本发明涉及生化技术领域，具体是一种利用T4噬菌体DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法。
背景技术：
随着科技的发展，各种新的技术逐渐出现在人们的生产和应用中，克隆技术就是其中一种。克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因的个体或种群。目前常规基因克隆方法是利用T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）的方法将待克隆的目的基因与载体连接，将重新成环的重组子转化感受态菌细胞中，然后筛选鉴定正确的克隆。但是该方法涉及的步骤多，并且各种繁琐，耗费时间多。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用T4噬菌体DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用T4噬菌体DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，具体步骤如下：
步骤一，设计引物：对至少两个待连接的DNA片段分别设计引物，每条待连接片段设计正向引物和反向引物，引物结构为，相邻连接处前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物的5`到3`端依次包含接头DNA序列、T4噬菌体DNA拓扑异构酶I识别位点的DNA序列以及与相应模板配对的DNA序列，其中所述前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物中的接头序列反向互补配对，不同连接所用的互补接头片段序列各不相同；
步骤二，片段扩增：将相应的待连接DNA片段为模板，以各自的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，然后对扩增产物进行纯化；
步骤三，片段连接：将步骤二中得到的纯化后的各扩增产物进行混合，加入T4噬菌体DNA拓扑异构酶I，在37℃下反应15min，得到完成连接的DNA片段。
作为本发明进一步的方案：T4噬菌体DNA拓扑异构酶I识别位点为XGCYA,其中X为T或C，Y为T或G。
作为本发明进一步的方案：引物中包含的接头DNA序列为至少4个核苷酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的DNA片段连接方法利用了T4噬菌体DNA拓扑异构酶I同时实现酶切与连接的功能，传统的方法需要先利用限制性内切酶使DNA片段产生相匹配的末端，纯化后利用T4连接酶连接片段，因此具有更快捷高效的特点，本发明的方法中待连接片段内部的序列不会对连接产生影响，消除了传统方法中酶切步骤的缺陷。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种利用T4噬菌体DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，具体步骤如下：
步骤一，设计引物：对2个长度为1.5kb的DNA片段进行连接，引物A、B与引物C、D各扩增一个长度为1.5kb片段，其中引物A、D仅含有与模板互补的序列，引物B、C从5`到3`端依次包含接头DNA序列、T4噬菌体DNA拓扑异构酶I识别位点DNA序列以及模板配对的DNA序列，引物2、3的接头DNA序列反向互补。DNA片段的来源、大小和引物A、B、C以及D见表1
表1 DNA片段和引物
粗体字母表示接头序列，下划线表示T4噬菌体DNA拓扑异构酶I识别位点序列。
步骤二，片段扩增：将相应的待连接DNA片段为模板，以各自的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，然后用Gel Extration DNA purification Kit回收和纯化PCR产物。PCR的组分和体积见表2。
表2 PCR的组分和体积
PCR反应的步骤如表3
表3 PCR反应的步骤
步骤三，片段连接：将步骤二中得到的纯化后的各扩增产物进行混合，加入T4噬菌体DNA拓扑异构酶I，在37℃下反应15min，得到完成连接的DNA片段，反应的组分和体积见表4。
表4 反应的组分和体积
向连接产物中加入3 μl 6X Stop Buffer (0.6%SDS, 30mM EDTA pH 8.0)来终止反应，将片段1、2与连接产物于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，结果中可见出现明显的3kb 的DNA条带，证明连接成功。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。