或其结晶组合物或其药物组合物在制备治疗或预防两面神激酶介导的疾病的药物中的用途。本申请中，x-射线衍射图谱采用下述方法测定：仪器：brukerd8advancex-射线衍射仪；方法：靶:cu:k-alpha；波长管压voltage:40kv；管流current：40ma；扫描范围：4～40°；扫描速度：每步0.1秒，每步0.02°。本申请中，差示扫描量热分析(dsc)采用下述方法测定：仪器：梅特勒dsc-1差示扫描量热仪；方法：取样品(～5mg)置于dsc铝锅内进行测试，方法为：30℃-300℃，升温速率10℃/min。需要说明的是，在x-射线衍射光谱中，由结晶化合物得到的衍射谱图对于特定的晶型往往是特征性的，其中谱带(尤其是在低角度)的相对强度可能会因为结晶条件、粒径和其它测定条件的差异而产生的优势取向效果而变化。因此，衍射峰的相对强度对所针对的晶型并非是特征性的，判断是否与已知的晶型相同时，更应该注意的是峰的相对位置而不是它们的相对强度。此外，对任何给定的晶型而言，峰的位置可能存在轻微误差，这在晶体学领域中也是公知的。例如，由于分析样品时温度的变化、样品移动、或仪器的标定等，峰的位置可以移动，2θ值的测定误差有时约为±0.2°。因此，在确定每种晶型结构时，应该将此误差考虑在内。在xrd图谱中通常用2θ角或晶面距d表示峰位置，两者之间具有简单的换算关系：d＝λ/2sinθ，其中d代表晶面距，λ表入射x射线的波长，θ为衍射角。对于同种化合物的同种晶型，其xrd谱的峰位置在整体上具有相似性，相对强度误差可能较大。还应指出的是，在混合物的鉴定中，由于含量下降等因素会造成部分衍射线的缺失，此时，无需依赖高纯试样中观察到的全部谱带，甚至一条谱带也可能对给定的晶体是特征性的。需要说明的是，dsc测定当晶体由于其晶体结构发生变化或晶体熔融而吸收或释放热时的转变温度。对于同种化合物的同种晶型，在连续的分析中，热转变温度和熔点误差典型的在约5℃之内，当我们说一个化合物具有某一给定的dsc峰或熔点时，这是指该dsc峰或熔点±5℃。dsc提供了一种辨别不同晶型的辅助方法。不同的晶体形态可根据其不同的转变温度特征而加以识别。本发明中，术语“药物组合物”是指一种或多种本发明的化合物与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体，例如人，的载体、赋形剂和/或介质的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本发明的化合物。本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。反应一般是在惰性氮气下、无水溶剂中进行的。本发明化合物经手工或者软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。在本申请中，质子核磁共振数据记录在brukeravanceⅲhd500m分光仪上，化学位移以四甲基硅烷低场处的(ppm)表示；质谱是在watersacquityuplc+xevog2qtof测定。质谱仪配备有一个正或负模式下操作的电喷雾离子源(esi)。本发明提供的式i所示化合物的结晶a和结晶b具有纯度高、结晶度高、稳定性好等优点；同时，本发明提供的式i所示化合物结晶a和结晶b的制备方法简单，溶剂价廉易得，结晶条件温和，适合工业化生产。附图说明图1式i所示化合物的结晶a(实施例2方法1)的xrd图谱。图2式i所示化合物的结晶a(实施例2方法1)的dsc图谱。图3式i所示化合物的结晶a(实施例2方法2，乙醇-乙酸乙酯(4:1)的xrd图谱。图4式i所示化合物的结晶a(实施例2方法3)的xrd图谱。图5式i所示化合物的结晶b的xrd图谱。图6式i所示化合物的结晶b的dsc图谱。具体实施方式以下实施例对本发明技术方案作进一步非限制性的详细说明。它们不应该被认为是对本发明范围的限制，而只是本发明的示例性说明和典型代表。本发明中使用的溶剂、试剂和原料等均为市售化学纯或分析纯产品。实施例1(3r)-3-{3-氨基-4-{7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}-3-环戊基丙腈(i)步骤a：3-环戊基丙烯酸室温下，向盛有5m丙二酸(312g，3.0mol，1.0eq.)吡啶溶液中滴加环戊基甲醛(344.4g，3.51mol，1.17eq.)，加毕搅拌10分钟，缓慢滴加哌啶(6.2g，0.075mol，0.025eq.)，加毕室温下搅拌反应1小时。升温至70～80℃搅拌反应8小时，减压浓缩蒸去溶剂，余物浓盐酸调ph至3.0，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，2.5m氢氧化钠溶液洗涤五次，水层浓盐酸调ph至3.0，乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，水洗三次，饱和食盐水洗，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得3-环戊基丙烯酸(391.2g，收率：93％)。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ：7.08(dd,j＝15.6,8.1hz,1h)、5.81(dd,j＝15.6,1.1hz,1h)、11.25(s,1h)、2.64(m,1h)、1.63(m,2h)、1.42(m,2h)、1.86(m,2h)、1.72(m，2h)；hrms(esi)calcd.forc8h12o2[m-h]-139.0765；found：139.0760。