本发明涉及发酵工程和生物催化领域，尤其涉及一种大肠杆菌工程菌及其催化马来酸合成富马酸的方法。
背景技术：
：富马酸，又称反丁烯二酸、延胡索酸，是一种天然存在的有机酸。作为一种重要的四碳平台化合物和精细化工产品，富马酸广泛用于食品、医药、化工、涂料、增塑剂等领域。例如，在食品方面，可用作口味纯正的酸味剂、风味增强剂；在医药方面，富马酸铁则广泛应用于治疗人体的小红血球贫血病。目前，工业生产富马酸以化学合成法为主，包括糠醛氧化法和顺丁烯二酸酐异构法等。但是化学合成法需利用石油资源，而石油是不可再生资源，促使生产成本增高，并且还有污染大等缺点。随着技术的发展，以微生物发酵法和酶转化法为主的生物合成法正逐渐取代化学合成法，但是微生物发酵法会产生大量的发酵副产物，不利于产品的分离提纯。酶法有转化率高、产物单一、催化pH单一的优点，是工业生产富马酸很有潜力的方法。粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)来源的马来酸顺反异构酶在室温有较好的稳定性，酶活力也相对其他菌株来源的要高，可用于酶法催化合成富马酸，但是游离酶的热稳定性和环境耐受性比较差、不能重复使用。而全细胞稳定性较高，因为酶被保护在其天然的细胞环境中，而且免去了酶的纯化和下游加工过程，并且能够回收重复利用，生产成本更低，因此利用全细胞作为催化剂生产富马酸更具吸引力。在以含有粘质沙雷氏菌来源的马来酸顺反异构酶的大肠杆菌为宿主菌进行全细胞催化生产富马酸时，会由于延胡索酸酶的存在而导致富马酸被转化成L-苹果酸，降低富马酸的转化率和纯度。延胡索酸酶是TCA循环中的一个关键酶，催化富马酸生成L-苹果酸，原核生物中有三种延胡索酸酶，分别由fumA、fumB、fumC编码。fumA在有氧条件下表达；fumB主要在无氧条件下表达；fumC是备用酶，仅有少量表达。因此，需要敲除宿主菌中的fumA和fumC基因以提高富马酸产物的转化率和纯度。鉴于上述缺陷，本发明人积极加以研究创新，以期创建一种大肠杆菌工程菌及其催化马来酸合成富马酸的方法，使其更具有产业上的利用价值。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种大肠杆菌工程菌及其催化马来酸合成富马酸的方法。本发明利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)中fumA和fumC基因，并表达来源于粘质沙雷氏菌的马来酸顺反异构酶，最终获得的基因工程菌可高效转化马来酸底物合成高纯度富马酸。本发明的可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，工程菌通过敲除大肠杆菌的延胡索酸酶编码基因，并在所得的重组菌株中表达马来酸顺反异构酶基因得到。进一步的，延胡索酸酶编码基因为fumA和fumC。进一步的，马来酸顺反异构酶基因来源于粘质沙雷氏菌。进一步的，大肠杆菌为EscherichiacoliBL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。进一步的，马来酸顺反异构酶基因的表达载体为pET24a系列表达载体、pUC19系列载体、pBR322系列载体、pKK223-3系列载体、pPL451系列表达载体或pBV220载体。本发明的可高产富马酸的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)以pKD13质粒为模板，并设计延胡索酸酶编码基因fumA和fumC的引物，进行聚合酶链式反应，得到延胡索酸酶编码基因fumA和fumC线性同源重组片段；(2)将表达Red重组酶的载体质粒转入大肠杆菌中制备感受态细胞，感受态细胞经阿拉伯糖诱导后制备电转感受态细胞；(3)将步骤(1)得到的线性同源重组片段电转化进入步骤(2)中的电转感受态细胞中，进行同源重组，得到突变的大肠杆菌；(4)去除步骤(3)得到的突变的大肠杆菌中的载体质粒，然后向其中转化辅助质粒以消除抗性基因，再去除辅助质粒，得到敲除fumA和fumC基因的大肠杆菌；(5)将马来酸顺反异构酶表达载体电转化入步骤(5)得到的敲除fumA和fumC基因的大肠杆菌，得到大肠杆菌工程菌。进一步的，在步骤(1)中，延胡索酸酶编码基因fumA和fumC引物序列分别如SEQID:1和SEQID:2所示。进一步的，在步骤(1)中，延胡索酸酶编码基因fumA和fumC引物命名为FumApKD3R和FumCpKD3F。进一步的，在步骤(1)中，线性同源重组片段的中间为卡那抗性基因和FRT标记、两侧为短同源臂。