1.一种重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法,其特征在于:这种重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法:选取抗原抗体共表达的方式,将PEDV抗原基因S1和anti-PEDV ScFv基因共同表达在大肠杆菌周质腔内,利用流式细胞术进行三轮淘选;用大肠杆菌表达ScFv基因后纯化PEDV抗体,用ELISA方法检测PEDV ScFv抗体特异性,命名为PEDV-ScFv;具体通过抗PEDV ScFv文库的构建、抗PEDV抗体的制备两个步骤进行。
2.根据权利要求1所述的重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法,其特征在于:所述的抗PEDV ScFv文库的构建的方法如下:
一、动物免疫及血清抗体效价的检测:
3-6日龄仔猪先以PEDV弱毒疫苗免疫,之后以中等毒力毒株攻毒,前后共3次;每次免疫或攻毒前1天及最后一次免疫1周后采血,间接ELISA检测血清抗体效价;96孔酶标板包被重组PEDV的S1蛋白,一抗为待测血清,每板设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔,辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG为二抗,TMB显色,用酶标仪读取各孔OD值;最后一次免疫1周后,选用抗体效价高的阳性血清,加入叠氮钠至终浓度为0.2%,4 oC放置待用;
将抗体效价较高的三头仔猪处死,取脾脏,将其置于300目尼龙网上研碎,取细胞悬液;脾细胞悬液加ACK lysing buffer,室温放置5 min,2000 g离心10 min,收集白细胞沉淀;按106个细胞/ml的量加入Trizol,裂解细胞,提取总RNA;以提取的三头猪脾脏的淋巴细胞混合后的总RNA为模板,Oligo(dT)-18为引物,参照M-MLV反转录酶说明书,进行cDNA第一条链合成,并用1 μl反转录产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检查其质量;
根据GenBank上已发表的猪抗体重链VH、轻链VL可变区基因的两端恒定区序列,分别利用引物设计软件Primer 5.0分析设计引物,并在重链上下游分别加入Nhe I、Nde I酶切位点,轻链下游分别加入Bam HI、Not I酶切位点;以免疫后猪脾cDNA为模板,分别以VH上游引物、VH下游引物和VL上游引物、VL下游引物进行梯度PCR扩增;对VH和VL扩增产物进行胶回收,并与pMD18-T载体连接,转化DH5α,并随机挑取1个单菌落进行测序,确定获得的基因序列为猪源抗体;
二、ScFv细菌展示抗体库的构建:
以免疫后猪脾cDNA为模板,以VH上游引物、VH下游引物扩增重链可变区基因,其中VH的5’端引入NheI酶切位点,3’引入NdeI酶切位点,PCR产物利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化;取VH PCR纯化产物与pMD18-T载体连接,转化DH5α,并随机挑取1个单菌落进行测序;进行Nhe I、Nde I双酶切,37oC水浴3h,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行转化构建VH抗体库;次日,收集所有菌落并提取质粒,进行Bam HI、Not I双酶切鉴定;然后用BamH I、Not I对VL PCR回收产物进行双酶切;酶切后进行胶回收,连接并转化DH5α,涂布平板,37oC过夜培养,收集菌落并提取质粒,即为PEDV-ScFv抗体库;
取构建的PEDV-ScFv抗体库进行酶切鉴定和PCR鉴定,分别用Nhe I、Nde I和Bam HI、Not I对抗体库进行双酶切;取PEDV-ScFv抗体库质粒为模板,分别使用VH和VL的上下游引物对其进行PCR鉴定。
3.根据权利要求2所述的重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法,其特征在于:所述的抗PEDV抗体的制备方法如下:
一、流式细胞术筛选大肠杆菌pBSD-PEDV ScFv展示文库:
取上述收集的文库所有菌落用LB液体培养基稀释至OD600≈0.2,37 oC培养2h,使之OD600≈0.4,加入IPTG至终浓度为2.5 mmol/L,诱导4 h;在1.5 ml Eppendorf管中加入1.5 ml培养物,6000 rpm离心3 min,去掉上清;
菌体沉淀用350μl Sucrose /Tris solution重悬,Sucrose 的浓度为0.75mmol/L,Tris的浓度为0.1mol/L;加入35 μl浓度为10 mg/ml新鲜配制的溶菌酶母液;逐滴加入700 μl 1 mmol/L EDTA溶液,同时涡旋混匀;冰上孵育15 min;加入50 μl 0.5mol/L MgCl2溶液,并在冰上孵育10 min;4 oC,10000 rpm离心10 min;原生质球沉淀用1 ml PBS溶液重悬洗涤,6000 rpm离心3 min,去上清;原生质球沉淀用100 μl PBS重悬;
在100 μl PBS重悬的已诱导菌液中加入10 μl 质量体积比为1% BSA贮存液、1.5 μg FITC标记后的S1,冰上避光孵育1 h;8000 rpm,离心3 min,1 ml PBS重悬洗涤一次,沉淀用100 μl PBS重悬;设置阴性对照,将空白菌DH5α处理成为原生质球,空白菌DH5α 中不含pBSD-IBDV ScFv重组质粒,用标记后的VP2抗原孵育;