步骤b：5-环戊基吡唑烷-3-酮室温搅拌下，80％水合肼(253.5g，4.05mol，1.5eq.)滴加至环戊基丙烯酸(378g，2.7mol，1.0eq.)中，升温至70～80℃搅拌反应6小时，降温至0～10℃搅拌析晶，过滤，滤饼水洗两次，45℃鼓风干燥12小时得5-环戊基吡唑烷-3-酮(292.5g，68％收率)。步骤c：r-5-环戊基吡唑烷-3-酮-d-酒石酸盐室温搅拌下，d-酒石酸(135g，0.9mol，0.5eq.)加入到5-环戊基吡唑烷-3-酮(278g，1.8mol，1.0eq.)丙酮溶液中，搅拌反应2小时后析晶，过滤，滤饼丙酮打浆5次，50℃鼓风干燥得r-5-环戊基吡唑烷-3-酮-d-酒石酸盐(241g，88％收率，99.5％ee值)。步骤d：r-5-环戊基吡唑烷-3-酮室温搅拌下，r-5-环戊基吡唑烷-3-酮-d-酒石酸盐(228g，0.75mol，1.0eq.)加入到4m氢氧化钠(52.2g，2.61mol，1.74eq.)溶液中，二氯甲烷萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得r-5-环戊基吡唑烷-3-酮(100.6g，85.2％收率，99.5％ee值)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)δ8.93(s,1h)、5.15(s,1h)、1.89(m,1h)、1.67(m,2h)、1.55(m,2h)、1.47(m,2h)、1.26(m,1h)、1.14(m,1h)；hrms(esi)calcd.forc8h14n2o[m+h]+155.1179；found：155.1183。步骤e：4-氯-7-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶冰浴下向4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶(200g，1.3mol，1.0eq.)n,n-二甲基甲酰胺溶液中加入60％nah(62.4g，1.56mol，1.2eq.)，加毕室温下搅拌反应1小时，冰浴冷却下缓慢滴加2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基氯(semcl，260g，1.56mol，1.2eq)。加毕，冰浴下搅拌反应1小时，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得余物，硅胶柱层析纯化得4-氯-7-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(312.2g，91.8％收率)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ8.64(s,1h)、7.38(d,j＝3.6hz,1h)、6.65(d,j＝3.6hz,1h)、5.64(s,2h)、3.52(t,j＝8.2hz,2h)、0.90(t,j＝8.2hz,2h)、-0.07(s,9h)；hrms(esi)calcd.forc12h18n3osi[m+h]+284.0980；found：284.0995。步骤f：2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯室温搅拌下，碳酸钾(207g，1.5mol，3.0eq.)加入到4-氯-7-{[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶(142g，0.5mol，1.0eq.)和氰基乙酸乙酯(85g，0.75mol，1.5eq)dmf溶液中，升温至120℃搅拌反应4小时，降至室温，加水淬灭，搅拌析晶，过滤，滤饼水洗50℃鼓风干燥得2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯(167g，92.6％收率)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ13.46(s,1h)、8.45(s,1h)、7.56(d,j＝3.6hz,1h)、7.18(d,j＝3.6hz,1h)、5.56(s,2h)、4.32(q,j＝7.1hz,2h)、3.52(t,j＝8.2hz,2h)、1.27(t,j＝7.1hz,3h)、0.83(t,j＝8.2hz,2h)、-0.08(s,9h)；hrms(esi)calcd.forc17h24n4o3si[m+h]+361.1690；found：361.1699。步骤g：2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}乙腈室温下搅拌下，氯化钠(263g，4.5mol，10eq.)加入到2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯(162.2g，0.45mol，1.0eq.)n-甲基吡咯烷酮和水的混合溶液中，升温至160～170℃搅拌反应30小时。