本发明涉及烟用香料技术领域，具体是一种葫芦巴酶促增香制备挥发油的方法及其应用。
背景技术：
再造烟叶，主要由烟末、碎片、烟梗或低次烟叶加入胶粘剂和其他添加剂等组成，存在杂气重、刺激性大和口感不适等吸味缺陷，影响了在卷烟产品中的使用效果和添加量。通常采用添加剂的办法来进行改善，目前应用较多的添加剂是烟草、天然植物类提取物或挥发油等，这些提取物一般通过水、醇提取、水蒸气蒸馏或分子蒸馏得到，添加后对卷烟质量的改善程度有限，仍有刺激性大、杂气多、香气不足等缺陷。
葫芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)为一种药食两用植物，葫芦巴籽及葫芦巴草都具有特殊的风味。食品、烟草工业中，葫芦巴籽去杂，破碎后用水蒸气蒸馏或用超临界二氧化碳抽提即得葫芦巴油。产品具有令人愉快的焦糖样烤香，微甜微苦味。常用于配制可可、咖啡、坚果、枫槭和焦糖香韵中。目前现有技术制备葫芦巴挥发油工艺在不同程度上存在着香气损失，葫芦巴挥发油中致香物质的含量偏低，应用在卷烟中烟气的香气质和量较差等问题。
天然植物性香料中部分发香物质的发香基团往往容易与植物细胞中的其他成分如低分子的糖类等以化学键合的形式相结合，从而抑制了香味的散发并难以被提取，在香料科学领域内将该类物质称为“香味前驱体”。这些物质本身并无香味且不挥发，但若选择合适的酶进行水解后，可释放出浓郁的具有天然特征香味的物质。β-葡萄糖苷酶能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。此外，β-葡萄糖苷酶能将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，还能降解或协同降解纤维素。
现有技术中，以葫芦巴为原料，β-葡萄糖苷酶发酵增香再水蒸气蒸馏制备葫芦巴挥发油，提高葫芦巴挥发油的香气品质，并在再造烟叶中加香应用，改善烟气的香气质、降低刺激、减少杂气，尚未见报道。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种葫芦巴酶促增香制备挥发油的方法，其采用超声破碎、β-葡萄糖苷酶发酵预处理、水蒸气蒸馏制备葫芦巴挥发油的制备方法，使葫芦巴中的难以挥发的香味前体物和其他如纤维素等大分子物质，经酶的作用产生降解、分解、转化生成丰富的、小分子的香气物质，而增加刺激感和杂气的物质含量减少甚至消失，提高葫芦巴挥发油的香气质；以及该酶促增香葫芦巴挥发油在再造烟叶中应用，增加焦糖样烤香、提调烟香，降低刺激、减少杂气等。
本发明提供一种葫芦巴酶促增香制备挥发油的方法，包括以下步骤：
(1)超声破碎预处理：将葫芦巴粗粉与水按质量比1:10～40混合，45～60℃条件下，超声破碎5～25min得到葫芦巴粗粉超声破碎液；
(2)酶促增香预处理：将上述步骤(1)所得葫芦巴粗粉超声破碎液，调pH至4～6，在45～60℃条件下平衡30-60分钟，加入占葫芦巴粗粉质量比0.05～0.2％的β-葡萄糖苷酶，混合均匀并不停搅拌，45～60℃温育6～24小时得到葫芦巴前处理液；
(3)水蒸气蒸馏提取挥发油：将上述步骤(2)所得葫芦巴前处理液，经3～8小时水蒸气蒸馏提取挥发油，所得黄绿色油状物为酶促增香葫芦巴挥发油。
进一步的，步骤(1)中所述的超声波功率为300～650W。
进一步的，步骤(2)中使用食品级柠檬酸进行调pH值。
本发明提供一种如上所述方法制备的酶促增香葫芦巴挥发油在再造烟叶中的应用，所述葫芦巴挥发油在再造烟叶中的量为占再造烟叶质量的0.01～0.03％。
