纳米磁颗粒捕获癌细胞的方法及其应用与流程

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种获取并分离细胞的方法，尤其一种通过磁性纳米颗粒对细胞进行标记后而捕获癌细胞的方法，以及捕获的装置和应用。

背景技术：

临床常见的恶性肿瘤包括肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、结肠直肠癌等，癌细胞的扩散是癌症致死的最主要的病因，而造成癌细胞扩散的主要原凶之一就是循环癌细胞。循环癌细胞(Circulating Tumor Cells,CTC)是存在于循环系统中各类癌细胞的统称。CTC一旦进入合适的组织器官，即可发育成为新的转移性癌症病灶。因此对CTC的检测，对于肿瘤患者的早期病因诊断、治疗策略制定、疗效及预后的评估都具有非常重要的意义。但人体外周血中CTC的含量很低，加上血液中含有比CTC高许多倍的红细胞、白细胞、血小板等，如何在大量的“背景”细胞中有效富集或捕获这些CTC，成为CTC检测的关键技术。

CTC的检测，通常是通过捕捉或富集外周血中痕量存在的CTC来监测癌细胞的类型、数量、变化趋势等，以便对患者体内的肿瘤进行动态的监测及疗效的评估，以便实现实时的、个体化的精准治疗。

CTC的概念于1869年澳大利亚的研究者Ashworth首次提出，1976年Nowell将CTC的定义进一步修正：来源于原发肿瘤或转移性肿瘤，获得脱离基底膜的能力，侵入和穿过组织基质，进入血管的肿瘤细胞。近年来，全球的科学家在CTC细胞的研究上投入了巨大的努力，并取得了许多显著的成果，为全面解析癌症的耐药性、转移机制、发病机理等，提供了重要的理论依据，同时也为开发各种新型个体化治疗策略提供了新的思路和线索。

由于CTC在外周血中的数目远比正常的血细胞少很多，世界上许多实验室都在研究其分离、捕获和富集的方法。如：根据CTC的物理尺寸进行分离。由于CTC细胞平均大小约17±1.5μm，比正常的红细胞、粒细胞、淋巴细胞和单核细胞都要大，因此，可使用相应孔径的微孔滤器或微孔芯片进行物理分离，再经后续的洗脱或返流等方式将CTC纯化出来(如：J Chromatogr A.2007,1162(2),154～161,Nat Protoc.2014,9(3),694～710,200910198495.2和201210181873.0等)。尽管此类方法纯化分离CTC的纯度较高，但由于其加工工艺复杂，液体流速较慢，分离一个样本需要较大量的标本(大于7.5ml)，平均耗时达4小时以上，很难满足快速检测的临床需求。

第二种方法是使用表面功能化的膜或管道系统吸附，从而进行CTC分离。该方法是基于大部分CTC细胞都表达肿瘤抗原，在膜/管道表面使用抗体功能化，当稀释后的样本流经膜或管道表面时，CTC的表面抗原即可与相应的抗体结合，从而实现CTC的捕获(如：201310139673.0、201410153597.3和201210193145.9等)。此类方法首先需将膜或管道表面进行抗体功能化，由于不同的膜或管道表面性质不同，抗体的结合 效果很难保证，因此导致CTC的捕获性能偏差很大。另外，存在于膜/管道表面的抗体与CTC表面的抗原起反应，需要一定的反应温度和时间，此类装置只有在液体流速极慢时才有效，且需要恒温装置，因此此类技术应用前景同样较弱。

第三种方法是基于免疫磁分离技术，此类分离方法多以大颗粒磁珠(微米级或以上)为基础，在磁珠表面进行相应抗体偶联后进行癌细胞捕获，再经洗脱过程将CTC纯化出来(如：J Transl Med.2011,9(1):1～8,Lab on a Chip.2014,14(1):57～62)。此类技术的优点是磁珠的磁性较强，分离能力较高，但进行相应的生物学检查(如：培养、核酸提取和免疫组化染色等)操作前必须使用化学方法将磁珠洗脱，此过程的化学物质的作用，不仅对CTC产生严重的物理或化学损伤，还可能干扰后续的生物学检测过程。