加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机层饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩所得余物，硅胶柱层析纯化得2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)乙腈(98.6g，76％收率)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ8.18(s,1h)、7.77(d,j＝3.4hz,1h)、6.83(d,j＝3.4hz,1h)、5.65(s,2h)、4.56(s,2h)、3.52(t,j＝7.6hz,2h)、0.82(t,j＝7.6hz,2h)、-0.10(s,9h)；hrms(esi)calcd.forc14h20n4osi[m+h]+289.1479；found：289.1498。步骤h：3-(二甲氨基)-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}丙烯腈dmf-dma(119g，1.0mol，3.0eq.)加入到2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}乙腈(95g，0.33mol，1.0eq.)dmf溶液中，升温至回流反应2小时，降至室温，加水搅拌析晶，过滤，滤饼水洗，50℃鼓风干燥，得3-(二甲氨基)-2-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)丙烯腈(106.5g，94％收率)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ8.50(s,1h)、8.38(s,1h)、7.26(d,j＝3.7hz,1h)、7.18(d,j＝3.7hz,1h)、5.56(s,2h)、3.49(t,j＝8.4hz,2h)、3.43(s,3h)、3.23(s,3h)、0.87(t,j＝8.4hz,2h)、-0.10(s,9h)；；hrms(esi)calcd.forc17h25n5osi[m+h]+344.1901；found：344.1907。步骤i：(r)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸室温搅拌下，乙酸钾(1.5eq)加入到3-(二甲氨基)-2-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}丙烯腈(68.7g，0.2mol，1.0eq.)和r-5-环戊基吡唑烷-3-酮(37.0g，0.24mol，1.2eq.)n-甲基吡咯烷酮溶液中，升温至120～130℃搅拌反应12小时。加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机层水洗三次，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得余物经硅胶柱层析纯化，得(r)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸(37.6g，40.1％收率，ee值99.8％)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ8.74(s,1h)、7.96(s,1h)、7.32(d,j＝3.4hz,1h)、6.67(d,j＝3.4hz,1h)、5.63(m,2h)、4.19(t,j＝8.2hz,2h)、3.52(m,1h)、3.52(t,j＝8.4hz,2h)、3.09(dd,j＝16.7,8.2hz,1h)、2.87(d,j＝16.7hz,1h)、2.41(m,1h)、1.87(m,1h)、1.69(m,1h)、1.60(m,2h)、1.51(m,2h)、1.15(m,1h)、0.91(t,j＝8.4hz,2h)、-0.06(s,9h)；hrms(esi)calcd.forc17h25n5osi[m+h]+471.2534；found：471.2538。步骤j：(r)-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸室温搅拌下，向0.2m(r)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]-1h-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸(35.0g，74.3mmol，1.0eq.)甲苯溶液中加入丁二酸酐(10.4g，104mmol，1.4eq.)，氮气保护下升温至回流反应(分水)14小时。减压浓缩蒸去溶剂，余物中加入乙酸乙酯溶解，水洗，饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，乙酸乙酯层加入无水硫酸钠及活性炭搅拌干燥脱色，过滤，减压浓缩得(r)-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸(39g，70.6mmol，95％收率)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ8.65(s,1h)、8.28(s,1h)、7.28(d,j＝3.7hz,1h)、6.62(d,j＝3.7hz,1h)、5.59(d,j＝11.1hz,1h)、5.53(d,j＝11.1hz,1h)、4.44(td,j＝9.9,3.2hz,1h)、3.48(m,2h)、3.02(dd,j＝16.8,10.0hz,1h)、2.83(m,1h)、2.43(m,1h)、1.78(m,1h)、1.69(m,1h)、1.61(m,1h)、1.52(m,1h)、1.51(m,1h)、1.50(m,2h)、1.14(m,1h)、0.88(m,2h)、-0.07(s,9h)；hrms(esi)calcd.forc27h36n6o5si[m+h]+553.2589；found：553.2603。