一种利用木质素降解菌合成生物塑料前体聚羟基脂肪酸酯的方法与流程

本发明属于微生物制备聚羟基脂肪酸酯的技术领域，涉及一株木质素降解细菌的用途，具体涉及一种利用木质素降解菌合成生物塑料前体—聚羟基脂肪酸酯的方法。

背景技术：

石油化工类塑料已成为人类应用最多的一种材料。2010年，全球塑料生产量达到近3×10⁸t，预计2050年将达到近4×10⁸t。然而，国际石油储量却在逐年降低，同时石油化工类塑料的环境污染逐渐加重。因此，开发新型石油化工类塑料的替代品刻不容缓。聚羟基脂肪酸酯具有与传统塑料相似的力学性能，可被微生物等完全降解进入自然界生态循环，被认为是重要的石油化工类塑料的替代品。聚羟基脂肪酸酯还具有多变性、压电性能、热塑性、生物可降解性、良好的生物相容性等特点，使其在生物降解材料、日用化工、医药、农业等诸多领域都具有很好的应用前景。值得一提的是，聚羟基脂肪酸酯是唯一一个完全由微生物合成的天然高分子基材料。因此，聚羟基脂肪酸酯的微生物制备方法引起了世界科学界和产业界的广泛关注。然而，微生物发酵制备聚羟基脂肪酸酯的大规模工业化生产还未能实现，当前的生产能力远满足不了巨大的市场需求，其原因在于微生物合成聚羟基脂肪酸酯的生产成本比用化学法合成石油化工类塑料高得多。研究表明，聚羟基脂肪酸酯生产工艺中，含碳原料费用>40％，因此降低碳源及其预处理成本是实现聚羟基脂肪酸酯工业化和产业化的当务之急。

木质素是一种自然界中广泛存在的芳香性高聚物，也是造纸工业废水主要成分，目前国内外正在不断开发木质素降解及再利用技术。已有研究表明微生物以芳香族为碳源合成的聚羟基脂肪酸酯具有较好的热稳定性。通常，微生物利用木质素作为碳源时，培养基中需要添加共基质(如葡萄糖)以促进细菌生长和提高酶活性。然而，共基质的存在会增加水中有机物的含量，且不利于后续聚羟基脂肪酸酯的提纯和分离。目前，国内外尚无能够以木质素为单一碳源进行降解，同时形成聚羟基脂肪酸酯的微生物。本发明利用从被微生物腐蚀的三国吴简浸泡液中分离得到的一株木质素降解菌(Cupriavidus basilensis B-8)CGMCC No.4240则实现了这一目标。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用木质素降解菌简单、高效合成生物塑料前体—聚羟基脂肪酸酯的方法。

为实现上述目的,本发明是通过以下方式实现的：一株木质素降解细菌的用途，所述的木质素降解细菌(Cupriavidus basilensis B-8)的保藏编号为CGMCC No.4240，用于生产聚羟基脂肪酸酯。生产时用的培养基采用碱木质素作为唯一碳源。碱木质素碳源无需任何预处理。碱木质素浓度为1～6g/L。氮源浓度低于60mg/L。具体的培养基配方为碱木质素1～6g，(NH₄)₂SO₄ 0.28g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaCl₂ 0.1g，FeSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.4。

具体操作是在试管中加入5mL的LB培养基，接入Cupriavidus basilensis B-8菌株的单菌落，30℃和150rpm条件下培养生长，直至细菌在600nm处的光密度达到1.0；将培养物离心、冲洗，再接种至含有100mL生产时用的培养基的三角瓶中，30℃和150rpm条件下振荡培养48h。形成的聚羟基脂肪酸酯为聚羟基丁酸的均聚物。

本发明提供的木质素降解菌为从被微生物腐蚀的三国吴简浸泡液中分离得到的Cupriavidus basilensis B-8。

根据菌落菌体形态特征和基于细菌16S rDNA基因序列的系统发育分析，将该菌鉴定为Crpriavidus菌，命名为Curpriavidus sp.。该菌已于2010年10月22日保藏在地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.4240。该菌可直接利用为经过任何物化处理的碱木质素作为碳源。