另外也有检测以磁纳米粒子为基础(如：201310614556.5)且后续检测过程中不需经过洗脱过程，但此类检测使用的磁纳米粒子为γ-Fe₂O₃。

由于γ-Fe₂O₃其饱和磁化强度最大为41emu/g，经表面修饰和/或偶联抗体后，其饱和磁化强度不到20emu/g。但该类磁性纳米粒子具有更好的T2驰豫成像增强功能。因此，对于此类磁纳米粒子的研究，多倾向于研究其磁共振成像增强功能。也有检测以磁纳米粒子为基础的相关捕获技术(如：201310614556.5)，其使用γ-Fe₂O₃磁纳米粒子捕获循环癌细胞时，需先在磁纳米粒子多面经过多层功能化过程(PEI包覆至少5层，每层均需脱水偶联过程，再经APTES表面氨基化，再用丁二酸酐羧基化)，最后尽管表面也完成羧基化并可以偶联抗体，但该磁纳米粒子粒径达到了376±17nm；由于空间位阻效应，导致饱和磁强度减弱(合成时为34.9emu/g，功能化后的饱和磁强度未显示)。大粒径的磁粒子在标记相应癌细胞后，必然对其后的检测造成影响，须经过化学洗脱才能达到检测要求。已有的其他方法虽然也使用γ-Fe₂O₃磁纳米粒子进行DNA捕获、抗体或特定蛋白的捕获，均在其表面经聚苯乙烯包覆或硅烷化(包硅)过程，从而使多个较小的具有超顺磁性的γ-Fe₂O₃磁纳米粒子经物理包裹后，形成比较大的球体(200nm～2mm不等)，以弥补其磁饱和强度不足的问题，但目的物的获得，后期同样均需化学洗脱过程，化学洗脱过程必然造成癌细胞的化学损伤。

其它方法如：采用数字化捕获系统(如：201410818225.8)和基于氧化石墨烯的微流控芯片捕获系统(如：Nat Nano.,2013,8(10),735～741)，以及基于芯片培养一体化系统(Oncotarget.,2014,75(15),supp.,1～15)等，皆因工艺复杂、流程繁琐和应用不便等原因，很难在现实中推广使用。

基于上述认识，目前针对CTC的研究，需要一种设计新颖，使用便捷，分离高效的CTC捕获技术，以利于后续生物学试验的开展和应用。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种磁纳米颗粒在捕获细胞中的应用，借助对磁纳米粒子功能化手段实现对细胞，尤其是CTC细胞的捕获和后续利用。

本发明的另一个目的在于提供一种捕获磁纳米粒子标记细胞的方法，实现细胞， 尤其是CTC细胞的快速捕获与收集。

本发明的再一个目的在于提供一种捕获磁纳米粒子标记细胞的装置，以利于实施对细胞，尤其是CTC细胞的捕获。

本发明的又一个目的在于提供一种CTC细胞，其经本发明提供的装置所捕获，不需经过洗脱或复杂的处理流程，即可直接用于癌细胞培养，或DNA提取，或体外药物敏感性实验，或PDX模型的建立。

本发明提供的一种磁纳米粒子由Fe₃O₄颗粒和抗原或抗体组成，Fe₃O₄纳米粒子粒径分布仅在11nm～13nm范围，将其标记上细胞，尤其是CTC细胞，在磁场的作用下，实现(癌)细胞的捕获。

本发明提供的一种捕获磁纳米粒子标记细胞的方法，先将磁纳米粒子与含有细胞的样品共混，以使细胞与磁纳米粒子结合而获得具有磁性标记的细胞，将含有具有磁性纳米粒子标记的细胞的样品以每小时2ml～10ml的流速通过截面内径为1mm的毛细管，期间在毛细管的外周施以磁场，以使具有磁性纳米粒子标记的细胞在磁场作用下发生偏转，而受到磁场的吸引，对于样品中未被磁性纳米粒子标记的细胞，则继续通过磁场区，而被样品收集池收集；最后，将毛细管周围的磁场移除，使用中性缓冲溶液将吸附于毛细管壁的具有磁性纳米粒子标记的细胞洗下并收集，即得。

本发明提供的方法，尤其适用于CTC细胞的捕获，提高细胞的捕获效率，缩短捕获时间。

本发明提供的另一种捕获磁纳米粒子标记循环癌细胞的方法，先将磁纳米粒子与含有CTC细胞的样品共混，以使CTC细胞与磁纳米粒子结合而获得具有磁性标记的CTC细胞，将含有具有磁性纳米粒子标记的CTC细胞的样品以每小时2ml～10ml的流速通过截面内径为1mm的毛细管，期间在毛细管的外周施以磁场，以使具有磁性标记的CTC细胞在磁场作用下发生偏转，而受到磁场的吸引，对于被磁性纳米粒子标记的正常细胞的样品，则继续通过磁场区，而被样品收集池收集；最后，将毛细管周围的磁场移除，并用中性缓冲溶液将吸附于毛细管壁的具有磁性纳米粒子标记的CTC细胞洗下并收集，即得。