用流式细胞仪于488 nm波长激光下,检测样品及阴性对照的荧光强度,收集样品中荧光强度高于阴性对照的部分;将分选出来的细菌进行质粒制备,电击转化至大肠杆菌DH5α,构建次级筛选库,按上述的方法进行第二轮筛选,将每个峰值范围内的细胞分选出来,制备质粒后转化大肠杆菌DH5α,构建次级筛选库,按上述的方法进行第三轮筛选后,挑取单菌落20个,扩培后逐个用流式细胞仪进行检测,选出荧光信号比阴性对照强的克隆,进行测序并分析;
二、抗PEDV ScFv抗体在大肠杆菌中的表达纯化及活性:
将质粒测序后与网上的猪源抗体进行序列比对,利用引物设计软件Primer Premier 5.0分析设计PCR引物P1、P2,选取两个进行PCR扩增、纯化、连接入pMD18-T载体,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,接种于LB液体培养基中过夜培养,提取质粒,PCR和酶切鉴定后送去测序;测序结果正确后,对质粒进行双酶切,连入pET-27b载体,转化入Rosetta中;
挑取含有表达载体pET-27b-ScFv的Rosetta单菌落,分别接种于含有100 μg/ml Amp+的LB液体培养基中,37 oC过夜培养;次日取上述过夜培养物以1%的比例分别接种于含100 μg/ml Amp+的LB液体培养基中,37 oC振荡培养2h,加IPTG 37 oC继续培养,诱导4h;取1ml培养物菌体;洗涤后加入预冷PBS重悬;加入5×SDS样品缓冲液,煮沸5 min;取20μl样品进行SDS-PAGE;电泳后,经考马斯亮蓝R-250染色,用甲醇-冰乙酸脱色液脱色,观察结果;
挑取转化重组质粒pET-27b-ScFv单个菌落接种于含有100 µg/ml Amp+的LB液体培养基中,培养过夜;取上述两种过夜培养物以1%的比例接种于1L含有100 µg/ml Amp+的新鲜LB液体培养基中,37 oC振荡培养至OD600值达到0.3时,加IPTG至终浓度0.25 mmol/L,37 oC继续诱导培养4 h;取出培养物于4 oC以12000 r/min离心5 min,收集菌体;弃上清,每20 ml菌液沉淀加入1ml Binding buffer重悬菌体,加入溶菌酶至终浓度1mg/ml,在冰上高强度超声破碎约40 min,每次10s,每次间隔10s;菌体经超声波破碎后12000 rpm 4 oC离心30 min,分别收集包涵体;洗涤后分别用变性液溶解4 oC过夜;将溶解后蛋白加入到10倍体积的复性液中,4 oC复性24 h,pH调至7.4左右;在经pH 7.4的PBS 于4 oC透析3次,每次8 h;纯化后的蛋白进行SDS-PAGE,并用紫外分光光度计检测其浓度;将抗原蛋白以浓度梯度包被96孔板,于4 oC包被过夜;PBST洗96孔板3次,每次2 min,用5%脱脂奶粉37 oC封闭2h,分别加封闭液稀释的浓度梯度为100 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL阴性对照不加抗体的S1蛋白,37 oC孵育2 h,PBST洗96孔板3次,再加入二抗HRP-goat anti-porcine IgG (H+L),37 oC温育1 h,PBS洗96孔板4次后,加入TMB底物液,于37 oC避光显色5 min,每孔加入50 μL终止液,用酶标仪于波长450 nm下检测其OD值。
4.根据权利要求3所述的重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法,其特征在于:所述的S1扩增的引物:
上游引物5’- GGTCTCTAGGTGTTACTTTGCCATCATTTAA-3’(SEQ ID NO:1)
下游引物5’- ATGGATCCTTAAACGTCCGTGACACCTTCAA-3’(SEQ ID NO:2)。
5.根据权利要求4所述的重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法,其特征在于:所述的Binding buffer的组成为:8 mol/L Urea,0.1 mol/LNaH2PO4,0.01 mol/L Tris,,Binding buffer的 pH 8.0。
6.根据权利要求5所述的重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法,其特征在于:所述的变性液组成为:8 mol/L尿素、0.1 mol/L Na2HPO4, 0.01 mol/L Tris-HCL, pH 8.0。
7.根据权利要求6所述的重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法,其特征在于:所述的复性液配方为还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽至终浓度为2 mmol/L和0.2 mmol/L、精氨酸盐酸盐至终浓度0.5 mol/L、甘油至终浓度10%、Tris至终浓度0.4 mol/L,复性液pH调至7.4左右。
8.根据权利要求7所述的重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法,其特征在于:所述的终止液为2 mol/L的H2SO4。