发明人根据湖南长沙简牍博物馆收藏的一批走马楼出土的三国时期吴国竹简，在出土后保存过程中，爆发了竹简蚀斑病，竹简竹体被微生物侵蚀，其中的木质素、纤维素被某种或某群微生物所降解，蚀斑中的竹简竹体变为半透明膜状物质，并且容易破裂脱落，从该批竹简的浸泡液中分离筛选出本发明菌株。

本发明菌株的分离、纯化和筛选过程为：

将长沙简牍博物馆密封保藏的竹简浸泡液分别接种丰富培养基进行富集培养。培养物以稀释平板法结合划线分离法在相应的固体平板上进行分离，直至获得各种微生物的纯培养。培养温度为30℃。将分离得到的菌株纯培养接种到以木质素为唯一碳源的固定平板筛选培养基上，放入生化培养箱中在30℃下恒温静置培养，每天观察，根据平板上菌株的生长情况，再划线分离得到最终的纯培养菌株。

所述的丰富培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.4。

所述的唯一碳源培养基组成为碱木质素3g，(NH₄)₂SO₄ 0.28g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄0.2g，CaCl₂ 0.1g，FeSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.4。

本发明利用分离筛选的Cupriavidus basilensis B-8菌以碱木质素为唯一碳源生产聚羟基脂肪酸酯，即将Cupriavidus basilensis B-8菌在以碱木质素为唯一碳源的培养基中进行发酵。其中，碱木质素浓度为1～6g/L，氮源浓度低于60mg/L。

所述的唯一碳源培养基为碱木质素1～6g，(NH₄)₂SO₄ 0.28g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄0.2g，CaCl₂ 0.1g，FeSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.4。

本发明以木质素降解菌Cupriavidus basilensis B-8为生产菌株，利用碱木质素作为唯一碳源合成聚羟基脂肪酸酯，且无需对木质素碳源进行任何预处理。本发明方法极大的降低了聚羟基脂肪酸酯生产的碳源及其预处理成本，且发酵条件和过程简单，为聚羟基脂肪酸酯的工业化和产业化提供了新思路。

附图说明

图1：Cupriavidus basilensis B-8形成的聚羟基脂肪酸酯荧光显微镜图；

图2：Cupriavidus basilensis B-8形成的聚羟基脂肪酸酯气质联用谱图；

图3：Cupriavidus basilensis B-8形成的白色聚羟基脂肪酸酯数码照片图；

图4：不同碱木质素培养基浓度所得细胞干重和聚羟基脂肪酸酯产量。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非对本发明的限制。

实施例1

在L-试管中，加入5mL的LB培养基，接入Cupriavidus basilensis B-8菌株的单菌落，30℃和150rpm条件下培养生长，直至细菌在600nm处的光密度达到1.0。将前培养物离心、冲洗，再接种至含有100mL不同浓度碱木质素培养基(1～6g/L)的三角瓶中，30℃和150rpm条件下振荡培养48h。其中，培养基配制方法：碱木质素1～6g，(NH₄)₂SO₄ 0.28g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaCl₂ 0.1g，FeSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.02g，KH₂PO₄ 1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0～7.4。

收集2mL样品，弃上清液，并将细胞重新悬浮于150μL的去离子水和50μL的二甲亚砜中。将5μL的Nile Red(0.15mg/mL)加入悬浮液中染色30min。然后用荧光显微镜进行观察，结果附图1所示，证实在细菌细胞中形成了聚羟基脂肪酸酯的内含体。

发酵结束后，菌体在12000rpm无菌离心15min，用去离子水冲洗两次，再冷冻干燥48h。然后用氯仿法提纯分离PHA，将提纯后的PHA(0.5～2mg)置于2mL含15％硫酸和2mL氯仿的甲醇溶液中，100℃下甲醇化4h。然后用气-质联用检测确定聚合物为聚-3-羟基丁酸(PHB)的均聚物(如图2所示)，单体组成和含量分别为98.3mol％的S-3-羟基丁酸(S3HB)、1.3mol％的R-3-羟基丁酸(R3HB)和0.4mol％的3-羟基丁酸(3HB)。提纯后的白色PHB产物如附图3所示。此外，不同浓度碱木质素浓度培养基所得细胞干重和PHB产率如附图4所示，可见所有浓度条件下PHB的含量约为细胞干重的15.5～18.5％。当碱木质素培养基浓度为5g/L时，细菌浓度可达到最大值735.6mg/L，此时PHB的体积产率为0.128g/L。