对于样品收集池的样品，还可采用继续以每小时2ml～10ml的流速通过磁场区的方式，再次捕获其中的被磁性纳米粒子标记的CTC细胞，并收集。根据不同的样品特性，可以按上述方法对样品施以多次捕获，并收集获得具有磁性纳米粒子标记的CTC细胞。

为了利于实施对细胞，尤其是CTC细胞的捕获，本发明提供一种捕获磁纳米粒子标记细胞的装置，包括：

第一容器，其包括第一容腔，以容纳样品和磁性颗粒；

样品收集池，其用于收集捕获后的样品；

样品捕获池，其包括捕获腔道，捕获腔道包括入口和出口，入口与第一容腔连通，出口与样品收集池连通；

磁场发生器，其发出磁场及于捕获腔道。

对于样品浓度或粘度较高，即使施加外力，流速仍较低的样品，可以采用对样品进行稀释的方式增加流速，如：将样品和磁性颗粒混合后，再稀释。为了提高装置的自动化水平，使得经磁性颗粒标记的样品与稀释液共混后再进入样品捕获池。

本发明提供的另一种捕获标记磁性颗粒的细胞的装置，包括：

第一容器，其包括第一容腔，以容纳样品和磁性颗粒；

样品收集池，其用于收集捕获后的样品；

第二容器，其包括第二容腔，以容纳稀释液；

样品捕获池，其包括捕获腔道，捕获腔道包括入口和出口，捕获腔道出口与样品收集池连通；

混合器，其分别与第一容器和入口连通；

磁场发生器，其发出磁场及于捕获腔道。

对于捕获效率不高的样品，先初期的捕获中仍会有目的细胞进入样品收集池，而需要将样品收集池中的收集液，再次进行捕获。为了获取捕获后的细胞，也便于控制更换样品捕获池而造成的样品污染，在样品捕获池与样品收集池之间的流路上设置分流器。

本发明提供的另一种捕获标记磁性颗粒的细胞的装置，包括：

第一容器，其包括第一容腔，以容纳样品和磁性颗粒；

样品收集池，其用于收集捕获后的样品；

第二容器，其包括第二容腔，以容纳稀释液；

样品捕获池，其包括捕获腔道，捕获腔道包括入口和出口；

分流器，其分别与样品收集池和出口连通；

混合器，其分别与第一容器和入口连通；

磁场发生器，其发出磁场及于捕获腔道。

本发明的混合器，还与第二容器连通。

本发明的分流器，还包括第二分流出口，用于收集所捕获的经磁性颗粒标记的样品(如：经磁性颗粒标记的细胞、细菌，或其它病原体)。

为便于各个部件的连接，本发明的装置，还包括鲁尔管，分别与第一容器和混合器连接，以及第二容器和混合器连接，或者样品收集池与分流器连接。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的纳米磁颗粒捕获癌细胞的方法，能对细胞，尤其是循环癌细胞实现快速捕获(单一样本单次捕获时间小于40分钟)，实施更简便，易于操作，通用性强。

本发明的磁纳米颗粒，其尺度属于纳米级，且粒径均一，具有极快的反应动力学特性，可以在5～10分钟内即可实现在细胞(尤其是循环癌细胞)的标记。同时该磁粒子具有较好的 生物相容性，标记细胞后不需化学洗脱过程，即可直接用于后续的生物学检测，如：可实现对循环癌细胞的生物学研究及高灵敏检测，进而为CTC捕获的后续应用提供良好的前期基础，并在生物检测和分析应用领域具有一定的优势和潜能，如：免疫染色鉴定、更便捷的癌细胞培养、利于体外药物敏感性实验的开展、核酸提取和扩增，以及PDX模型构建。在这些后续的生物学应用中，标记于循环癌细胞表面的磁粒子无需洗脱过程，不会对后续的应用产生毒副作用。

为了更便于实施本发明提供的捕获方法，本发明提供的捕获磁性纳米粒子标记的细胞的装置，适用于捕获磁性纳米粒子标记的细胞，采用实验室常见的器具即可实现自行组装，成本低廉，捕获速度快，使用方便，随用随装。

本发明提供的捕获装置除可用于磁循环癌细胞的捕获外，还可用于病原性细菌、真菌、病毒体、噬菌体和外泌体等相关物质的捕获。除可用于患者来源的血液及体液中相关物质的捕获，还可用于体外培养物中相关物质的高效捕获。