进一步的，在步骤(2)中，载体质粒为pKD46。进一步的，在步骤(2)中，大肠杆菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。进一步的，在步骤(2)中，阿拉伯糖的浓度为2-10mmol/L。进一步的，在步骤(2)中，诱导ParaB启动子表达α、β和γ蛋白后得到宿主电转感受态。进一步的，在步骤(3)中，用引物YfumCF和YfumAR进行菌落PCR验证，以确定得到突变的大肠杆菌。进一步的，YfumCF和YfumAR引物序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。进一步的，在步骤(4)中，辅助质粒为pCP20。进一步的，在步骤(4)中，用引物YfumCF和YfumAR进行菌落PCR验证，以确定得到抗性基因的缺失突变。进一步的，YfumCF和YfumAR引物序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。进一步的，在步骤(4)中，采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选去除载体质粒和辅助质粒。进一步的，在步骤(5)中，马来酸顺反异构酶表达载体为pET24a-maiA。进一步的，pET24a-maiA载体质粒为文章“粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质”(王亚，等，食品与生物技术学报,2014,33(11):1024-1029)中所构建的。进一步的，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)来源的马来酸顺反异构酶在室温有较好的稳定性，酶活力也相对其他菌株来源的要高。本发明还公开了上述大肠杆菌工程菌催化马来酸合成富马酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：对大肠杆菌工程菌进行发酵培养，当OD600达到40-80时对大肠杆菌工程菌进行高密度诱导表达，将得到的发酵液生化催化马来酸，得到富马酸。进一步的，使用乳糖作为诱导剂进行高密度诱导表达。进一步的，高密度诱导表达的条件为：温度为25℃-37℃，乳糖流加速度为0.15-0.25g/Lh，pH7.0-7.2。进一步的，高密度诱导表达的条件为：溶氧20％-40％，通气量1.25-2vvm，比生长速率μ为0.15-0.251/h。进一步的，发酵过程采用指数流加补料，指数流加补料使用的补料培养基包括以下重量的各组分：甘油200-600g/L，硫酸镁5-8g/L，蛋白胨2-4g/L，酵母膏2-4g/L。进一步的，本发明的补料培养基可提高马来酸顺反异构酶的表达效率。进一步的，诱导表达过程采用浓度为100-200g/L的乳糖。进一步的，发酵过程中将乳糖流加到发酵液中。进一步的，发酵培养基的成分包括：蛋白胨1-2g/L，酵母粉1-2g/L，甘油8-10g/L，磷酸二氢钾10-15g/L，磷酸氢二铵1-5g/L，柠檬酸1-2g/L，硫酸镁1.68-3.36g/L，微量元素10mL。进一步的，微量元素包括：硫酸亚铁10g/L，硫酸铜1g/L，硫酸锰0.5g/L，硫酸锌2.3g/L，钼酸铵0.1g/L，硼酸钠0.2g/L，氯化钙2g/L。进一步的，使用发酵液中全细胞催化高浓度马来酸生产富马酸，富马酸的转化率在98％以上。借由上述方案，本发明具有以下优点：本发明提供一种可高产富马酸的大肠杆菌工程菌的构建方法，以全细胞转化马来酸生产富马酸，利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)中fumA和fumC基因，切断其富马酸到L-苹果酸的代谢通路，然后表达来源于粘质沙雷氏菌的马来酸顺反异构酶；本发明的大肠杆菌工程菌可应用于全细胞催化法合成富马酸，即在发酵罐中应用最优发酵培养基、补料培养基和发酵条件对大肠杆菌工程菌进行高密度诱导表达，避免乙酸的积累，可快速获得高密度的菌体并高效表达马来酸顺反异构酶，用发酵液对高浓度马来酸进行生物催化生产富马酸，其富马酸转化率在98％以上，几乎不合成L-苹果酸副产物；使用乳糖诱导马来酸顺反异构酶表达，代替传统的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导剂，乳糖更为廉价，能够为工业成产节约成本，更加适于工业应用。