本发明对酶促增香制备的葫芦巴挥发油与未经酶处理的葫芦巴挥发油对照(以下简称对照)进行挥发性致香成分GC/MS对比分析。
(1)挥发油处理：将挥发油用二氯甲烷萃取、稀释100倍，取1mL用于进行GC/MS分析。
(2)GC/MS分析：HP-5MS(50m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度：250℃；分流比50:1；载气：He，1mL/min；升温程序：从50℃(1min)以5℃/min升到250℃(5min)；传输线温度：250℃；离子源：EI源；电子能量：70eV；扫描范围：50～550amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。
(3)挥发性成分对比分析
GC/MS分析结果(表1)表明，
①未经酶发酵处理的葫芦巴挥发油中共分离鉴定出30种挥发性成分，主要有酯类，醇类，酚类，烷烃类等化合物；经β-葡萄糖苷酶发酵制备的酶促增香葫芦巴挥发油中共分离鉴定出47种挥发性香气成分，主要包括吡啶，烯类，吡嗪类，醇类，酮类等香气成分；②经β-葡萄糖苷酶发酵制备的葫芦巴挥发油中新出现了35种香气成分，主要有吡啶，右旋萜二烯，吡嗪类，香叶基丙酮，杜松烯，β-紫罗兰酮，(-)-g-荜澄茄烯，β-榄香烯，细辛脑，巨豆三烯酮，肉豆蔻酸，甲酸香草酯，3-甲基-2-(3,7,11-三甲基十二烷基)呋喃，叶绿醇，薯蓣皂素等香气成分，其中右旋萜二烯有似鲜花的清淡香气，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪有炒坚果香气，薄荷醇具有薄荷香气并有清凉作用，1-(2-呋喃基甲基)-1H-吡咯呈榛子和咖啡似香气；香叶基丙酮具有新鲜、清、淡的花香香气，略带甜蜜-玫瑰香韵味；β-紫罗兰酮有果香气息,带有柏木香韵；巨豆三烯酮具有烟草甘甜香气，改善烟香，柔和丰满，掩盖杂味，是烟草重要挥发成份；甲酸香草酯呈强烈水果香气，微似玫瑰及柠檬；③酶促增香后葫芦巴挥发油中4-丁基苯甲酸十七烷基酯，棕榈酸，棕榈酸乙酯等成分的含量有不同程度地提高；④酶促增香后葫芦巴挥发油中的一些成分消失或含量降低：BHT，邻苯二甲酸二乙酯，棕榈酸甲酯，亚油酸甲酯，油酸甲酯，亚油酸，油酸，亚油酸乙酯，硬脂酸，2,6,10,14-四甲基-十八烷，1-单壬烷-rac-甘油。其中，BHT，邻苯二甲酸二乙酯为刺激性有害成分；棕榈酸甲酯，亚油酸甲酯，油酸甲酯，亚油酸，油酸，亚油酸乙酯，硬脂酸等，存在于烟叶，烟气中，量大时会增加烟气的浓度和喉部的粗糙感。所有这些赋予酶促增香制备的葫芦巴挥发油焦糖样烘烤香等丰富香气，刺激性减少，香气质提高。可能是在β-葡萄糖苷酶的作用下，有些成分发生了结构变化形成了同分异构体，而杂环烯烃、杂环化合物等大分子物质断裂分解、降解，产生更多的小分子香气物质或者转化成别的挥发性香气成分甚至消失，可能有利于再造烟叶品质的提高。
总之，从挥发、半挥发性成分的变化看，经β-葡萄糖苷酶发酵的葫芦巴挥发油在再造烟叶中的加香效果可能比对照好。
表1葫芦巴酶促增香挥发油与其对照的挥发性成分GC/MS对比
表1中符号“/”表示未检出；内标为丙酸苯乙酯。