附图说明

图1为本发明制得的磁纳米颗粒的表征结果，其中A图和D图分别显示磁纳米颗粒透射电镜及粒径分布图，B图和E图分别为经超声相转移后的磁纳米颗粒透射电镜及粒径分布图，C图和F图分别为抗体功能化后磁纳米粒子透射电镜及粒径分布图；

图2为本发明捕获磁性粒子标记的细胞的装置的一实施例结构示意图；

图3为本发明捕获磁性粒子标记的细胞的装置的另一实施例结构示意图；

图4为使用本发明磁纳米粒子所标记的癌细胞实施捕获的原理示意图；

图5为实验室中实施本发明捕获磁粒子标记的外周血循环癌细胞的装置一实施例的结构示意图；

图6为使用本发明磁纳米粒子对胃癌细胞MGC-803进行标记并在PBS溶液中实施捕获的实时显微镜图像；

图7为使用本发明磁纳米粒子对胃癌患者外周血循环癌细胞进行标记并实施捕获后，培养7天不同患者癌细胞数量差异；

图8为捕获后的癌细胞进行免疫荧光染色的结果示意图；

图9为将捕获后的胃癌患者外周血循环癌细胞进行动物PDX模型构建结果。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1

在无机相(水相)中合成磁粒子的优点是：在室温条件下即可合成，合成后可直接用于体内外生物学检测，不需相转移的过程；其缺点是：合成的磁粒子稳定性较差(团聚现象明显)，形貌不一(多为不规则形，且形状和大小不均，粒径分布宽泛)。因此，水相合成的磁粒子应用受限，但其磁饱和强度同样可达80emu/g左右。

在有机相(油相)中合成磁颗粒的优点是：粒径和形貌非常统一，粒径变异范围非常小，且稳定性非常好(室温下油相中可稳定很多年不沉降，不团聚)，磁饱和强度可高达90～100emu/g。缺点是：合成时需要高温(200℃～300℃)，合成后的颗粒不溶于水，不能直接用于生物学检测，因此需要从有机相转移至无机相的过程。

因此，本实施例参照文献Nat.Mater.,2004,3(12),891～895在有机相中合成磁纳米颗粒，即使用油酸钠为配体，先与FeCl₃反应生成油酸铁，再经高温(220℃)合成脂溶性Fe₃O₄磁纳米颗粒，如图1A所示。产物与去离子水混合超声后经磁分离，将制得的Fe₃O₄磁纳米颗粒转移至水相，获得表面羧基化的水溶性11nm～13nm磁纳米颗粒，从而赋予磁纳米粒子与抗体结合的能力，如图1B所示。

将5μl浓度为10mg/ml的单克隆抗体(Her2或EpCAM或CD44或其他抗体)加入至5ml上述制得的水溶性磁颗粒溶液中，按标准的EDC-NHS化学反应，将抗体偶联至磁纳米颗粒的表面，经分子量300KD的超滤管超滤后，即得抗体功能化磁纳米粒子，如图1C所示。

实施例2

图2为本发明捕获磁纳米粒子标记细胞的装置的一实施例结构示意图。如图2所示，本实施例装置包括第一容器100和样品收集池200。第一容器100包括第一容腔(未示出)，以容纳样品和磁性颗粒。样品收集池200用于收集捕获后的样品。样品捕获池300其包括捕获腔道310，捕获腔道包括入口311和出口312，入口311与第一容腔连通，出口312与样品收集池连通。磁场发生器400(如：铷铁磁棒)设置于捕获腔道310的外周，其发出磁场作用于捕获腔道310，使被磁性纳米颗粒标记的样品受磁场的吸附而发生偏转，而未被磁性纳米粒子标记的样品不发生偏转而进入样品收集池200(如图3)。

为便于本实施例提供的装置也适用于流速较低样品，以及提供自动化水平，本实施例还提供另一种装置。图4为本发明捕获磁性粒子标记的细胞的装置的一实施例结构示意图。如图4所示，本实施例装置包括第一容器100、第二容器500和样品收集池200。第一容器100包括第一容腔，以容纳样品和磁性颗粒。第二容器500包括第二容腔(未示出)，以容纳缓冲液或稀释液。

样品收集池200用于收集捕获后的样品。样品捕获池300其包括捕获腔道310，捕获腔道包括入口311和出口312，出口312与样品收集池200连通。混合器700分别与第一容器100、第二容器500和入口311连通。磁场发生器400(如：铷铁磁棒)设置于捕获腔道310的外周，其发出磁场作用于捕获腔道310，使被磁性纳米颗粒标记的样品受磁场的吸附而发生偏转，而未被磁性纳米颗粒标记的样品不发生偏转而进入样品收集池200(如图3)。