步骤k：(r)-3-环戊基-3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]丙酰胺冰浴，氮气保护搅拌下，向0.18m(r)-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}-3-环戊基丙酸(35.0g，63.3mmol，1.0eq.)二氯甲烷溶液中滴加草酰氯(20.0g，158mmol，2.5eq.)，加毕，滴加dmf(0.1g，1.3mmol，0.02eq.)，室温下搅拌反应1小时，减压浓缩蒸去溶剂，加入钠丝干燥重蒸thf溶解，滴加至2m氨水(20.0，0.32mol，5.0eq.)thf溶液中，冰浴下搅拌反应30分钟，减压浓缩蒸去thf，冰浴降温析晶2小时，过滤，滤饼水洗，50℃鼓风干燥得(r)-3-环戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}丙酰胺(29.8g，85.5％收率)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ8.65(s,1h)、8.24(s,1h)、7.32(d,j＝3.7hz,1h)、6.63(d,j＝3.7,1h)、6.12(s,1h)、5.60(d,j＝11.1hz,1h)、5.56(d,j＝11.1hz,1h)、5.44(s,1h)、4.40(td,j＝10.6,3.2hz,1h)、3.47(dd,j＝9.1,7.5hz,2h)、2.99(dd,j＝14.4,11.0hz,1h)、2.91(s,4h)、2.67(dd,j＝14.4,3.3hz,1h)、2.48(m,1h)、1.84(m,1h)、1.66(m,1h)、1.58(m,2h)、1.57(m,1h)、1.50(m,1h)、1.31(m,1h)、1.21(m,1h)、0.88(dd,9.1,7.5,2h)、-0.08(s,9h)；；hrms(es)calcd.forc27h37n7o4si[m+h]+552.2749；found：552.2759。步骤l：(r)-3-环戊基-3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]丙腈冰浴搅拌下向，0.2m(r)-3-环戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}丙酰胺(25g，45.3mmol，1.0eq)二氯甲烷溶液中滴加三氯氧磷(27.8g，181mmol，4.0eq.)，加毕室温下搅拌反应2小时，加水淬灭，有机层水洗，加入无水硫酸镁及活性炭搅拌干燥、脱色。过滤，减压浓缩除去溶剂得(r)-3-环戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}丙腈(22.2g，41.7mmol，92％收率)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ8.70(s,1h)、8.35(s,1h)、7.35(d,j＝3.7hz,1h)、6.66(d,j＝3.7hz,1h)、5.62(d,j＝10.8hz,1h)、5.58(d,j＝10.8hz,1h)、4.30(m,1h)、3.50(m,2h)、3.09(dd,j＝16.8,4.3hz,1h)、3.01(dd,j＝16.8,4.3hz,1h)、2.94(s,4h)、2.62(m,1h)、1.96(m,1h)、1.69(m,2h)、1.60(m,1h)、1.58(m,2h)、1.27(m,2h)、0.90(t,j＝8.3hz,2h)、-0.06(s,9h)；hrms(esi)calcd.forc27h35n7o3si[m+h]+534.2643；found：534.2657。步骤m：(r)-3-环戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{(7-羟甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}丙腈冰浴搅拌下，向0.2m(r)-3-环戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}丙腈(20g，37.5mmol，1.0eq.)二氯甲烷溶液中滴加47％三氟化硼乙醚溶液(34g，112.5mmol，3.0eq.)，加毕室温搅拌反应4小时。加水淬灭，10％naoh溶液调ph至6～7，乙酸乙酯萃取，有机层水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁搅拌干燥。