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1为BL21(DE3)fumA-fumC::FRTKm菌株PCR验证电泳图；图2为BL21(DE3)fumA-fumC::FRT菌株PCR验证电泳图；图3为菌株BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA发酵罐发酵曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的材料(1)菌株及引物出发菌株为EscherichiacoliBL21(DE3)；pKD13质粒(文献Datsenkoetal.,ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:6640-6645所报道的)的卡那霉素抗性基因的扩增引物为FumCpKD3F和FumApKD3R；验证基因组卡那霉素抗性基因成功替换目标基因的验证引物为YfumCF和YfumAR；验证目标基因被成功敲除的验证引物为YfumCF和YfumAR。(2)培养基发酵种子培养基(LB培养基)：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl10g/L；pH＝7.0-7.2；121℃灭菌20min；发酵培养基：蛋白胨2g/L，酵母粉2g/L，甘油8g/L，磷酸二氢钾13.5g/L，磷酸氢二铵4g/L，柠檬酸1.7g/L，硫酸镁1.7g/L，微量元素10mL；微量元素：硫酸亚铁10g/L，硫酸铜1g/L，硫酸锰0.5g/L，硫酸锌2.3g/L，钼酸铵0.1g/L，硼酸钠0.2g/L，氯化钙2g/L；补料培养基：甘油500g/L，硫酸镁7.33g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L；诱导剂：乳糖，150g/L。所用试剂均为市售。实施例1以pKD13质粒为模板，目标基因延胡索酸酶编码基因fumA和fumC的引物FumCpKD3F和FumApKD3R进行聚合酶链式反应，扩增得到中间为卡那抗性基因和FRT标记、两侧为短同源臂的线性同源重组片段。FumCpKD3F和FumApKD3R序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。以实验室保藏的大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)为出发菌株，将携带Red重组酶的pKD46质粒(pKD46质粒为文章Datsenkoetal.,ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:6640-6645所报道的)转入大肠杆菌中，在Amp抗性平板培养基中筛选得到转化子；将转化子接入有Amp抗性的50mLLB培养基中30℃过夜培养；按1％的接种量接入相同的LB培养基中，并且加入终浓度为2mmol/L的阿拉伯糖作为诱导剂，30℃培养4小时左右，诱导ParaB启动子表达α、β和γ蛋白，在OD600＝0.6时收集菌体制备电转感受态。将PCR获得的线性同源重组片段电转化进入BL21/pKD46感受态中，30℃预培养1h涂有卡那抗性的LB平板，30℃倒置培养20小时，挑选转化子，得到BL21(DE3)fumA-fumC::FRTKm菌株，用引物YfumCF和YfumAR进行菌落PCR验证，验证确定目标基因已经发生正确的替换突变；因为pKD46质粒是温敏型复制子，在42℃下质粒复制被抑制并会在传代过程中丢失，采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选的策略，将替换突变的大肠杆菌中的pKD46质粒丢失。如图1所示，M为DL5,000DNAMarker；1代表用验证引物YfumCF和YfumAR对BL21(DE3)fumA-fumC::FRTKm菌株进行菌落PCR电泳条带；2代表用验证引物YfumCF和YfumAR对BL21(DE3)菌株进行菌落PCR电泳条带。由图1可知，目标基因fumA和fumC已经发生正确的替换突变。