对于捕获效率不高的样品，经初次的捕获后，未被捕获的目的细胞仍会进入样品 捕获池200，可以将样品收集池200中的样品再次通过入口311进行第二次捕获。为了避免便于更换样品捕获池而造成的样品污染，在样品捕获池与样品收集池之间的流路上设置分流器800，其分别与样品收集200和出口312连通，还包括第二分流出口830，用于收集经磁性粒子标记的细胞。

实施例3外周血胃癌细胞的捕获方法

磁性纳米粒子的制备及抗体功能化如实施例1所述，采用如实施例2所述的捕获装置，并详见图5。

本实施例所用抗体为人源化Her2抗体。①取疑似胃癌患者静脉血5ml，肝素(15U/ml)充分抗凝；②在抗凝血中加入500μl抗体功能化磁纳米粒子，颠倒混匀，室温条件下静置5分钟；③将上述样品抽入10ml注射器A中，置自动输液泵固定，设定流速为8ml/小时；④同时取另一注射器B，抽入10ml缓冲液；⑤注射器A、B经过鲁尔管1、三通管2、硅胶管3连接至磁捕获毛细管4部分；⑥毛细管另一端使用同样的方法连接在接收注射器C和废液收集池；⑦紧靠毛细管放置铷铁磁棒5，关闭液体开关c，启动输液泵；⑧样品和缓冲液流经磁捕获毛细管部分，样品中癌细胞停留在捕获毛细管内壁表面，正常未被标记的血细胞流入废液收集器中。⑨根据显微镜下观察循环癌细胞的纯度和数量，在注射器B中抽入2～3ml缓冲液尽一步洗涤，以收获纯度更高的癌细胞(参见图6，如果镜下见较多红细胞粘附或含有较多正常血液细胞，本步骤可选择性使用)；⑩捕获结束，在注射器B中加入新的缓冲液2～3ml，移除铷铁磁棒，关闭液体开关d，开启输液泵，将捕获毛细管中癌细胞经管道系统洗脱至收集注射器C。

实施例4捕获循环胃癌细胞的体外培养

将实施例3中捕获的循环癌细胞加入培养基中，培养基系含有10％胎牛血清和1％青链霉素的高糖DMEM。每天全量换液，培养扩增至第7天，0.25％胰酶消化后进行细胞计数。如图7所示，8位胃癌患者外周血循环癌细胞捕获并培养后的计数结果，其中患者1的外周血循环癌细胞经捕获和培养7天后为320个，而患者5的外周血循环癌细胞经捕获和培养7天后为1.28×10⁴个。由此，本实施例的方法可有效捕获胃癌患者外周血循环癌细胞，并可进行后续体外培养。

实施例5循环癌细胞的免疫染色鉴定

取实施例3中捕获的循环癌细胞，加入4％多聚甲醛溶液中悬浮，室温固定10分钟，0.1％Triton-X100室温透膜10分钟，加入1％牛血清白蛋白室温封闭30分钟。加入PE标记的Her2抗体和FITC标记的抗白细胞共同抗原CD45抗体，37℃条件下孵育30分钟，再次磁分选并将细胞重悬于100μl缓冲液中，加入DAPI染料进行核染，吸出部分细胞置载玻片，加盖玻片后封片，荧光显微镜下检查。

图8为实施例3中捕获的循环癌细胞免疫染色后的激光共聚焦图片，循环癌细胞表面的抗原可被PE-Her2标记成红色，而极少量正常白细胞被FITC-CD45标记成绿色，经图片叠加后可见捕获细胞团中含大量红色循环癌细胞，由此，本实施例方法捕获的循环癌细胞可用于后续的免疫染色鉴定。

实施例6循环癌细胞的PDX模型构建

实施例4中经培养后的循环癌细胞，消化收获后重悬于100μl DMEM培养基中，抽入1ml疫苗注射器；裸鼠皮肤表面碘酒、酒精消毒，将培养后的循环癌细胞快速注入皮下，形成直径约4mm小皮丘，稍按压止血后，裸鼠正常饲养4～6周，每周游标卡尺测定皮下瘤的长直径a和短直径b(参见图9)，可按下式计算皮下瘤体积，绘制时间-肿瘤体积曲线：

皮下肿瘤体积(mm³)＝(a×b²)/2