一种基于流式细胞术的高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法与流程

文档序号:13755043阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于流式细胞术的高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法,其特征在于,所述方法主要包括步骤如下:

(1)获得阿维链霉菌的多个含量死孢子在内的待筛选的孢子;

(2)利用PI染料对步骤(1)的待筛选的孢子进行染色;

(3)使用流式细胞仪检测孢子活性;

(4)利用流式细胞仪分选有活性孢子,直接将单个有活性的孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中;

(5)待高通量孔板的固体培养基上培养3~4天,直接添加液体种子培养基继续培养得到种子液;将培养好的种子液转接入含有发酵培养基的新的高通量孔板中,发酵培养;

(6)配置一定浓度梯度的阿维菌素标准品,用酶标仪检测,得到线性浓度范围内阿维菌素与240nm下的吸光值OD的关系;发酵培养结束后,吸取发酵液,浸提后离心取上清,在合适的浓度下用酶标仪测定240nm下的吸光值OD,进而得知待筛选菌株产阿维菌素含量的相对高低;

(7)选取上一步得到的阿维菌素含量相对较高的菌株多株,进行复筛。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)的待筛选孢子是不同活性的孢子,包括死孢子。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)的待筛选孢子是将阿维链霉菌进行诱变后得到的。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述诱变是物理诱变或者化学诱变。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)和步骤(4)具体是:以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将完全无活性的与PI染色剂结合的样品设置为阳性对照,确定阴性与阳性孢子群体;取染色后的阿维链霉菌孢子悬浮液,重新过滤,稀释一定倍数,上流式细胞仪分析,用FL3通道检测,以FCS-Log-Height为横坐标,SSC-Log-Height为纵坐标,SSC阈值为0.03,荧光通道电压为513,将无荧光区域最集中部分设门分选至装有固体培养基的高通量孔板中,每孔分选设定为单个孢子。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)的染色,具体是:将待筛选的孢子调整至浓度105~106个孢子/mL的悬浮液,将等体积悬浮液与10μg/mL PI染色剂混合,避光放置4℃冰箱孵育15min。

7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,装有固体培养基的高通量孔板中固体培养基的体积为50μL/孔。

8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中,是培养至长出可见孢子后添加液体种子培养基。

9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中液体种子培养基的添加量为150μL/孔。

10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(6),是绘制阿维菌素与240nm下的吸光值OD的标准曲线;发酵培养结束后,乙醇适当稀释超声浸提后离心,测定上清液在240nm下的吸光值OD,将吸光值OD代入标准曲线,得到相应的阿维菌素含量。

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