过滤，减压浓缩得(r)-3-环戊基-3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-羟甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]丙腈(14.4g，88.5％收率)1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ8.54(s,1h)、8.31(s,1h)、7.31(d,j＝3.7hz,1h)、6.52(d,j＝3.7hz,1h)、5.68(d,j＝10.9hz,1h)、5.61(d,j＝10.9hz,1h)、4.32(m,1h)、3.13(dd,j＝17.2,7.9hz,1h)、3.03(dd,j＝17.2,4.3hz,1h)、2.94(s,4h)、2.62(m,1h)、1.98(m,1h)、1.74(m,1h)、1.65(m,1h)、1.64(m,2h)、1.30(m,1h)、1.29(m,2h)；hrms(esi)calcd.forc22h23n7o3[m+h]+434.1935；found：434.1944。步骤n：(r)-3-[3-氨基-4-(7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈(i)室温搅拌下，向0.2m(r)-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{(7-羟甲基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-1h-吡唑-1-基}-3-环戊基丙腈(12g，27.7mmol，1.0eq.)甲醇溶液中滴加80％水合肼(8.7g，138mmol，5.0eq.)，加毕升温至回流反应8小时，减压浓缩蒸去溶剂，余物乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥过夜。过滤，减压浓缩得(r)-3-[3-氨基-4-(7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]-3-环戊基丙腈(i)(7.7g，收率87％,ee值99.8％)。1h-nmr(500mhz,cdcl3)：δ11.73(s,1h)、8.79(s,1h)、8.06(s,1h)、7.32(d,j＝3.5hz,1h)、6.62(d,j＝3.5hz,1h)、5.03(s,2h)、4.05(td,j＝9.5,3.5hz,1h)、3.12(dd,j＝17.1,8.9hz,1h)、2.91(dd,j＝17.1,3.6hz,1h)、2.54(m,1h)、1.74(m,1h)、1.63(m,4h)、1.27(m,1h)、1.26(m,2h)；hrms(esi)calcd.forc17h19n7[m+h]+322.1775；found：322.1783。实施例2式i化合物结晶a方法1取实施例1得到的式i化合物2.0g，加入24ml无水乙醇升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2ml无水乙醇淋洗，50℃减压干燥得产物1.62g，81％收率。方法2取实施例1得到的式i化合物2.0g共4份，分别加入20ml无水乙醇-乙酸乙酯(4:1、2:1、1:1、1:4)混合溶剂升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2ml乙酸乙酯淋洗，50℃减压干燥得产物1.34g、1.06g、1.00g、1.60g，收率67％、53％、50％、80％。方法3取实施例1得到的式i化合物2.0g，加入20ml无水乙醇-水(4:1)混合溶液升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2ml无水乙醇淋洗，50℃减压干燥得产物1.6g，80％收率。方法4取实施例1得到的式i化合物2.0g，加入15ml丙酮升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2ml丙酮淋洗，50℃减压干燥得产物1.22g，61％收率。方法5取实施例1得到的式i化合物2.0g，加入50ml乙酸乙酯升温至回流溶清，减压浓缩蒸去溶剂得产物1.98g，99％收率。方法6取实施例1得到的式i化合物2.0g，加入60ml二氯甲烷升温至回流溶清，减压浓缩蒸去溶剂得产物2.0g，100％收率。方法7取实施例1得到的式i化合物2.0g，加入24ml无水乙醇升温至回流溶清，滴加异丙醚120ml，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2ml异丙醚淋洗，50℃减压干燥得产物1.56g，78％收率。式i化合物结晶a的典型的xrd图谱和dsc图谱分别如图1和图2所示。式i化合物结晶a的另一典型的xrd图谱如图3所示。式i化合物结晶a的又一典型的xrd图谱如图4所示。实施例3式i化合物结晶b取实施例1得到的式i化合物2.0g，加入25ml乙腈升温至回流溶清，降温至0-5℃搅拌析晶4小时，过滤，滤饼2ml乙腈淋洗，50℃减压干燥得产物1.82g，91％收率。式i化合物结晶b是其乙腈合物，其典型的xrd图谱和dsc图谱分别如图5和图6所示。实施例4稳定性实验将实施例2方法1得到的结晶a和实施例3得到的结晶b置于开口洁净容器中，60℃下放置，分别于第5和10天取样检测，检测结果与第0天的初始检测结果进行比较，试验结果见下表所示：实施例5生物活性实验1.化合物酶学活性(ic50)检测采取匀相时间分辨荧光(htrf)方法建立了jak2(野生型)的激酶活性检测平台，进行化合物活性的测定。