将辅助质粒pCP20(该质粒为文章Datsenkoetal.,ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:6640-6645所构建的)转化入替换突变的大肠杆菌BL21中，pCP20质粒在大肠杆菌中表达产生FLP重组酶，FLP酶作用于两个FRT区再次发生同源重组，用一个FRT片断代替原有的两个FRT片段，从而发生卡那抗性基因的缺失突变，得到BL21(DE3)fumA-fumC::FRT菌株，用引物YfumCF和YfumAR进行菌落PCR验证，验证确定卡那抗性基因已经发生正确的缺失突变；采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选的策略，将缺失突变的大肠杆菌中的pCP20质粒丢失，获得敲除fumA和fumC基因的大肠杆菌BL21(DE3)△fumA-fumC。如图2所示，BL21(DE3)fumA-fumC::FRT菌株PCR验证电泳图中M代表DL5,000DNAMarker；1代表用验证引物YfumCF和YfumAR对BL21(DE3)菌株进行菌落PCR电泳条带；2代表用验证引物YfumCF和YfumAR对BL21(DE3)fumA-fumC::FRT菌株进行菌落PCR电泳条带。从图2可知，卡那抗性基因已经发生正确的缺失突变。实施例2本实施例说明菌株BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA的构建和高密度发酵表达方法。将本实验室前期已构建成功的pET24a-maiA质粒，电转化到实施例1中的基因敲除大肠杆菌BL21(DE3)△fumA-fumC中，得到大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA。将-80℃保存的上述大肠杆菌工程菌株在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上划线过夜活化，挑取单菌落接种到含有50μg/mL卡那抗性的5mL的LB试管培养基中37℃培养8小时，以1％(v/v)的接种量接种到含有50μg/mL卡那抗性的120mL的发酵种子培养基中37℃培养7.5h作为上罐种子液，然后以7％的接种量接种于发酵培养基中。37℃下在发酵培养基中培养，当培养至OD600为40-80时，改变温度为25℃-37℃进行诱导，加入乳糖作为诱导剂，乳糖的浓度为150g/L，控制发酵诱导表达条件为：pH7.0-7.2，溶氧20％-40％，通气量1.25-2vvm，比生长速率μ为0.15-0.251/h。发酵过程采用指数流加补料，指数流加补料过程中使用补料培养基。由图3可见菌体生长40h时，细胞密度和酶活达到最大值，OD600可达150，酶活可达300U/mL。实施例3本实施例说明菌株BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA转化马来酸合成富马酸的能力。底物的配制：称取185.7g马来酸固体加入1L去离子水中，并用磁力搅拌器不断搅拌，用氢氧化钾调至pH＝8.0，配得2mol/L马来酸钾溶液。用实施例2中的发酵菌液和原始大肠杆菌BL21/pET24a-maiA的发酵菌液，作为生物催化剂进行富马酸的生产，转化体系中2mol/L马来酸钾溶液和发酵菌液的比例为4:1，转化温度控制在37℃，转化1.2h后取转化液测定其中马来酸、富马酸和苹果酸的浓度。由表1可以看出在富马酸的生产过程中，原始菌株会将生成的富马酸进一步转化为苹果酸，其苹果酸产量可达20％，富马酸转化率仅有80％左右；而基因敲除菌株的转化体系中则仅有0.7％左右的苹果酸产生，富马酸的积累可达98％以上。表1重组大肠杆菌催化马来酸合成富马酸性能的比较菌株苹果酸马来酸富马酸BL21/pET24a-maiA15.5％0.79％84％BL21△fumA-fumC/pET24a-maiA0.7％0.8％98.4％对细胞的重复使用能力进行检测，取发酵液加入马来酸钾溶液至终浓度为1.6mol/L，37℃反应1.2h，离心，取上清分别测定苹果酸、马来酸、富马酸的浓度，将离心得到的细胞再加入马来酸钾溶液至1.6mol/L，在37℃反应1.2h，重复上面的步骤，利用细胞重复催化5次。由表2中可见，BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA细胞重复使用4次，富马酸的转化率仍可保留92％以上，表明具有较好的重复利用性能。表2BL21(DE3)△fumA-fumC/pET24a-maiA细胞催化马来酸合成富马酸的重复使用性能催化次数苹果酸马来酸富马酸10.65％0.88％98.46％20.73％2.08％97.20％30.76％6.28％92.97％40.75％10.69％92.56％50.73％11.60％87.67％以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3