本发明的优点：经超声破碎前处理，促使葫芦巴细胞壁破碎，有效成分更容易析出，再经β-葡萄糖苷酶酶促增香处理葫芦巴粗粉水溶液，水蒸气蒸馏提取挥发油，使挥发油中挥发性香气成分更多、更丰富，据上表GC/MS分析，超声处理、酶促增香的葫芦巴挥发油的香气成分变化大，增加焦甜烘烤香气，香气更丰富，刺激性和杂气减少，可能是因为大分子物质经酶促生香降解、分解、转化成小分子香气物质甚至消失，有的转化为同分异构体；在再造烟叶中应用，具有协调烟气、增加烘烤香气、降低刺激、减少杂气、改善吸味的优点，能与其它烟用香精香料混合调配使用，改善了未经酶解的葫芦巴挥发油在再造烟叶中与烟气不协调、粗糙、刺激性大、杂气重、掩盖烟香的缺陷。该方法所用原料来源广泛，仪器简单，易于操作和实现产业化，成本低，绿色环保，旨在为酶促生香开发天然烟用香料的应用提供参考。
具体实施方式
下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)超声破碎预处理：将葫芦巴粗粉与水按质量比1:20混合，45℃条件下，超声破碎5min；
所述的超声波功率为300W；
(2)酶促增香预处理：将上述步骤(1)的葫芦巴粗粉超声破碎液，经食品级柠檬酸调pH至4，在45℃条件下平衡30分钟，加入占葫芦巴粗粉质量比0.05％的β-葡萄糖苷酶(酶活100u/g)，混合均匀并不停搅拌，45℃温育6小时；
(3)水蒸气蒸馏提取挥发油：将上述步骤(2)的葫芦巴前处理液，经3小时水蒸气蒸馏提取挥发油，所得黄绿色油状物为酶促增香葫芦巴挥发油。
本发明提供一种酶促增香葫芦巴挥发油在再造烟叶中的应用，所述葫芦巴挥发油在再造烟叶中的量为占再造烟叶质量的0.03％。
实施例2
(1)超声破碎预处理：将葫芦巴粗粉与水按质量比1:25混合，50℃条件下，超声破碎14min；
所述的超声波功率为350W；
(2)酶促增香预处理：将上述步骤(1)的葫芦巴粗粉超声破碎液，经食品级柠檬酸调pH至4，在50℃条件下平衡40分钟，加入占葫芦巴粗粉质量比0.08％的β-葡萄糖苷酶(食品级，酶活100u/g)，混合均匀并不停搅拌，50℃温育8小时；
(3)水蒸气蒸馏提取挥发油：将上述步骤(2)的葫芦巴前处理液，经5小时水蒸气蒸馏提取挥发油，所得黄绿色油状物为酶促增香葫芦巴挥发油。
本发明提供一种酶促增香葫芦巴挥发油在再造烟叶中的应用，所述葫芦巴挥发油在再造烟叶中的量为占再造烟叶质量的0.02％。
实施例3
(1)超声破碎预处理：将葫芦巴粗粉与水按质量比1:40混合，55℃条件下，超声破碎20min；
所述的超声波功率为550W；
(2)酶促增香预处理：将上述步骤(1)的葫芦巴粗粉超声破碎液，经食品级柠檬酸调pH至6，在60℃条件下平衡45分钟，加入占葫芦巴粗粉质量比0.15％的β-葡萄糖苷酶(食品级，酶活1000u/g)，混合均匀并不停搅拌，60℃温育24小时；
(3)水蒸气蒸馏提取挥发油：将上述步骤(2)的葫芦巴前处理液，经8小时水蒸气蒸馏提取挥发油，所得黄绿色油状物为酶促增香葫芦巴挥发油。
本发明提供一种酶促增香葫芦巴挥发油在再造烟叶中的应用，所述葫芦巴挥发油在再造烟叶中的量为占再造烟叶质量的0.01％。
实施例4在再造烟叶中加香的感官评价分析
经过再造烟叶加香评吸试验(表2)表明，经β-葡萄糖苷酶发酵增香的葫芦巴挥发油在再造烟叶中的加香效果明显好于未酶处理的葫芦巴挥发油(简称对照)，香气特征表现得更为饱满、突出，增加了焦甜烘烤等丰富香气，提调烟香，烟气更加柔和细腻，刺激性、杂气明显降低，香气质提高。适宜加香量为0.01％。
表2酶促增香葫芦巴挥发油及其对照样品在再造烟叶中的加香评吸结果
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。