将化合物从1mm开始用100％dmso进行3倍的梯度稀释(共11个浓度)，每个浓度取4μl加入到96μl的反应缓冲液中(50mmhepes,ph7.4,10mmmgcl2,1mmegta,0.01％tween-20,0.005％bas,2mmdtt)混匀，然后取2.5μl加入到384孔板(optiplate-384,购买于perkinelmer)，然后加入5μl的jak2激酶(购买于carna)，离心混匀，再加入2.5μl的atp(终浓度为相应的km值)与tkpeptide(kineasetm-tk,购买于cisbio)混合物启动反应(总反应体积为10μl)。将384孔板放于孵育箱中23℃反应120分钟，然后加入5μl的eu3+cryptate-labledanti-phosphotyrosineantibody(购买于cisbio)，5μl的streptavidin-xl-665(kineasetm-tk,购买于cisbio)停止反应。在孵育箱中孵育1小时后，在envision(购买于perkinelmer)上读取荧光值(320nm激发，检测665nm与620nm的发射光，二者比值为酶活性)。在11个浓度下测定酶的活性，使用grafit6.0软件(erithacussoftware)计算数据，得到式i化合物的ic50值。结果可知，式i化合物和对照ruxolitinib的ic50值都＜20nm。2.在小鼠皮下异种移植瘤模型中有效性的测定spf级balb/c裸鼠，雌性，5-6周龄。将无血清培养基混悬的ba/f3-jak2v617f细胞悬液0.1ml(含1×107cells，50％matrigel)皮下注射于每只小鼠右侧面。待平均肿瘤体积达到约500mm3时，处死荷瘤鼠，无菌摘取肿瘤组织，剪成小块，植入balb/c裸鼠左右两侧皮下，待平均肿瘤体积达到约100mm3时，将各鼠按流水号标记，分别测量其肿瘤大小及体重，按肿瘤体积从小到大随机分组，并适当调整使各组动物的平均体重亦处于同一水平。5组分别为阴性对照组、阳性对照组、低、中及高剂量组，每组5只小鼠，分组当天开始给药，每天给药2次，连续给药14天，期间每周测量肿瘤体积及体重2次。实验结束时处死小鼠，分离脾脏并称重。试验过程中测量肿瘤最长径(l)和垂直方向的最大横径(w)，计算肿瘤体积(v)，v(mm3)＝l×w2/2。肿瘤生长抑制率tgi(％)＝100％×(1-(tt-t0)/(vt-v0))，tt为治疗组每次测量的平均肿瘤体积，t0治疗组分组时的平均肿瘤体积，vt为对照组每次测量的平均肿瘤体积，v0为对照组分组时的平均肿瘤体积。结果如下表所示：由表中数据可见，在ba/f3-jak2v617f荷瘤小鼠模型中，测定了式i化合物的盐酸盐在动物体内的肿瘤抑制效果，发现其对ba/f3-jak2v617f肿瘤生长呈现剂量依赖性的抑制作用，抑瘤效果非常显著。口服每天两次给药式i化合物的盐酸盐(100mg/kg)14天之后，对肿瘤生长的抑制率(tgi)达到85.8％，而同等条件下的阳性对照品ruxolitinib(100mg/kg)对肿瘤生长的抑制率(tgi)仅为64.5％。50mg/kg的式i化合物的盐酸盐肿瘤抑制效果也很明显，tgi达到68.4％，与100mg/kg的阳性对照品ruxolitinib的肿瘤抑制效果相当。3.成年雄性/雌性sd大鼠中药代动力学的测定健康成年雌性sd大鼠来源于北京维通利华实验动物技术有限公司，将大鼠分2组，每组3只，分别口服单次灌胃给予待测样品混悬液(30mg/kg)。动物在实验前禁食过夜，禁食时间从给药前10小时至给药后4小时。给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、和24小时采血。使用小动物麻醉机经异氟烷麻醉后通过眼底静脉丛采取0.4ml全血，放于肝素抗凝管中，样品于4℃、4200rpm离心5min，血浆转移至离心管中，并放于-80℃保存直到分析。血浆中样品使用蛋白质沉淀法萃取，萃取液通过lc/ms/ms分析。附注：a.数据来自于美国食品药品监督管理局fda公开的药理学综述。大鼠(30mg/kgpo)的pk显示，式i化合物的数据优于ruxolitinib。4.成年比格犬中药代动力学的测定研究使用4只健康成年比格犬，来源于北京玛斯生物技术有限公司。研究分为两次：第一次，动物(雌雄各2只)单次静脉注射给药，剂量为5mg/kg；第二次，一周后同一组动物(雌雄各2只)单次灌胃给药，剂量为10mg/kg。灌胃给药的动物在实验前禁食过夜，禁食时间从给药前10小时至给药后4小时。静脉给药组的动物无食物限制。静脉给药组在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时采血；灌胃给药组在给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时采血。动物通过异氟烷浅麻醉，用玻璃采血管于眼眶静脉丛采血约0.4ml全血，放于肝素抗凝管中，样品于4℃、4200rpm离心5min，血浆转移至离心管中，并放于-80℃保存直到分析。血浆中样品使用蛋白质沉淀法萃取，萃取液通过lc/ms/ms分析。附注：a.数据来自于美国食品药品监督管理局fda公开的药理学综述。狗(10mg/kgpo,5mg/kgiv)的pk显示，式i化合物iv给药后auc与阳性对照ruxolitinib相当，但口服给药的生物利用度更优(114％vs57％)。当前第1页12